Name: 生成受控动态化学景观，研究微生物行为 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学习利用微流控技术与光解技术生成受控动态化学脉冲，研究微生物趋化行为与种群动态。该方法可揭示微生物在生态相关微环境中的营养动力学与适应性权衡。

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作者感谢苏黎世联邦理工学院的 FIRST 微加工设施。本工作得到了澳大利亚研究理事会发现早期职业研究员奖 DE180100911（授予 D.R.B.）、戈登与贝蒂·摩尔海洋微生物计划研究员奖 GBMF3783（授予 R.S.）以及瑞士国家科学基金会资助项目 1-002745-000（授予 R.S.）的支持。

1. 单次化学脉冲实验用微流控装置的制备
<ol>
	<li>使用计算机辅助设计（CAD）软件设计通道，并将其打印到透明胶片上以制作光刻掩模（图1A）。</li>
	<li>通过软光刻技术在洁净室条件下制备母模。
	<ol>
		<li>依次用丙酮、甲醇和异丙醇快速清洗硅片（4英寸），然后用氮气吹干。将硅片放入烘箱中，在130 °C下烘烤5分钟。</li>
		<li>将硅片置于匀胶机中心，并将SU-8光刻胶倒在硅片上。在5秒内将匀胶机转速升至500 rpm，并保持10秒。再用10秒将转速升至最终速度，并在此速度下维持30秒。 
		注：最终转速的具体数值取决于目标涂层厚度和所使用的SU-8型号。</li>
		<li>匀胶完成后，先在65 °C下烘烤，再在95 °C下烘烤。让硅片在室温（RT）下冷却至少5分钟。 
		注：烘烤时间取决于目标厚度和所用光刻胶的类型。一般原则是，每100 µm厚的涂层应在65 °C下烘烤5分钟，在95 °C下烘烤45分钟。</li>
		<li>将光刻掩模放置在硅片上，确保仅目标区域被曝光并发生聚合。按照SU-8说明书推荐的时间进行紫外光曝光。 
		注：本实验中，在波长为350 nm、曝光能量为200 mJ cm-2的条件下，曝光时间为150秒。</li>
		<li>按照SU-8说明书推荐的时间，在65 °C和95 °C下对硅片进行烘烤。 
		注：一般原则同上，每100 µm厚的涂层应在65 °C下烘烤5分钟，在95 °C下烘烤45分钟。</li>
		<li>将硅片浸入装有聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）显影液的烧杯中，以获得母模。轻轻摇动烧杯，确保未聚合的光刻胶被彻底洗去。将母模在200 °C下烘烤，以进一步交联SU-8层。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在烧杯中按10:1的比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体与其固化剂（材料表），制备PDMS混合物（本实验中为40 mL）。剧烈搅拌直至液体均匀。 
	注：由于混合过程中会产生气泡，PDMS混合物将呈现不透明状态。 
	注意：为防止皮肤接触潜在有害的化学品或生物材料，在整个操作过程中务必穿戴实验服和一次性塑料手套，并遵循材料安全数据表（MSDS）中的具体安全规程。</li>
	<li>将PDMS混合物置于真空腔中，在室温（RT）下脱气45分钟。为加快进程，可周期性释放真空以破坏在界面处形成的气泡。 
	注：脱气过程必须在1小时内完成，以防止PDMS混合物开始固化。</li>
	<li>使用加压清洁器去除母模表面的灰尘，然后将脱气后的PDMS混合物浇注到母模上，并在80 °C烘箱中烘烤2小时。 
	注：也可选择在60 °C下过夜（或至少12小时）烘烤，以获得同样硬度的PDMS。</li>
	<li>用刀片沿微结构周围（距离约5 mm）切割PDMS，然后小心地将PDMS从母模上剥离。</li>
	<li>打孔作为微通道的入口和出口（本实验中为一个入口和一个出口，见图1A）。确保任何物体均不接触PDMS底部带有微结构的表面。 
	注：此处可暂停操作流程。应使用胶带密封微通道，以防止储存期间灰尘和其他颗粒物积聚。</li>
	<li>将PDMS微通道键合到载玻片上。
	<ol>
		<li>用肥皂、异丙醇和去离子水彻底清洗载玻片。让载玻片自然晾干，或使用压缩空气加速干燥。</li>
		<li>用胶带轻拍去除灰尘颗粒。在对PDMS微通道和载玻片表面均进行等离子处理（使用电晕系统或氧气等离子体腔）2分钟后，立即将PDMS微通道键合到洁净的载玻片上。</li>
		<li>将微流控装置置于加热板上，在80 °C下加热至少1小时，以增强其与玻璃之间的化学键合强度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用于多脉冲实验的3D打印毫流控装置的制备
