Name: 现场验尸狂犬病快速免疫性诊断测试资源有限设置与进一步分子应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学习使用快速免疫层析诊断试剂盒进行动物狂犬病死后诊断的方法，包括脑干采样、结果判读及病毒基因分型应用。该方法适用于资源有限的现场环境，灵敏度和特异性均超过95%。

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本工作得到了全球疫苗与免疫联盟（GAVI）、Wolfermann Nägeli基金会、瑞士非洲研究合作组织（SARECO）、SWF科学研究基金会、巴塞尔志愿学术协会（FAG）、瑞士与亚洲双边科学技术合作计划以及诺华生物医学研究基金会的支持。
我们特别感谢犬只主人、兽医人员以及实验室工作人员的大力支持与投入。同时，我们感谢 Lisa Crump 在语言编辑方面所做的工作。

1. 经枕骨大孔（枕骨入路）采集样本25
注意：该技术可在实验室条件或野外现场实施。样本应在疑似动物死亡后尽快处理，或保存在低温环境（如可能，冷藏或冷冻）中，以避免腐败，因为腐败可能影响检测结果。与其他基于狂犬病病毒抗原检测的参考技术（如 DFAT 和 DRIT）类似，不应检测已腐败的样本，因其可能影响结果（存在假阴性结果的风险）。
警告：所有样本均应被视为具有潜在传染性。即使在野外环境下，也必须严格遵守安全规定和操作程序4。特别是应穿戴适当的个人防护装备，包括口罩、护目镜、手套和实验服。使用适当的消毒剂对材料和样本进行去污处理（例如，按照制造商推荐稀释比例的次氯酸钠溶液、70%酒精（乙醇或异丙醇）、1%肥皂水溶液）。所有接触样本的人员均应接种狂犬病疫苗。
<ol>
	<li>使用刀具在第一颈椎（寰椎）前方切除动物头部，以暴露枕骨大孔。 
	注意：为尽量减少感染性气溶胶的产生，避免使用手动锯或其他类似工具。</li>
	<li>使用一次性塑料移液管（图2A）、吸管（图2B）、钳子（图2C）或滴管（随快速免疫检测工具包RIDT提供）（图2D）采集脑干（延髓）样本。 
	注意：采样过程需格外谨慎，因为这是确保检测结果可靠性的最关键步骤。除配套视频中以简明方式展示如何采集目标脑干区域外，强烈建议进行培训操作，以确保准确获取正确的解剖部位。</li>
	<li>可选步骤：除脑干（延髓）外，还可通过相同的枕骨入路，将塑料移液管或吸管轻柔推进并旋转至眼眶方向，采集脑干其他区域或脑组织其他部分（小脑、海马、丘脑和大脑皮层）（图3）。</li>
	<li>若使用吸管或移液管，应轻轻挤压以将脑组织样本（0.5–2 g）转移至试管中，用于后续分析和/或生物样本保存。 
	注意：不建议将样本保存于甘油中，因其可能影响快速免疫检测（RIDT）中的毛细管流动或抗体结合步骤18。</li>
</ol>
2. 改良RIDT方案的实施14
注意：此修改省略了制造商方案（所有版本）中规定的在 PBS 中进行 1:10 稀释的步骤，可在实验室或现场条件下实施。
<ol>
	<li>使用拭子或滴管采集相当于半颗花生或豌豆大小（0.1–0.5 g）的脑组织样本，并将其放入缓冲液样本管中。 
	注意：在改良后的操作流程中，所有试剂和耗材均包含在试剂盒内（无需 PBS 或额外的试管）（图4）。请记录试剂盒的批号，并核对有效期是否有效。</li>
	<li>在管内直接用拭子或滴管小心研磨脑组织约 30 秒，直至形成均匀的悬液。 
	注意：根据制造商的操作说明，缓冲液反应可在该条件下灭活病毒的感染性24。</li>
	<li>使用滴管将四滴（约 100 µL）悬液加入检测装置的加样孔中。</li>
	<li>加样后等待样本完全迁移（1–5 分钟），再读取检测结果。样本加入后应迅速开始迁移（1–5 分钟内）。</li>
	<li>若出现延迟（由于悬液黏度过高）或需加速迁移起始，可用滴管轻轻刮擦装置加样位点底部 1–5 次，必要时再添加 1–2 滴悬液。迁移应随即立即开始。</li>
	<li>在样本迁移结束后 5–10 分钟内读取检测窗口的结果，最迟不得超过 20 分钟。</li>
	<li>根据检测窗口中质控线（C线）和检测线（T线）（紫色线条）的有无来判读结果，参见 图5。当两条线均可见时判为阳性（图5A）；仅 C 线可见时为阴性（图5B）；仅 T 线可见或无任何线条可见时为无效结果（图5C）。 
	注意：无效结果应至少重复一次检测。若结果仍无效，则需采用其他技术进行检测。RIDT 获得的阴性结果需通过金标准参考方法（如 DFAT、DRIT 或分子检测方法，包括聚合酶链式反应 PCR）进行后续确认。尽管本检测方法的灵敏度较高（见代表性结果），但并非达到 100%。</li>
	<li>使用过的检测装置可于室温保存，或在条件允许时冷藏或冷冻，以备后续分子分析（见第 4 节）。剩余的样本悬液应连同缓冲液管一起在 -20 °C 或 -80 °C 冷冻保存，以便必要时重复检测或进行后续分子分析。</li>
</ol>
3. 从RIDT装置中提取RNA并通过RT-qPCR进行检测
注意：此步骤只能在具备适应性环境和适合分子诊断设备的实验室条件下进行。可在快速免疫层析检测（RIDT）完成后立即进行，或对存放在室温（15–30 °C）、冷藏或冷冻条件下的存档RIDT装置进行回顾性检测。
<ol>
	<li>RNA 提取 
	注意：为了监测提取步骤，建议使用内参对照，该内参可以是内源性 mRNA（例如 ß-actin），也可以是外源性对照（例如在提取的最初步骤中直接加入样本的 eGFP 合成 RNA）26,27。
	<ol>
		<li>小心打开装置，取出滤纸。</li>
		<li>剪下样本的沉积区域，并将其放入含有 1 mL Tri-Reagent LS 的离心管中。在室温下孵育 1 小时，期间轻柔地定期手动振荡。</li>
		<li>按照制造商推荐的方法进行提取，如先前所述27。在此步骤中可加入外源性内参对照。</li>
		<li>根据制造商建议，在过程中加入 2 µL 甘油原，以促进 RNA 沉淀。</li>
		<li>用无核酸酶水重悬 RNA，最终体积通常为 50 µL。 
		注意：在加入 200 µL 氯仿至 Tri-Reagent LS 后，进行离心分离水相和有机相的步骤结束时，装置中的膜片将位于管底，不会干扰上层水相的收集。此外，也可使用其他简便快速的提取方案，例如基于苯酚试剂和硅胶膜的方法28。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 RT-qPCR 检测26 
	注意：可采用多种分子生物学技术检测提取样本中可能存在的病毒 RNA，例如逆转录 PCR、常规（终点）PCR 或实时定量 PCR（qPCR）。已有多种可用方法，如常规 RT-PCR27,29 或靶向病毒核蛋白或聚合酶基因的 RT-qPCR26,30。下文将介绍一种基于双重联合泛丽沙病毒 RT-qPCR 的示例方法，该方法靶向病毒聚合酶基因中的保守区域。该 RT-qPCR 技术结合了两种不同的 RT-qPCR：一种基于 TaqMan 探针技术（pan-RABV RT-qPCR），另一种使用 SyBR Green 检测（pan-lyssa RT-qPCR）。此外，通过特异性的 TaqMan 探针 RT-qPCR（eGFP RT-qPCR）检测在提取过程中直接添加的外源性内参对照（eGFP RNA）。对所选用于病毒 RNA 检测的分子技术进行现场严格验证非常重要，特别是需确认引物和实时 RT-PCR 的探针是否适用于目标区域流行毒株的检测4。
	<ol>
		<li>将 RNA 样本用无核酸酶水稀释至 1:10。每个 RNA 样本设两个复孔，在 96 孔反应板或其他格式中进行检测。每次实验均需设置阳性和阴性对照，且至少设两个重复。</li>
		<li>根据 表 1 配制三种不同 RT-qPCR 检测的预混液，并使用 表 2 中列出的引物/探针。</li>
		<li>向三种不同的检测体系中分别加入 5 µL 稀释后的 RNA 样本和 15 µL 预混液。pan-RABV RT-qPCR 检测和 eGFP RT-qPCR 检测可在同一块板上运行。</li>
		<li>按照 表 3 所示的热循环条件运行各项检测。若仅有一台 PCR 仪，应先运行 pan-RABV RT-qPCR，并将 pan-lyssa RT-qPCR 的反应板置于 4 °C 保存，直至 pan-RABV RT-qPCR 结束。</li>
		<li>根据 表 4 分析三种检测的结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 从RIDT装置中提取RNA后的基因分型
<ol>
	<li>反转录 RT27,29
	<ol>
		<li>配制总反应体系为 10 µL 的主混合液，包含 6 µL RNA、2 µL pd(N)6 随机引物（200 µg/µL）和 2 µL 无核酸酶水。</li>
		<li>在加热块中于 65 °C 孵育 10 分钟，随后置于冰上保存。</li>
		<li>配制另一主混合液，每份样品终体积为 20 µL，包含 6 µL 5x 第一链缓冲液、2 µL 0.1 M 二硫苏糖醇（DTT）、1 µL（200 U）Superscript II 逆转录酶、2 µL（80 U）RNasin、2 µL dNTP 混合液（10 µM），并用无核酸酶水补足体积。</li>
		<li>将主混合液（20 µL）加入样品（10 µL）中，终体积为 30 µL，在加热块中于 42 °C 孵育 90 分钟。</li>
		<li>随后进行 PCR 扩增，或将 cDNA 储存于 -20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>常规 PCR27,29,31 
	注意：目前有多种常规 PCR 技术可用于基因分型。本文介绍两种方法，均为针对丽沙病毒核蛋白或病毒蛋白部分区域的半巢式 PCR。除引物和扩增条件外，两种检测的实验流程相同。每次 PCR 实验均应包含阳性对照（阳性 RNA）和阴性对照（阴性 cDNA 和/或无核酸酶水），且每轮扩增均需设置对照。
	<ol>
		<li>为每个样品在 0.2 mL 微量离心管中配制第一轮 PCR 反应的主混合液。该混合液包含 5 µL 10x NH4 反应缓冲液、2.5 µL MgCl2 溶液（50 mM）、1 µL dNTP 混合液（10 µM）、每种引物各 1 µL（10 µM）、0.2 µL（1 U）Biotaq DNA 聚合酶以及 37.3 µL 无核酸酶水，终体积为 48 µL。引物序列见表 5。</li>
		<li>向每管中加入 2 µL cDNA，并根据表 6所示条件，在各自独立的常规 PCR 热循环仪中进行扩增。</li>
		<li>使用相应的引物（见表 5），配制与前一步相同的第二轮主混合液，用于半巢式 PCR 反应。</li>
		<li>加入 2 µL 第一轮 PCR 产物，并使用表 6中指定的循环参数，在常规 PCR 热循环仪中进行扩增。</li>
		<li>将第一轮和第二轮 PCR 产物分别上样至含溴化乙锭（终浓度约 0.01%）的 1% 琼脂糖凝胶（100 mL 1x TAE 缓冲液），在 120 V 电压下电泳 30 分钟，观察结果。阳性 PCR 结果表现为预期大小的明亮条带（见表 5）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sanger 测序
	<ol>
		<li>对使用泛丽沙病毒半巢式 PCR 获得的扩增子进行 Sanger 测序，完成基因分型分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hampson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction%3A+Estimating+the+Global+Burden+of+Endemic+Canine+Rabies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Correction: Estimating the Global Burden of Endemic Canine Rabies.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), e0003786(2015).</li>
<li>Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssaviruses+and+rabies%3A+current+conundrums%2C+concerns%2C+contradictions+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies.</a> F1000Research. 6, 184(2017).</li>
<li>Walker, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICTV+Virus+Taxonomy+Profile%3A+Rhabdoviridae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">ICTV Virus Taxonomy Profile: Rhabdoviridae.</a> The Journal of General Virology. 99 (4), 447-448 (2018).</li>
