小鼠间质瓣细胞分离研究主动脉瓣体外钙化
May 10th, 2021
本文描述了通过两步拼贴程序分离小鼠主动脉瓣细胞。分离的小鼠瓣细胞对于执行不同的测定（如 体外 钙化检测）和研究导致主动脉瓣矿化的分子通路非常重要。
使用分离的小鼠瓣膜细胞对于研究导致转基因小鼠使用转基因细胞时导致瓣膜钙化的信号通路至关重要。两步消化是一种快速高效的方法。该协议最具挑战性的部分是主动脉瓣与八周小鼠隔离。
最好在老老鼠身上练习，以便更好地可视化主动脉瓣。在开始实验之前，用70%乙醇清洁和消毒所有的手术器械和工作空间，并高压手术器械30分钟。当初始设置准备好后，从使用乙醇清洁一只八周大的安乐死小鼠的胸部和腹部开始。
使用剪刀，打开鼠标的腹部和胸部，然后用小手术剪刀在左中庭和左心室之间切割。通过香水10毫升的冷PBS，并切开心脏，保持3毫米的上升主动脉，从心脏中取出血液。在立体显微镜下，通过在心室中间水平切开心脏并切开左心室朝向主动脉，然后仔细解剖主动脉瓣来解剖主动脉瓣。
将阀门集中到一个35毫米的小型组织培养皿中。用5毫升新鲜制备的10毫升冷EPES，辅以抗生素，在5毫升的拼贴剂1型中用5毫升的分离瓣膜清洗，在37摄氏度下持续摇晃30分钟。孵化后，离心管5分钟，在150倍G和洗颗粒一次用两毫升10毫摩尔HPES与涡流在高速30秒。
将由此产生的悬浮物从管子中收集到 35 毫米培养皿中，并使用薄钳小心地将组织碎片转移到新鲜管中。然后在连续搅拌35分钟的连续搅拌下，在15毫升管中孵育颗粒，在37摄氏度下用5毫升的拼贴剂类型1。在摄氏4度下，用1毫升移液器和离心机以150倍G为5分钟，将细胞分离。
在两毫升完整的DMEM中重新吸收分离的颗粒，并在4摄氏度下以150倍G为离心，在5分钟内清洁细胞。对于电镀，将颗粒重新用一毫升的完整介质重新使用，并将其添加到六井细胞培养皿的一口井中，以最小的介质量。保持板不受干扰在37摄氏度与5%的二氧化碳。
经过三天的孵化，通过观察显微镜下的细胞来确认组织碎片附近的生长。一旦1000个细胞可见，小心地用自动切开的钳子去除组织碎片，并改变介质。在达到70%的汇流后尝试细胞，并将其转移到75毫升组织培养皿中。
在开始检测之前，用 70% 乙醇清洁生物安全罩，并将 DMEM 中到 37 摄氏度加热。接下来，将每种情况下的10万个细胞种子放入6个井板中，在37摄氏度的完全DMEM和培养中。24小时后，用钙化介质替换超高介质，在37摄氏度下孵育细胞7天，第三天替换介质。
七天后，使用阿尔塞纳佐三号试剂测量96井板中的钙浓度，并将吸附量记录在650纳米处。在代表性分析中，经过三到五天的培养，各种瓣膜细胞表型被鉴定为免疫荧光染色。小鼠VIC表达的维他汀和αSMA，瓣膜细胞的重要标记。
此外，CD31免疫荧光染色验证了VIC培养中内皮细胞的污染。用富含磷酸盐的钙化介质培养VIC刺激细胞中的钙化，进一步确认钙节点的红色阳性染色。该协议基于来自不同小鼠的三到五个阀门池。
使用垃圾伴侣和三种不同的生物复制物对于验证这些发现非常重要。使用小鼠瓣膜细胞对于了解通过将细胞与转基因小鼠隔离而导致主动脉狭窄的分子途径至关重要。本协议以前曾用于研究钙化主动脉瓣矿物质回归中受体通路的含义。
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概述
本文详述了一种用于分离小鼠主动脉瓣细胞的双步胶原酶程序，这对于研究主动脉瓣钙化相关的分子通路至关重要。该分离方法使后续的检测能够评估瓣膜矿化。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞生物学
- 信号通路
- 主动脉瓣钙化
背景
- 分离瓣膜细胞在理解钙化机制中的重要性。
- 从八周龄小鼠中分离主动脉瓣的挑战。
- 转基因小鼠模型在揭示分子通路中的重要性。
使用的方法
- 双步胶原酶消化用于细胞分离。
- 小鼠模型，特别是来自转基因小鼠的主动脉瓣。
- 体外检测，包括使用Arsenazo III试剂的钙浓度测量。
主要结果
- 成功分离和培养瓣膜细胞。
- 通过免疫荧光染色鉴定瓣膜细胞表型。
- 通过多个生物重复验证研究结果。
结论
- 本研究提出了一种高效的主动脉瓣细胞分离方法，增强了对主动脉瓣狭窄分子机制的理解。
- 研究结果为心脏瓣膜钙化的更广泛生物学研究做出了贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of mouse valve interstitial cells (VICs) enables mechanistic interrogation of aortic valve calcification, a key driver of aortic stenosis. This workflow supports early discovery and target validation by providing a disease-relevant in vitro system for pathway analysis and pharmacological testing. The method enhances predictive confidence for translational research and portfolio triage in cardiovascular drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking by isolating VICs for pathway interrogation in calcification.
- Supports functional target validation using genetically modified mouse models.
- Facilitates hypothesis-driven testing of molecular drivers and inhibitors of mineralization.
- Provides a platform for evaluating new pharmacological targets in a controlled system.
Screening & Assay Development
- Delivers validated primary cell cultures for reproducible in vitro calcification assays.
- Standardizes cell phenotype confirmation via immunofluorescence for assay reliability.
- Enables quantitative measurement of calcification using calcium reagent and alizarin red staining.
- Prepares scalable systems for compound screening and comparative analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant mechanisms observed in aortic stenosis.
- Supports continuity from genetic models to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Provides a platform for biomarker discovery and mechanistic studies in valve pathology.
- Reduces translational risk by modeling human disease processes in primary mouse cells.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical target validation in cardiovascular research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification in valve calcification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Supports statistical comparison of calcification across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic insights to in vivo disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for diverse genetic backgrounds and pharmacological studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes cell isolation and assay protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in early-stage cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and compounds for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse dissection and primary cell culture techniques.
- Needs access to sterile surgical instruments, biosafety hoods, and analytical reagents.
- Demands rigorous cross-team standardization for cell isolation and phenotype validation.
- Adaptable to various transgenic mouse models for pathway-specific studies.
- Dependent on careful dissection and pooling of valves to ensure sufficient cell yield and reproducibility.