<ol>
	<li>使用 3D 设计软件设计三维形状，并使用高分辨率 3D 打印机打印用于 PDMS 模具的母模（图 1B）。 
	注：有关用于制作母模的 3D 打印机和模具材料，请参见材料表。</li>
	<li>重复步骤 1.3–1.4，然后用胶带轻拍母模表面以清洁。将母模置于天平上，避开母模中央将被膜占据的区域，倒入精确量的未固化 PDMS 混合物（此处为 23.4 g），使 PDMS 高度与母模高度一致（此处为 0.5 mm）。使用压缩空气去除残留气泡。</li>
	<li>将带有母模的 PDMS 铸型放入 45 °C 烤箱中，烘烤至少 12 小时。</li>
	<li>将 3D PDMS 模具键合至培养皿。
	<ol>
		<li>小心剥离固化的 PDMS 层，并打孔作为细菌悬浮液注入的进样口和出样口（图 1C）。</li>
		<li>将培养皿（90 mm × 15 mm）表面和 PDMS 模具在氧气等离子体中处理 2 分钟以活化表面，随后将 PDMS 模具键合到培养皿上。轻轻按压模具使其贴合培养皿，但避免按压结构特征所在区域，以防检测腔塌陷。</li>
		<li>将键合有 PDMS 3D 模具的培养皿置于 45 °C 烤箱中至少 12 小时，以增强化学键合强度。 
		注：本实验方案可在此处暂停。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>膜表面功能化18
	<ol>
		<li>在室温下，将纳米多孔聚碳酸酯（PCTE）膜置于氧气等离子体腔中活化 1 分钟。 
		警告：避免使用电晕系统进行等离子体活化，因其会损坏膜。</li>
		<li>在化学通风橱内，使用聚丙烯管将市售的 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液用去离子水稀释至体积比 1%（此处为 40 mL）。 
		警告：APTES 溶液具有急性毒性（MSDS 健康危害等级 3），必须仅在佩戴手套的条件下于化学通风橱内极其小心地操作。接触 APTES 溶液后应立即更换手套。APTES 蒸气对黏膜和上呼吸道具有破坏性。APTES 的靶器官为神经、肝脏和肾脏。若无通风橱，必须佩戴面罩和全面罩呼吸器。</li>
		<li>将稀释后的 APTES 溶液转移至培养皿中，并将活化后的膜浸入 APTES 溶液中 20 分钟。</li>
		<li>用镊子将膜从 APTES 溶液中取出，并放置于洁净室擦拭纸上干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为制备将位于膜上并用于清洗细菌区域的 PDMS 微流道，重复步骤 1.1–1.7。</li>
	<li>将 PDMS 清洗通道键合至功能化膜上。
	<ol>
		<li>将 PDMS 清洗通道和 PCTE 膜在氧气等离子体腔中处理 2 分钟以活化表面。 
		注：将被夹在两层 PDMS 之间的膜应比 PDMS 清洗通道略小。</li>
		<li>等离子体处理后立即轻轻将功能化膜与 PDMS 清洗通道接触，将 PDMS 清洗通道轻压至膜上。 
		注：此步骤中切勿施加过大压力，以免导致膜与通道顶部发生（不可逆）粘连，从而堵塞通道。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将膜夹在两层 PDMS 之间（图 1E）。
	<ol>
		<li>将已键合的 PDMS 清洗通道–PCTE 膜层压结构和先前键合至培养皿的 3D PDMS 模具分别在氧气等离子体腔中处理 2 分钟，随后使其接触并压合。</li>
		<li>将键合有夹层结构的培养皿置于 45 °C 烤箱中至少 12 小时，以增强化学键合强度。 
		注：本实验方案可在此处暂停。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞培养
<ol>
	<li>培养一个群体 V. ordalii （菌株 12B09 或 12B09pGFP）在 2216 培养基中过夜培养 20 小时19 在摇床（600 rpm）上 30 °C 并在对数生长后期收获细胞。对于含有 pGFP 的菌株，添加壮观霉素（50 µg mL-1以维持质粒。</li>
	<li>将1 mL细胞样品在2500 x g下离心 g 3 分钟后，弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL 过滤的人工海水。重复此步骤。</li>
	<li>使群体处于饥饿状态 V. ordalii 在轨道摇床（600 rpm）上 30 °C 3小时。</li>
	<li>配制10 mM的储备人工海水溶液（此处为1 mL），含4-甲氧基-7-硝基吲哚啉基笼锁-L-谷氨酸（MNI-笼锁型-L-谷氨酸）并于 -20 °C. 