<li>World Health Organization (WHO). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+Expert+Consultation+on+Rabies%2C+third+report%5BTitle%5D)+AND+%22HO+Technical+Report+Series%2C+No.+1012%22%5BJournal%5D)">WHO Expert Consultation on Rabies, third report.</a> HO Technical Report Series, No. 1012. , Geneva. Licence: CC BY-NC-SA 3.0 IGO (2018).</li>
<li>Dacheux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+Accurate+Insight+into+the+Incidence+of+Human+Rabies+in+Developing+Countries+through+Validated+Laboratory+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">More Accurate Insight into the Incidence of Human Rabies in Developing Countries through Validated Laboratory Techniques.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (11), e765(2010).</li>
<li>Welburn, S. C., Beange, I., Ducrotoy, M. J., Okello, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neglected+Zoonoses+-+The+Case+for+Integrated+Control+and+Advocacy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%3A+The+Official+Publication+of+the+European+Society+of+Clinical+Microbiology+and+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The Neglected Zoonoses - The Case for Integrated Control and Advocacy.</a> Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. , (2015).</li>
<li>Dacheux, L., Bourhy, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+tests+for+human+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Revue+Scientifique+Et+Technique+%28International+Office+of+Epizootics%29%22%5BJournal%5D)">Diagnostic tests for human rabies.</a> Revue Scientifique Et Technique (International Office of Epizootics). 37 (2), 581-593 (2018).</li>
<li>World Organisation for Animal Health. OIE Terrestrial Manual - Rabies (Infection with rabies virus and other Lyssaviruses). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. , http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf (2018).</li>
<li>Kasempimolporn, S., Saengseesom, W., Lumlertdacha, B., Sitprija, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+rabies+virus+antigen+in+dog+saliva+using+a+latex+agglutination+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of rabies virus antigen in dog saliva using a latex agglutination test.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 3098-3099 (2000).</li>
<li>Kang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+rapid+immunodiagnostic+test+kit+for+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a rapid immunodiagnostic test kit for rabies virus.</a> Journal of Virological Methods. 145 (1), 30-36 (2007).</li>
<li>Nishizono, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+immunochromatographic+test+kit+for+rabies+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid immunochromatographic test kit for rabies diagnosis.</a> Microbiology and Immunology. 52 (4), 243-249 (2008).</li>
<li>Kasempimolporn, S., Saengseesom, W., Huadsakul, S., Boonchang, S., Sitprija, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+rapid+immunochromatographic+test+strip+for+detection+of+Rabies+virus+in+dog+saliva+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%3A+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Veterinary+Laboratory+Diagnosticians%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a rapid immunochromatographic test strip for detection of Rabies virus in dog saliva samples.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 23 (6), 1197-1201 (2011).</li>
<li>Ahmed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+monoclonal+antibody-based+rapid+immunochromatographic+test+for+direct+detection+of+rabies+virus+in+the+brain+of+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a monoclonal antibody-based rapid immunochromatographic test for direct detection of rabies virus in the brain of humans and animals.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 86 (4), 736-740 (2012).</li>
<li>Léchenne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Rapid+Rabies+Diagnostic+Tool+for+Field+Surveillance+in+Developing+Countries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Validation of a Rapid Rabies Diagnostic Tool for Field Surveillance in Developing Countries.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), e0005010(2016).</li>
<li>Yang, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+diagnostic+methods+for+detecting+rabies+viruses+circulating+in+Korea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Comparison of four diagnostic methods for detecting rabies viruses circulating in Korea.</a> Journal of Veterinary Science. 13 (1), 43-48 (2012).</li>
<li>Markotter, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+rapid+immunodiagnostic+test+kit+for+detection+of+African+lyssaviruses+from+brain+material%5BTitle%5D)+AND+%22The+Onderstepoort+Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a rapid immunodiagnostic test kit for detection of African lyssaviruses from brain material.</a> The Onderstepoort Journal of Veterinary Research. 76 (2), 257-262 (2009).</li>
<li>Reta, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Rapid+Immunodiagnostic+Test+for+Rabies+Diagnosis+Using+Clinical+Brain+Samples+in+Ethiopia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Science+%26+Medical+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Rapid Immunodiagnostic Test for Rabies Diagnosis Using Clinical Brain Samples in Ethiopia.</a> Journal of Veterinary Science & Medical Diagnosis. 2 (3), 1-3 (2013).</li>
<li>Servat, A., Picard-Meyer, E., Robardet, E., Muzniece, Z., Must, K., Cliquet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+Rapid+Immunochromatographic+Diagnostic+Test+for+the+detection+of+rabies+from+brain+material+of+European+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%3A+Journal+of+the+International+Association+of+Biological+Standardization%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for the detection of rabies from brain material of European mammals.</a> Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 40 (1), 61-66 (2012).</li>
