白细胞亚群在暂时或永久的脑缺血模型体视学和流式细胞仪鉴定

该程序的总体目标是通过两种不同的方法表征缺血性脑的小鼠髓系细胞亚群。首先，通过闭塞引入脑缺血的永久性模型，包括主要影响大脑皮层的颈总动脉或 CCA 和大脑中动脉远端干或 MCA 产生梗塞。然后，对于髓系细胞亚群的立体逻辑定量，对脑的连续冠状切片进行目标细胞的免疫染色，然后通过光学分馏器方法定量浸润的细胞。

或者，可以通过机械解离从新鲜脑组织中分离髓系细胞，然后通过流式细胞术染色和分析。最终，可以通过立体定量和多参数流式细胞术分别实现脑缺血后浸润小鼠大脑的特定髓系细胞亚群的准确定量和详细定性表征。与其他现有模型相比，这种缺血系列模型的主要优点是，我们的技术比其他方法具有显着较低的死亡率，从而最大限度地减少了研究所需的动物数量。

这个领域是一种可以帮助回答中风领域关键问题的方法，例如微再激活、血源性巨噬细胞外渗或中性粒细胞在脑损伤中的作用是什么？他们对本文中演示的多参数细胞术方法进行了准确的神学量化，可以深入了解对 CE 缺血的先天免疫反应中髓系细胞群的数量、表型和功能。要首先结扎 CCA，请在手术显微镜下在动物颈部的腹侧表面周围做一个 1 厘米的中线切口。

解剖后，使用 6 零尼龙缝合线用永久结封闭左侧 CCA，以结扎远端 MCA。接下来，在颞肌上从右向左做一个水平切口。然后在颞肌右侧做第二个垂直切口。

注意避免割断颞静脉。将颞肌从颅骨上拉开，并用缝合线固定，以保持颅骨表面清洁。然后用冷无菌盐水清洁颅骨，通过颅骨透明度检测左侧 MCA 的确切位置。

一旦确定了 MCA，使用不锈钢毛刺在颧弓和鳞骨之间的额叶进行 1 毫米的圆形开颅手术。小心地去除露出 MCA 的头骨。然后使用 9 零尼龙缝合线将左侧 MCA 封闭在额支和后支之间的分叉之前，形成永久性结。

要切除大脑，请将被安乐死的小鼠斩首，就在脊髓上方，并在皮肤上做一个后前切口以露出头骨。然后在侧壁和颅底的交界处做两个横向切口，取出那一小块骨头。接下来，沿着矢状缝合线切开颅骨，用镊子去除覆盖在每个半球上的颅骨，露出大脑。

用刮刀将大脑与颅骨分离，并将其转移到 4% PFA 溶液中。三小时后，去除 PFA 并在 30% 蔗糖溶液中孵育大脑以冷冻保护大脑。48 小时后，取出蔗糖溶液，在零下 40 摄氏度的异戊烷中快速冷冻大脑，然后使用冷冻切片机制作 30 微米的冠状脑切片。

在冷冻保存溶液中收集 10 个连续系列。每个序列组由大约 14 到 16 个冠状切片组成，切片间距为 300 微米。确保对 bgma 后 1.94 和负 2.46 之间的小鼠大脑进行充分采样，以估计浸润的中性粒细胞的总数。

在用光学分馏器封闭 MCA 后，首先用大鼠抗 LY six G 抗体和适当的二抗通过常规免疫荧光技术在浮动切片上对中性粒细胞进行免疫染色。然后将脑切片安装在 Super frosts 显微镜载玻片上，梗塞区域位于右侧，并打开立体调查软件。接下来，单击工具 serial section manager 菜单并使用 new section 按钮添加新部分。

对于第 10 个切片采样分数，将评估间隔设置为 10。然后从轮廓下拉菜单中，选择梗死区域轮廓工具。绘制轮廓以勾勒出 10 x 物镜下的梗塞区域。

然后在显微镜和物镜菜单下切换到 100 x 物镜。要在探针菜单下定量嗜中性粒细胞，现在选择光学分馏器并将 X 和 Y 网格大小的计数帧的 XY 位置设置为 230。现在从标记栏中选择中性粒细胞按钮，并在梗塞区域标记染色的中性粒细胞。

将定量结果导出到电子表格文件，以将大脑解离成单个细胞悬液。如刚才所示切除大脑后，从脑缺血小鼠的大脑中解剖出同侧皮层的核心和每个梗塞区域。称量脑组织，每次调用将其放入 5 毫升冰冷的 RPMI 中，以便在实验组之间进行标准化，然后使用带有特氟龙杵的组织研磨机将组织解离成单细胞悬液。

将细胞悬液转移至 50 mL 超速离心管中，每次调用溶液再添加 5 mL RPMI。然后在 7， 800 GS 和 25 摄氏度下离心细胞悬液 30 分钟后。确保与髓鞘相对应的白色层出现在溶液的顶部。

小心去除髓鞘层，并通过 40 微米尼龙网过滤器过滤整个细胞悬液，包括沉淀的细胞。用 10 毫升 RPMI 清洗过滤器，以确保所有细胞都通过网片过滤，然后将溶液转移到 50 毫升试管中。向细胞中加入 20 毫升 RPMI，然后在旋转细胞后，重悬白细胞沉淀。

在 1 mL PBS 中，将细胞在 4 mL 裂解缓冲液中，在室温下孵育 2 到 3 分钟，以裂解红细胞，然后离心细胞。在冰上用 200 微升含有 1% BSA 和适当抗体的 PBS 标记细胞。然后在 45 分钟后，用 1 毫升冷 PBS 洗涤样品，Resus 将沉淀重悬于 100 μL 传真流式缓冲液中，用于流式细胞分析。

该模型的特点是大脑中动脉闭塞后 24 小时梗死体积高度可重复，如 cavalieri 方法估计的那样。在与先前研究一致的 nial 染色切片中，中性粒细胞浸润与梗死面积直接相关。此外，白细胞分离和流式细胞术表征允许从缺血小鼠的 IPS 病变半球皮层中分离髓系细胞，占细胞悬液中发现的总事件的 10% 至 30%，并呈现与细胞碎片相关的低前向散射参数。

CD 11 B 阳性细胞具有较高的前向散射值，表明细胞碎片没有用该标记物标记，并且如前所述，可以通过将 FSC 阈值设置为 200 个中性粒细胞来排除进一步分析，其特征为 LY 6 G 阳性细胞是使用这种脑缺血模型在缺血小鼠大脑中 MCA 闭塞后 24 小时发现的最多的浸润细胞群，并且占 CD 11 B 阳性 CD 45 高细胞的 70% 至 80%。其余细胞主要是 CD 11 B 的亚群，阳性 CD 45，高 LY 6 G，负 6 C 高促炎单核细胞，在大脑中动脉闭塞后 24 至 48 小时在缺血性脑区发现数量增加。如果按照流式细胞术程序正确执行，该 P-M-C-A-O 模型可以在 30 分钟内完成。

可以执行其他方法，例如对特定细胞亚群进行排序，以回答其他问题，例如该模型系统中髓系细胞的表达模式、代谢变化或乙酸活性是什么。观看此视频后，只需更好地了解如何创建缺血模型，最重要的是，如何在小鼠脑损伤或 TPE 脑缺血模型中通过两种不同的方法表征浸润髓细胞的数量和表型。