	注意：保护MNI-caged-L- 谷氨酸溶液应避光保存，以防止光解。</li>
	<li>将饥饿后的细胞重新悬浮于含1 mM MNI-caged-的人工海水中，稀释50倍L-谷氨酸 
	注意：这将确保最终细菌浓度低于 5 x 107 mL-1 （具体数值取决于对数生长后期细胞的初始浓度，该浓度通常约为10）9 mL-1细菌浓度通过分光光度计在600 nm波长处测定光密度（OD）进行估算。</li>
</ol>
4. 解笼协议的校准
<ol>
	<li>在载玻片上放置一滴体积为 20 μL、浓度为 C0 = 10 mM 的含 MNI-笼锁-L-谷氨酸20 的人工海水溶液。用一个圆形 PDMS 腔室（直径 d = 5 mm，高度 h = 250 μm）覆盖液滴，将其封装。</li>
	<li>将载玻片置于显微镜载物台上，使用 4 倍物镜（数值孔径 [NA] = 0.13），以波长为 395 nm（功率 295 mW）的 LED 光束照射整个腔室，持续 20 ms。</li>
	<li>打开 PDMS 腔室，吸取 1 μL 液滴，用于紫外-可见分光光度计分析。</li>
	<li>对 LED 照射时间分别为 0.1 s、0.5 s、2.5 s、25 s、250 s（或直至化学反应达到饱和）以及 0 s（用于获取背景值）的情况，重复步骤 4.1−4.3。重复步骤 4.1−4.4 至少 3 次（本实验中为 4 次）。</li>
	<li>从吸收光谱中提取 405 nm 处的数值，该波长对应笼锁分子吸收光谱的峰值21。为确定 LED 照射诱导的化学解笼反应速率 k14，采用以下一级动力学方程对实验数据进行数值拟合17 
	<img alt="指数增长方程，C(t)=C₀(1-e^(-kt))，数学公式分析。" src="/files/ftp_upload/60589/60589equ01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1"> 
	其中 C(t) 表示经过 t 秒解笼时间后，溶液在 405 nm 处的吸收光谱值（已扣除背景）。当解笼时间 t 较小，使得 kt ≪ 1 时，方程 1 可简化为线性形式 
	<img alt="指数衰减方程，\( C(t)=C_0 e^{kt} \)，以科学公式格式显示。" src="/files/ftp_upload/60589/60589equ02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 2"></li>
</ol>
5. 单次化学脉冲实验
<ol>
	<li>将微流控通道置于真空环境中 20 分钟，以降低 PDMS 内的气体浓度，从而减少填充过程中气泡的形成。</li>
	<li>将通道从真空泵中取出，并立即使用微量移液器将稀释的细菌悬浮液（溶于含 1 mM MNI-笼锁-L-谷氨酸的人工海水）轻柔地注入微通道，避免因机械剪切力损伤鞭毛（此处整个填充过程耗时 5–10 秒）。填充完成后，用纸巾吸去多余的溶液，并通过轻轻按压将 PDMS 塞子密封于入口和出口处。 
	注意：此操作可防止腔室内产生液体流动。</li>
	<li>将微通道放置于显微镜载物台上，移动载物台以使视野位于通道中央。设置显微镜以相差模式（4×物镜）进行成像，帧速率为 12 fps。 
	注意：该帧速率可调整，但不应低于 10 fps，以确保可通过图像分析重建细菌运动轨迹（见第 7 部分实验方案）。</li>
	<li>将 LED 光束的针孔调节至最小孔径。将相机曝光时间设为 5 秒，记录若干帧图像，以精确测量 LED 光束的空间位置和尺寸。 
	注意：LED 光源通过液体光导连接至显微镜的落射荧光照明装置。由于视频采集与 LED 刺激由软件独立控制，LED 光束不会影响视频记录。</li>
	<li>持续成像总时长为 10 分钟（最大化学脉冲实验为 20 分钟），并通过显微镜软件在用户定义的时间点（本实验中为视频采集开始后 10 秒）同步激活 395 nm 的聚焦 LED 光束，持续指定时长（本实验中 t = 20 ms、100 ms、500 ms）。为获得同一过程的多个重复数据，移动载物台以记录细菌在微流控通道不同位置的响应。每种脉冲大小均使用新的微通道重复该实验。 
	注意：解笼过程在成像平面内产生一个轴对称的圆柱形扩散脉冲，向外径向扩散。</li>
	<li>在更高倍率（20×物镜，NA = 0.45）和更高帧速率（50 fps）下进行独立实验，但不进行化学解笼，以记录细菌的无偏游泳运动。</li>
</ol>
6. 多次化学脉冲实验
<ol>
	<li>将微流控腔室置于真空条件下维持 20 分钟。</li>