<li>Certoma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+a+Rabies+Virus+Rapid+Diagnostic+Test+for+the+Detection+of+Australian+Bat+Lyssavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Medicine+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Assessment of a Rabies Virus Rapid Diagnostic Test for the Detection of Australian Bat Lyssavirus.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 3 (4), (2018).</li>
<li>Ahmad, A., Singh, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+rapid+immunodiagnosis+assay+kit+with+molecular+and+immunopathological+approaches+for+diagnosis+of+rabies+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+World%22%5BJournal%5D)">Comparison of rapid immunodiagnosis assay kit with molecular and immunopathological approaches for diagnosis of rabies in cattle.</a> Veterinary World. 9 (1), 107-112 (2016).</li>
<li>Sharma, P., Singh, C. K., Narang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immunochromatographic+diagnostic+test+with+Hheminested+Reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+rabies+virus+from+brain+samples+of+various+species%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+World%22%5BJournal%5D)">Comparison of immunochromatographic diagnostic test with Hheminested Reverse transcriptase polymerase chain reaction for detection of rabies virus from brain samples of various species.</a> Veterinary World. 8 (2), 135-138 (2015).</li>
<li>Voehl, K. M., Saturday, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+rapid+immunodiagnostic+rabies+field+surveillance+test+on+samples+collected+from+military+operations+in+Africa%2C+Europe%2C+and+the+Middle+East%5BTitle%5D)+AND+%22U.S.+Army+Medical+Department+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a rapid immunodiagnostic rabies field surveillance test on samples collected from military operations in Africa, Europe, and the Middle East.</a> U.S. Army Medical Department Journal. , 27-32 (2014).</li>
<li>Servat, A., Robardet, E., Cliquet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inter-laboratory+comparison+to+evaluate+the+technical+performance+of+rabies+diagnosis+lateral+flow+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">An inter-laboratory comparison to evaluate the technical performance of rabies diagnosis lateral flow assays.</a> Journal of Virological Methods. 272, 113702(2019).</li>
<li>Eggerbauer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Six+Commercially+Available+Rapid+Immunochromatographic+Tests+for+the+Diagnosis+of+Rabies+in+Brain+Material%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Six Commercially Available Rapid Immunochromatographic Tests for the Diagnosis of Rabies in Brain Material.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (6), e0004776(2016).</li>
<li>Barrat, J. Simple technique for the collection and shipment of brain specimens for rabies diagnosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarrat%2C+J+%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , World Health Organization. 425-432 (1996).</li>
<li>Dacheux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Combined+Real-Time+Reverse+Transcription+Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+the+Diagnosis+of+Lyssavirus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Dual Combined Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Assay for the Diagnosis of Lyssavirus Infection.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), e0004812(2016).</li>
<li>Dacheux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+diagnosis+of+human+rabies+based+on+analysis+of+skin+biopsy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%3A+An+Official+Publication+of+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">A reliable diagnosis of human rabies based on analysis of skin biopsy specimens.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 47 (11), 1410-1417 (2008).</li>
<li>Application of next generation sequencing to rabies virus and other lyssaviruses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. Rupprecht, C., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. 2, World Health Organization. 49-61 (2019).</li>
<li>Conventional pan-lyssavirus reverse transcriptase polymerase chain reaction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. Rupprecht, C., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. 2, World Health Organization. 1-16 (2019).</li>
<li>Rabies real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. Rupprecht, C., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. 2, World Health Organization. 17-34 (2019).</li>
<li>Talbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+history+and+dynamics+of+dog+rabies+virus+in+western+and+central+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary history and dynamics of dog rabies virus in western and central Africa.</a> The Journal of General Virology. 90 (Pt 4), 783-791 (2009).</li>
<li>McElhinney, L. M., Marston, D. A., Brookes, S. M., Fooks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+carcase+decomposition+on+rabies+virus+infectivity+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Effects of carcase decomposition on rabies virus infectivity and detection.</a> Journal of Virological Methods. 207, 110-113 (2014).</li>
<li>Vigilato, M. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+eliminating+canine+rabies%3A+policies+and+perspectives+from+Latin+America+and+the+Caribbean%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Progress towards eliminating canine rabies: policies and perspectives from Latin America and the Caribbean.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 368 (1623), 20120143(2013).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

RIDT 是一种简单、快速且低成本的狂犬病死后诊断方法，有望成为实验室检测的一种现场替代方案。在中低收入国家的分散化地区应用此类检测，将有助于深入了解狂犬病病毒在地方乃至全国范围内的流行与传播情况。当该方法与快速脑组织样本采集技术（无需完整尸检）结合使用时，其显著优势在于整个检测过程均可在远离实验室设施的野外环境中完成。通过枕骨大孔采集的脑组织样本即可用于检测，因此无需完全打开动物颅骨。该检测操作和判读简便，特别适用于野外监测工作14。与 DFAT 或 DRIT 相比，RIDT 的其他优势还包括无需设置阳性和阴性对照，试剂盒可在室温下保存。此外，在改良后的操作流程中省去了磷酸盐缓冲液（PBS）1:10 稀释步骤，无需额外试剂，进一步简化了野外条件下的操作流程。
关键在于脑组织样本的质量。应在疑似动物死亡后尽快采集并检测样本，或在检测前将样本保存在低温环境中，以避免降解。不应对已分解的样本进行检测，因为这可能影响检测结果（存在假阴性结果的风险）。尽管目前尚无关于脑组织样本在不同时间下快速免疫检测法（RIDT）敏感性下降的数据，但我们推测其情况与直接荧光抗体检测法（DFAT）相似32。然而，由于该检测可在现场快速直接完成，动物死亡至实施检测之间的时间可显著缩短，因此总体而言，样本发生分解的风险较低。
该方案中的另一个关键步骤是样品悬液的迁移。迁移应在样品加入后立即开始（1-5 分钟内）。因此，悬液黏度过高可能会对迁移产生不利影响。通常用滴管轻轻刮擦装置加样位置的底部，并再添加 1-2 滴液体即可解决此问题，迁移会在操作后立即开始。
非洲实验室（乍得、科特迪瓦和马里）进行的大多数RIDT检测均在环境温度超过30 °C的条件下完成，而制造商推荐的储存和使用温度范围为15 °C至30 °C。尽管我们尚未发现高温对RIDT检测性能产生明显影响，但仍需对其进行更深入的评估。同样，在检测后用于病毒RNA检测和基因分型的设备在储存和运输过程中经历高温的影响，也需要进一步评估。通过RT-qPCR从RIDT试纸条中检测病毒RNA的灵敏度，可能受到最初用于检测的脑组织样本质量的影响，也可能受到检测后RIDT试纸条储存条件的影响。例如，使用过的RIDT试纸条在受控的实验室条件下储存时，RNA检测的灵敏度更高（94.7%），而在实地条件（如乍得）下储存时则较低（81.2%）14。这些条件还可能影响固定在试纸条上的RNA的完整性（尤其是长度），这或许可以解释基于较长PCR扩增子（例如&#62;500个核苷酸）进行基因分型时灵敏度中等的原因14。在试纸条上进行的RT-qPCR检测灵敏度低于使用FTA Whatman卡片所获得的结果（80.6%）14。与其他分子检测技术类似，病毒载量也可能影响基于RIDT试纸条进行基因分型的成功率，病毒载量较低的样本可能出现阴性结果14。
目前，世界卫生组织（WHO）和世界动物卫生组织（OIE）均未推荐将该检测用于常规诊断和疾病监测，检测结果不能单独用于指导暴露后预防（PEP）的决策。仍需进一步开展检测方法的验证工作。然而，准确快速的狂犬病诊断是高效持续狂犬病监测系统的关键组成部分，有助于提升政府层面的重视程度，这对于成功实现狂犬病的可持续控制至关重要33。在此背景下，RIDT检测为狂犬病诊断提供了新的机遇，是在低收入或中等收入的疫区现场扩大动物狂犬病监测的有用工具。