	<li>将含有微流控腔室的培养皿放置于显微镜载物台上。用稀释的细菌悬浮液（此处，整个填充过程耗时 10−15 秒）填充膜下方的腔室，该悬浮液为含 1 mM MNI-笼锁-L-谷氨酸盐的人工海水中表达 GFP 荧光的 V. ordalii。用细菌悬浮液填充通道后，用纸巾吸去多余的液体，并通过轻轻按压将 PDMS 塞插入孔中，密封入口和出口。 
	注意：此操作可防止腔室内产生液体流动。为了在本实验装置中更清晰地观察细菌（成像通过纳米多孔膜进行），强烈建议使用荧光标记菌株而非野生型菌株（单次化学脉冲实验中使用的是野生型）。</li>
	<li>用含 1 mM MNI-笼锁-L-谷氨酸盐的人工海水溶液填充注射器，并将管路连接至膜上方清洗通道的入口和出口。</li>
	<li>将管路连接至废液储液罐，并确保管路完全浸没在液体废液罐中，以避免压力振荡。</li>
	<li>在注射泵上设定适当的流速（此处为 50 μL min-1），以在清洗通道中获得所需的平均流速，具体流速取决于通道的几何结构。</li>
	<li>启动注射泵，使膜上方清洗通道中形成稳定流动。</li>
	<li>运行控制 LED 光束和显微镜载物台的软件，以在不同位置和不同强度下生成用户自定义的脉冲序列。 
	注意：膜上方清洗通道中持续流动的含 1 mM MNI-笼锁-L-谷氨酸盐的人工海水溶液可不断补充笼锁化合物，并将细菌活动区域中的耗尽培养基冲洗出去。</li>
	<li>使用 4 倍物镜，在数小时内以固定时间间隔对多个连续区域进行视频记录，以覆盖较大面积（此处为 1 cm × 1 cm，图 1F）。</li>
</ol>
7. 图像分析与数据分析
<ol>
	<li>细菌运动轨迹的重建
	<ol>
		<li>使用4倍物镜拍摄的录像，通过追踪软件重建细菌的运动轨迹17. 
		注意：这些轨迹代表了细菌在微通道中三维运动的二维投影。</li>
		<li>从重建的细菌运动轨迹中，通过将每个游动个体的游泳速度投影到化学脉冲中心方向，确定其径向漂移速度。图2D）。为了可视化径向漂移速度的时空动力学，使用具有空间尺寸的分箱网格 75 μm x 75 μm 时间窗口为5−10秒间隔（图2D,E). 
		注意：由于该过程具有柱对称性，数据可在极坐标系中进行分析，并在角向维度上取平均（图3).</li>
		<li>从重建的细菌运动轨迹中，确定细菌在响应化学脉冲时其分布的时空动态图2E).</li>
		<li>从单脉冲实验中使用20倍物镜记录的高分辨率视频中，提取细菌群体在响应化学脉冲时的游动速度分布和运行时间分布。图4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过分析趋化完成后细菌群体的耗散动力学来估算细菌的扩散系数17 （此处用于 t &gt; 300 s 图3).</li>
	<li>通过应用斯托克斯-爱因斯坦方程估算谷氨酸的扩散系数 
	<img alt="扩散系数公式 \(D_c = k_BT/(6\pi\eta r)\)，用于物理学研究的方程示意图" src="/files/ftp_upload/60589/60589equ03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 3"> 
	其中氨基酸分子被假定为具有流体动力学半径的球形粒子22 rG, kB 是玻尔兹曼常数（1.38 × 10-23 m2 kg s-2 K-1), T 是温度（296 K），η 为人工海水（盐度 36 g kg⁻¹）的动力黏度-1在 23 °C (10-3 帕斯卡（Pa）23</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方法可使研究人员在微流控和毫流控装置中研究细菌趋化性，通过可控的动态浓度梯度实现可重复的数据采集。利用光解反应在微尺度上近乎瞬时地生成化学脉冲，旨在模拟细菌在自然环境中所遇到的多种营养脉冲，例如，下沉海洋颗粒后方羽流的扩散25，或裂解的浮游植物细胞释放营养物质的扩散过程26。
我们展示了该方法的两个应用：1）释放单个化学脉冲，以研究从均匀条件开始的细菌聚集−消散动态过程；2）释放多个脉冲，以表征非平衡营养条件下细菌的聚集特征。第一种应用特别适用于表征微生物首次接触营养源时的行为响应。在此类条件下，化学引诱剂分子浓度极低，趋化作用的早期阶段主要由化学引诱剂分子与趋化受体之间的随机结合−解离事件所主导17。我们的方法通过在无营养背景中快速且精确地释放已知质量的化学引诱剂，相较于以往方法在表征细菌在动态条件下的响应方面具有显著优势27,28...