犬狂犬病是人类狂犬病的主要病因，全球每年约导致59,000例人类死亡，几乎全部发生在亚洲和非洲的低收入和中等收入国家（LMICs）1。主要的病原体是一种嗜神经性的与犬类相关的经典狂犬病病毒（RABV，弹状病毒科 Rhabdoviridae，丽沙病毒属 Lyssavirus，种名为狂犬病丽沙病毒 Rabies lyssavirus）。然而，其他与狂犬病相关的丽沙病毒，主要在蝙蝠物种中传播，也可引起疾病2,3。在受影响地区，疾病监测和控制常常因政治层面投入不足而受阻，这可能源于可靠数据的缺乏4,5,6。疾病漏报的原因之一是缺乏实验室诊断，部分原因是难以获得配备完善的实验室和经过培训的技术人员，以及样本运输困难。实验室诊断对于确诊狂犬病病例至关重要，同时还能对涉及的病毒株进行遗传学表征，从而深入了解病毒在区域范围内的传播情况4,5,7。
目前，世界卫生组织（WHO）和世界动物卫生组织（OIE）批准的狂犬病死后诊断金标准包括直接荧光抗体试验（DFAT）、直接快速免疫组织化学试验（DRIT）以及分子学方法（例如逆转录聚合酶链反应（RT-PCR））4,8。然而，由于低收入和中等收入国家（LMICs）普遍存在实验室设施不足、电力供应不稳定、样本运输缺乏冷藏条件以及缺乏质量管理体系等问题，这些方法的规范应用仍受到限制。由于动物狂犬病诊断通常仅在LMICs的中央兽医实验室进行，现有的监测数据主要反映的是城市地区的狂犬病流行状况。
近年来开发的低技术诊断替代方法为在偏远地区和分散的狂犬病实验室建立狂犬病诊断提供了机会4,8,9。快速免疫层析诊断试验（RIDT）是一种基于免疫层析技术的侧向流动检测方法，利用金标检测抗体，是一种极具前景的狂犬病诊断工具10,11,12,13。其原理十分简单：将脑组织样本稀释后与提供的缓冲液混合，取数滴加样至试纸条上，金标单克隆抗体将特异性结合狂犬病抗原，主要是核蛋白（图1）。抗原-抗体复合物随后发生侧向流动，在检测线（T线）处与固定的抗狂犬病抗原抗体结合，形成一条清晰可见的紫色线条。未与狂犬病抗原结合的剩余金标抗体继续迁移，并通过额外的靶向抗体固定于膜上，形成一条清晰可见的紫色质控线（C线）。
这种一步法、低成本的方法快速、极为简便，且无需昂贵的设备或特殊的储存条件。通过修改生产商的操作规程以省去稀释步骤后，进行检测所需的几乎所有设备和试剂均已包含在试剂盒中14。结果可在5至10分钟内读取，无需使用显微镜。这相较于DFAT检测具有显著优势，后者需要荧光显微镜和免疫荧光结合物，以及冷藏运输和样本储存条件。即使是可在光学显微镜下进行的DRIT检测，也需要持续的冷链来保存抗狂犬病抗体，而这些抗体目前尚未商业化供应。与DRIT相比，RIDT无需使用有毒化学物质，这一特点在废物处理监管不严的国家尤为有利。相较于金标准检测方法DFAT和DRIT，该快速检测耗时更短，结果判读更为简便，因而可由技术经验有限的人员在现场实施检测。
根据这些检测特性，可在偏远地区对疑似动物进行快速诊断，从而尽早为暴露者实施暴露后预防（PEP）。此外，无需远距离运送狂犬病样本，有助于在检测时保持更好的样本质量。然而，目前RIDT检测获得的结果应使用参考诊断方法（如DFAT或DRIT）进行确认。
已对用于检测狂犬病病毒（RABV）及其他丽沙病毒的RIDT技术进行了评估。其中最早的一项研究由韩国研究人员于2007年开展10。在51份动物样本和4份RABV分离株中，与DFAT方法相比，RIDT的敏感性和特异性分别为91.7%和100%。这些结果随后在来自韩国的110份动物脑组织样本中得到验证，与DFAT相比，其敏感性和特异性分别为95%和98.9%15。最近，其他研究进一步评估了该RIDT在不同地理来源的多种动物病毒分离株和/或感染性脑组织样本中的表现。一个包含非洲RABV及其他非洲丽沙病毒（杜文黑格病毒（DUVV）、拉各斯蝙蝠病毒（LBV）和莫科拉病毒（MOKV））在内的21份样本组被成功检测，与DFAT相比，敏感性达到100%16。在来自埃塞俄比亚的115份脑组织样本组中，也获得了相似的高敏感性（96.5%）和特异性（100%）17。另一项研究评估了欧洲RABV分离株、另外两种欧洲蝙蝠丽沙病毒（欧洲蝙蝠丽沙病毒1型（EBLV-1）和2型（EBLV-2））以及澳大利亚蝙蝠丽沙病毒（ABLV）18。基于对172份动物脑组织样本的分析，该RIDT试剂盒与DFAT相比，敏感性为88.3%，特异性为100%，且成功检出了三种与狂犬病相关的丽沙病毒。在该研究中，部分假阴性结果来源于保存在甘油缓冲液中的脑组织样本，提示甘油去除不当可能影响了毛细流动或抗体结合。最近对43份来自澳大利亚蝙蝠的临床样本的分析进一步证实了此前的检测结果，与DFAT完全一致19。在印度开展的两项研究使用RIDT检测了少量临床样本（分别为11份和34份），与DFAT相比，其敏感性介于85.7%至91.7%之间，特异性为100%20，21。另一项评估研究使用来自非洲、欧洲和中东地区的80份动物脑组织样本，发现该试剂盒在特异性方面与DFAT完全一致（100%），而敏感性（96.9%）高于以往研究22。最近一项在22个不同实验室间开展的RIDT比对研究，采用一组10份样本进行测试，总体一致性达到99.5%23。
最近仅有一项多中心研究显示，RIDT的整体性能不理想24。该研究检测了来自三个不同数据集的样本，与DFAT相比，其敏感性和特异性结果存在差异。例如，在实验室A检测的实验感染动物样本中，第一组（n=51）和第二组（n=31）的敏感性分别为16%和43%，而两组的特异性均为100%。相反，在实验室B分析的第三组野外临床样本（n=30）与DFAT结果完全一致，该结果在实验室A也得到了近乎完全的验证（敏感性为85%，特异性为100%）。研究认为，批间差异可能是导致RIDT敏感性相对波动且偏低的可能原因24。
与此同时，另一项研究对上述RIDT进行了类似的验证，但对生产商推荐的方案进行了修改14。在制备脑组织样本时，省略了PBS中1:10的预稀释步骤。根据这一简化的修改方案，作者在实验室条件下检测了73份动物脑组织样本（这些样本自然或实验性地感染了多种RABV毒株），获得的敏感性和特异性分别为95.3%和93.3%。该研究首次在实地环境（非洲乍得）中对该RIDT进行了评估。在48份临床脑组织样本中，其敏感性和特异性分别为94.4%和100%。DFAT与RIDT之间的差异源于DFAT出现的假阳性结果，经RT-PCR确认后得以识别。当剔除这些结果后，两者完全一致，表明在该实地条件下，RIDT比DFAT更可靠14。采用修改后的方案未观察到批间差异。当将该修改方案应用于Eggerbauer等人研究中部分DFAT与RIDT结果不一致的样本（n=8）时24，所有样本结果均达成一致（敏感性达100%）。
RIDT 的另一个主要优势在于，可对试纸条上固定的病毒RNA进行二次利用，通过分子技术（如RT-PCR）检测并进一步进行基因分型14,24。Léchenne 等人14在51份样本（包括18份在常温下检测并从乍得运送的样本）的研究中，经过提取步骤后，利用RT-PCR在Anigen检测装置的膜上检测到固定的病毒RNA，灵敏度达86.3%。在所检测的14份样本中，93%可成功进行后续基因分型。研究采用Sanger测序法对长度至少为500个核苷酸的PCR扩增产物进行测序。在一项完全一致的国际室间比对测试中，该检测不仅检出RABV分离株，还检测出另外四种丽沙病毒属物种：DUVV、EBLV-1、EBLV-2和博克洛蝙蝠丽沙病毒（BBLV）14。Eggerbauer 等人的研究基于实验室样本分析，其病毒RNA检测的灵敏度更高，达到100%24。该研究还证实，RIDT试剂盒中使用的缓冲液具有灭活病毒的作用。因此，这些检测装置可在常温下安全运输至参考实验室，无需采取特殊生物安全防护措施，即可进行分子学确认和基因分型。
根据先前的评估，RIDT 工具在实地应用中具有多种优势，尤其是在无法获得参考诊断技术的情况下。然而，该检测也存在一些局限性，特别是抗原检测的灵敏度较低14,24。该检测适用于含有大量病毒抗原的样本，例如脑组织样本；但不适用于唾液或其他体液等其他类型的样本。另一个缺点是设备成本（在欧洲约为 5–10 欧元），尽管相较于进行 DFAT、RT-PCR 或 DRIT 的费用已较低，但对于中低收入国家（LMICs）而言仍属较高。然而，未来其他公司开发和验证类似的 RIDT 可能会促使价格下降。有研究报道了不同批次之间的差异。尽管其他研究未见类似报道，但在测试新批次时仍应执行严格的质量控制，如同在质量管理体系中使用任何试剂一样。使用不同批次时，改良后的操作流程并未发生改变14。除一项研究外，其余所有研究均表明，与 DFAT 相比，RDIT 的灵敏度较高（约为 90%–95%）。由于狂犬病一旦发病 invariably 致命，因此仍强烈建议使用参考诊断方法（如 DFAT、DRIT 或 RT-PCR）对 RIDT 检测出的任何阴性结果进行确认14。
本文提供了一套完整的动物狂犬病现场死后诊断实验方案，以一种已商业化的快速免疫层析诊断试纸（RIDT）为例，涵盖从脑组织样本采集、对生产商推荐方案（此前已验证14）进行优化后的操作流程，到后续分子检测分析的全过程。该方案已在西非和中非的实地条件下多次应用并验证，在这些地区，RIDT被常规用于与直接荧光抗体检测（DFAT）并行的狂犬病诊断。此外，我们还展示了该设备在实验室环境中的第二种应用方式，即利用该设备固定病毒RNA，并进行提取和RT-PCR检测。

<table><tbody><tr><td>抗狂犬病核衣壳结合物（冻干，吸附）</td><td>Bio-Rad, France</td><td>3572112</td><td>与狂犬病毒核衣壳反应的异硫氰酸荧光素（FITC）标记多克隆抗体。用于DFAT参考技术。</td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7500 实时荧光定量PCR系统</td><td>Applied Biosystems, France</td><td>4351104</td><td>从RIDT装置中提取RNA后，通过RT-qPCR扩增病毒RNA。</td></tr><tr><td>一次性塑料移液管、吸管、夹子、滴管</td><td>-</td><td>-</td><td>用于经枕骨大孔（枕骨通路）采集脑干（延髓）的设备。</td></tr><tr><td>伊文思蓝溶液 1%</td><td>Bio-Rad, France</td><td>3574911</td><td>DFAT中使用的复染剂，便于在紫外显微镜下观察。</td></tr><tr><td>引物 eGFPF1</td><td>Eurofins Genomics, Germany</td><td>-</td><td>用于在从RIDT装置提取RNA后，通过RT-qPCR扩增内参eGFP的正向引物，序列：5'-GACCACTACCAGCAGAACAC-3'。</td></tr><tr><td>引物 eGFPR2</td><td>Eurofins Genomics, Germany</td><td>-</td><td>用于在从RIDT装置提取RNA后，通过RT-qPCR扩增内参eGFP的反向引物，序列：5'-GAACTCCAGCAGGACCATG-3'。</td></tr><tr><td>引物 Taq17 revlong</td><td>Eurofins Genomics, Germany</td><td>-</td><td>用于在从RIDT装置提取RNA后，通过RT-qPCR扩增病毒RNA的反向引物，序列：5'-ATGAGAAGTGG&lt;br/&gt; AAYAAYCATCA-3'。</td></tr><tr><td>引物 Taq3 long</td><td>Eurofins Genomics, Germany</td><td>-</td><td>用于在从RIDT装置提取RNA后，通过RT-qPCR扩增病毒RNA的正向引物，序列：5'-GATCTGTCTGAA&lt;br/&gt; TAATAGAYCCARG-3'。</td></tr><tr><td>探针 eGFP FAM/TAMRA</td><td>Eurofins Genomics, Germany</td><td>-</td><td>用于在从RIDT装置提取RNA后，通过RT-qPCR扩增内参的正向探针，序列：5'-AGCACCCAGT&lt;br/&gt; CCGCCCTGAGCA-3'。</td></tr><tr><td>探针 RABV4 FAM/TAMRA</td><td>Eurofins Genomics, Germany</td><td>-</td><td>用于在从RIDT装置提取RNA后，通过RT-qPCR扩增病毒RNA的探针，序列：5'-AACACYTGATCBA&lt;br/&gt; GKACAGARAAYACATC-3'。</td></tr><tr><td>探针 RABV5 FAM/TAMRA</td><td>Eurofins Genomics, Germany</td><td>-</td><td>用于在从RIDT装置提取RNA后，通过RT-qPCR扩增病毒RNA的探针，序列：5'-AGRGTGTTTTCYAG&lt;br/&gt; RACWCAYGAGTTTTTYCA-3'。</td></tr><tr><td>快速狂犬病抗原检测试剂盒</td><td>BioNote Inc., Republic of Korea</td><td>RG18-01DD</td><td>用于狂犬病死后诊断的快速免疫层析诊断试验（RIDT，也称侧向流动装置或LFD）。</td></tr><tr><td>重组RNasin核糖核酸酶抑制剂</td><td>Promega, USA</td><td>N2515</td><td>与试剂盒配合使用，用于在从RIDT装置中提取RNA后，通过RT-qPCR扩增病毒RNA的酶。</td></tr><tr><td>SuperScript III Platinum 一步法qRT-PCR试剂盒</td><td>Invitrogen, France</td><td>11732-020</td><td>用于在从RIDT装置中提取RNA后，通过RT-qPCR扩增病毒RNA的试剂盒。</td></tr><tr><td>TRIzol试剂</td><td>Invitrogen, France</td><td>15596026</td><td>基于苯酚/氯仿法，利用RIDT中的纤维素膜进行总RNA提取。</td></tr></tbody></table>