微生物依赖于趋化性——即感知化学梯度并相应调整运动能力的过程1——来导航化学环境、接近营养源和宿主，并逃离有害物质。这些微尺度过程决定了微生物与其环境之间相互作用的宏观动力学特征2,3。近年来，微流控和微加工技术的进步，包括软光刻技术4，极大地提升了我们构建可控微环境以研究微生物相互作用的能力。例如，以往的研究通过生成高度可控、中等到高浓度营养物质的稳定梯度来研究细菌趋化性5,6。然而，在自然环境中，微尺度化学梯度往往是短暂存在的——会因分子扩散而迅速消散——且背景条件通常极为稀薄7。为了直接测量微生物群体在首次暴露于非稳态化学环境时的趋化反应，我们设计并在此描述了一种将微流控技术与光解作用相结合的方法，从而模拟野生细菌在自然环境中所遇到的化学梯度。
解笼技术利用光敏探针，将生物分子以失活形式进行功能性包封。通过照射释放被包封的分子，从而实现对特定生物过程的靶向干扰8。由于解笼技术能够快速、精确地调控细胞内的化学反应9，光解包封化合物的方法传统上被生物学家、生理学家和神经科学家用于研究基因10、离子通道11以及神经元12的激活。近年来，研究人员进一步利用光解技术的显著优势，开展趋化性研究13，分析单个细菌细胞在阶跃式趋化因子刺激下鞭毛切换的动力学特征14,15，以及探究单个精子细胞在三维（3D）浓度梯度中的运动模式16。
在本方法中，我们利用微流控装置内笼锁氨基酸的光解反应，研究细菌群体对受控化学脉冲的行为响应，这些化学物质通过光释放几乎瞬时获得。采用低倍率（4倍）物镜（数值孔径 NA = 0.13，焦深约 40 μm），既可在大视野（3.2 mm × 3.2 mm）下观察数千个细菌的群体聚集性响应，也可在单细胞水平上测量其运动行为。我们展示了该方法的两种应用：1）释放单个化学脉冲，以研究从均匀条件开始的细菌聚集−消散动力学；以及 2i）释放多个脉冲，以表征在时间变化、空间异质性趋化物条件下细菌的聚集动力学。该方法已在海洋细菌 Vibrio ordalii 向氨基酸谷氨酸趋化的过程中得到验证17，但该技术可广泛适用于不同物种与趋化物的组合，以及趋化以外的其他生物学过程（如营养摄取、抗生素暴露、群体感应等）。该方法有望帮助阐明微生物在真实环境中的生态与行为，并揭示单个细菌在应对短暂动态浓度梯度时所面临的潜在权衡。

<table><tbody><tr><td>(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 (APTES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td>&gt;98% 纯度，高毒性</td></tr><tr><td>CELLSTAR 管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210261</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>用于去除细菌培养物中的废培养基</td></tr><tr><td>数字培养箱 Incu-Line</td><td>VWR-CH</td><td>390-0384</td><td>用于烘烤 3D 母模</td></tr><tr><td>除尘枪</td><td>VWR-CH</td><td>16650-22</td><td>用于清洁晶圆和微通道</td></tr><tr><td>加热板</td><td>VWR-CH</td><td>444-0601</td><td>用于键合微通道</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>LightSafe 微量离心管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z688312</td><td>1.5 ml</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>用于图像分析和细菌追踪</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1.5 ml</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR-CH</td><td>631-1552</td><td></td></tr><tr><td>尼康 Eclipse TiE 显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA53100</td><td>配备电动载物台</td></tr><tr><td>MNI-谷氨酸</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1490</td><td>&gt;98% 纯度，光敏性</td></tr><tr><td>模具打印设备</td><td>Stratasys</td><td></td><td>Objet30 3D 打印机</td></tr><tr><td>模具打印服务</td><td>3D Printing Studios</td><td>定制</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.3dprintingstudios.com/&quot; target=&quot;_blank">https://www.3dprintingstudios.