适用于资源有限地区的现场尸体解剖后狂犬病快速免疫层析诊断检测及后续分子应用

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for Resource-Limited Settings with Further Molecular Applications

功能完善的狂犬病监测系统对于提供可靠数据并增强疾病控制所需的政治承诺至关重要。迄今为止，疑似狂犬病阳性的动物必须通过经典或分子实验室方法进行死后确诊。然而，大多数地方性流行地区位于中低收入国家，动物狂犬病诊断仅限于中央兽医实验室开展。监测基础设施的匮乏导致偏远地区狂犬病报告严重不足。近年来已开发出多种技术要求较低的诊断方案，为在分散式实验室建立狂犬病诊断提供了可能。本文介绍了一套完整的动物狂犬病现场死后诊断方案，采用快速免疫层析诊断试验（RIDT），涵盖从脑组织活检取样到最终结果判读的全过程。我们还进一步描述了该检测装置在分子分析和病毒基因分型中的附加用途。RIDT可简便地检测脑组织样本中的狂犬病病毒及其他丽沙病毒。该检测原理简单：将脑组织样本施加于试纸条上，金标抗体特异性结合狂犬病抗原；抗原-抗体复合物进一步与检测线上的固定抗体结合，形成清晰可见的紫色条带。病毒在试纸条上被灭活，但可随后提取病毒RNA。这使得试纸条本身可安全、便捷地寄送至具备条件的实验室，用于确认检测和分子分型。在制造商原方案基础上进行改良后，我们发现检测灵敏度提高，达到98%，相较于金标准参考方法——直接免疫荧光抗体试验，具有良好的一致性。该检测具有多项优势：快速、操作简便、成本低廉，且无需显微镜或冷链等实验室基础设施。RIDT为无法开展参考诊断方法的地区提供了一种有效的替代方案。

我们提供了一套完整的现场条件下动物狂犬病死后诊断方案，采用快速免疫层析诊断试验（RIDT），从脑组织活检取样到最终结果判读。我们还描述了该设备在分子分析和病毒基因分型中的进一步应用。

功能完善的狂犬病监测系统对于提供可靠数据以及增强疾病控制所需的政治承诺至关重要。迄今为止，……

本方案可用于动物狂犬病的死后诊断，从现场初步观察到集中化水平的分子构象分析均可适用。快速免疫层析诊断检测是一种实用的替代方法，适用于非洲和亚洲等缺乏狂犬病诊断参考材料的农村及偏远地区。演示该操作流程的是我实验室的技术员 Simon Bonas。本操作的第一部分将由来自马里巴马科中央兽医实验室的技术员 Ibrahima Dicko 演示。为暴露枕骨大孔，需使用刀具在第一颈椎前方切除动物头部，并使用适当的工具采集脑干样本。例如一次性移液管、吸管、镊子或滴管，如图所示。脑干此时清晰可见，如图中移液管尖端所示。使用合适的工具（如吸管）采集部分脑干组织。小心插入，并轻轻转动以采集脑组织。取出时切记用手指堵住吸管，以收集活检样本。也可使用钳子。为了在枕骨大孔水平采集较大脑干组织，可选择使用试剂盒中提供的移液滴管直接采集脑干。类似于使用吸管的方法，将滴管在按压状态下小心插入，然后轻轻旋转以采集脑组织。然后吸出脑组织并将其置于类似试管塞的容器中。在采样过程中，为获得准确诊断，必须采集包含延髓的脑干部分。将脑组织直接放入含有缓冲液的试管中，用拭子或滴管仔细研磨约30秒，直至形成均匀的悬液。使用滴管，将四滴约100微升的悬浮液加入检测装置的样品入口。若因悬浮液黏度过高导致加入延迟，或为加速迁移过程的启动，可用滴管轻轻刮擦装置上样品滴加位置的底部。待样品完全迁移后，静置1至5分钟，再读取检测结果。当出现两条线时，样本被视为狂犬病阳性；仅出现对照线时为阴性；若仅出现检测线或无任何线条可见，则结果无效。为了从装置样本中提取RNA，需小心打开装置并取出滤纸。收集样本的沉积区域，并将样本放入1毫升的TriReagent LS中。在室温下定期轻轻手动振荡孵育一小时后，根据标准RNA提取方案，从管中上清液提取RNA。按照生产商的建议，加入2 µL糖原以促进RNA沉淀。用无核酸酶水将RNA重悬液的终体积调整至50微升。并根据表格中的说明，配制三种不同逆转录定量PCR检测的预混反应液，使用表格中指定的引物和探针。取5 µL稀释后的RNA样本，以及15 µL主混合液，分别加入相应的96孔反应板中，每种三个不同检测各设两个复孔。每块板中均需设置相应的阳性和阴性对照，各设两个复孔。然后按照表格中所示的热循环条件进行不同的检测。结果可按照表格中的说明进行分析。脑组织活检的采集应尽可能简便，以确保获得高质量的样本。与参考技术相比，采用这些方案的所有实验室中，快速免疫层析诊断试验的灵敏度和特异性均较高。根据累计检测样本数量，总体灵敏度和特异性均超过95%。快速免疫层析诊断试验适用于检测感染动物脑组织活检中的丽沙病毒。然而，由于丽沙病毒抗原水平对狂犬病诊断至关重要，因此在检测梯度稀释的病毒悬液时，其检测下限仍然较高。在这些代表性结果中，通过针对丽沙病毒属病毒聚合酶的双重联合泛丽沙病毒逆转录定量 PCR 进行 RNA 检测后，共完成了 51 份阳性快速免疫层析诊断检测。此外，利用针对部分核蛋白基因的半巢式 PCR，可对其中 14 份样本进行基因分型。基于 RT-PCR 后的试纸条检测以及额外的长片段序列分析，可用于基因分型的诊断与提取。快速免疫层析诊断试验可提供快速且准确的狂犬病诊断，这对于维持基于连续波的监测与控制系统中的波函数至关重要，并有助于最大限度地减少人为因素。

field-postmortem-rabies-rapid-immunochromatographic-diagnostic-test

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

现场验尸狂犬病快速免疫性诊断测试资源有限设置与进一步分子应用

直接快速免疫组织化学检测法（DRIT）是被世界动物卫生组织和世界卫生组织（OIE/WHO）认可的狂犬病诊断直接荧光抗体（DFA）检测的替代方法。该检测可在现场应用，利用光学显微镜对脑组织涂片进行检测，约1小时内即可完成。...

增强型狂犬病监测：采用直接快速免疫组织化学检测法

已开发出一种广谱丽沙病毒巢式逆转录聚合酶链式反应，可特异性检测所有已知的丽沙病毒。使用不同动物种类的狂犬病脑组织样本进行验证表明，该方法的灵敏度和特异性与金标准荧光抗体检测相当，可用于常规狂犬病诊断。...

一种用于检测丽沙病毒的通用巢式逆转录聚合酶链式反应的评估

本方案的目的是演示在小型和大型动物中进行安全剖检的技术，以获得用于狂犬病检测的满意组织样本。...

大型与小型动物狂犬病尸检技术

本文介绍一种间接ELISA夹心免疫捕获法，用于测定狂犬病疫苗中免疫原性糖蛋白的含量。该检测方法采用一种可识别糖蛋白三聚体的中和性单克隆抗体（mAb-D1），可作为体内NIH试验的替代方法，用于在生产过程中监测疫苗效力的一致性。...

体外ELISA检测法评估狂犬病疫苗效价

这种使用双链DNA嵌 intercalating...

泛丽沙病毒实时逆转录聚合酶链式反应用于狂犬病诊断

本文介绍一种用于检测狂犬病病毒抗原的免疫组织化学检测方案，可作为福尔马林固定组织的替代诊断方法。...

免疫组织化学检测法用于检测福尔马林固定组织中的丽沙病毒抗原

本方案介绍了一种基于qRT-PCR的方法，通过体外转录技术测定牛脑不同解剖结构中狂犬病病毒核蛋白（N）基因的拷贝数。...

定量分析不同牛脑结构中的狂犬病病毒

本文介绍了一种利用纳米孔技术对狂犬病病毒（RABV）基因组进行快速且经济高效的表征工作流程。该工作流程旨在支持基于基因组信息的本地化监测，提供有关流行RABV谱系及其在区域系统发育树中位置的信息，以指导狂犬病防控措施的制定。...

利用纳米孔技术进行狂犬病病毒快速全基因组测序

本文的目的是探讨使用狂犬病间接荧光抗体试验来检测狂犬病特异性IgG和IgM抗体的方法。...

使用狂犬病间接荧光抗体试验检测IgG和IgM抗体

本方案展示了泛丽沙病毒LN34实时反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测的完整流程，从组织采集到结果解读，包括引物序列和反应体系的优化更新，以提升该检测方法对部分非狂犬病丽沙病毒及兔形目动物样本的检测性能。我们还演示了单孔LN34多重化（LN34M）检测格式的实验设置。...

利用更新的多重LN34实时反转录-聚合酶链式反应检测法对动物进行狂犬病死后诊断

学习使用快速免疫层析诊断试剂盒进行动物狂犬病死后诊断的方法，包括脑干采样、结果判读及病毒基因分型应用。该方法适用于资源有限的现场环境，灵敏度和特异性均超过95%。

适用于资源有限地区的现场尸体解剖后狂犬病快速免疫层析诊断检测及后续分子应用

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