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Nanodrop One 紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>用于校准解笼反应</td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>显微镜成像软件</td></tr><tr><td>鼓风干燥箱 Venti-Line</td><td>VWR-CH</td><td>466-3516</td><td>用于烘烤 PDMS（强制对流）</td></tr><tr><td>光刻胶 SU-8-3050</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU8-3050</td><td></td></tr><tr><td>等离子体处理腔 Zepto</td><td>Diener Electronic</td><td>ZEPTO-1</td><td>用于键合前表面功能化</td></tr><tr><td>聚碳酸酯膜</td><td>Sterlitech</td><td>PCT0447100</td><td>孔径 0.4 &amp;micro;m，开孔面积 19%，厚度 24 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>聚乙烯微管</td><td>Scientific Commodities</td><td>BB31695-PE/2</td><td>内径 × 外径：0.015&quot; × 0.043&quot; / 0.38 mm × 1.09 mm</td></tr><tr><td>聚苯乙烯培养皿</td><td>VWR-CH</td><td>25373-100</td><td>底部表面（90 mm × 15 mm），用于键合毫流控装置</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>VWR-CH</td><td>611-2605</td><td>用于称量 PDMS 混合物</td></tr><tr><td>sCMOS 相机 Andor Zyla</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>用于相差显微镜和荧光显微镜（最高 100 fps）</td></tr><tr><td>海水盐</td><td>Instant Ocean</td><td>产品编号 SS1-160p</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks 2015</td><td>Dassault Systemes SolidWorks</td><td></td><td>用于设计模具</td></tr><tr><td>Spectra X 光源引擎</td><td>Lumencolor</td><td></td><td>用于 395 nm LED</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>110-41-155</td><td>PDMS 硅弹性体套件；固化剂</td></tr><tr><td>注射器（鲁尔锁）</td><td>B Braun Omnifix</td><td>4616308F</td><td></td></tr><tr><td>注射器针头</td><td>Agani</td><td>A228</td><td>适用于 10 至 30 ml</td></tr><tr><td>注射泵 11 Pico Plus Elite</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4506</td><td>Terumo Agani 23 号针头，5/8 英寸（16 mm）</td></tr><tr><td>VeroGrey</td><td>Stratasys</td><td></td><td>双通道注射泵</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>模具材料</td></tr></tbody></table>

生成可控的动态化学环境以研究微生物行为

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

我们展示了一种生成可控、动态化学脉冲的方法——在微尺度上使局部趋化引诱物突然释放，从而为微生物趋化性实验构建微环境。为了产生化学脉冲，我们开发了一套系统，通过在含有细菌悬浮液的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控腔室内对“笼锁型”氨基酸进行光解，实现氨基酸源近乎瞬时的引入。我们将该方法应用于趋化性细菌Vibrio ordalii，该菌可在这些动态化学梯度中主动上行迁移，并通过视频显微镜进行追踪。氨基酸经光可解保护基团化学修饰后处于生物学惰性状态（“笼锁”），在悬浮液中均匀存在，但在被突然释放前无法被细菌利用；释放过程通过近紫外A波段（UV-A）聚焦LED光束在用户指定的时间和空间位置触发。脉冲中释放的分子数量可通过曝光时间与脱笼比例之间的校准关系确定，其中光解后的吸收光谱采用紫外-可见光谱（UV-Vis）进行表征。可在微流控装置中集成纳米多孔聚碳酸酯（PCTE）膜，以便通过流动持续清除脱笼后的化合物及耗尽的培养基。通过将PCTE膜涂覆3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液，再对需键合的表面进行等离子体活化，可实现PCTE膜与PDMS微流控结构之间牢固且不可逆的键合。由计算机控制的系统可在不同位置以不同强度生成用户自定义的脉冲序列，从而构建具有特定时空变异性的资源分布图景。在每一种化学景观中，均可获取细菌个体尺度的运动动态及其在群体水平上的聚集行为，从而实现对趋化性能的量化分析，并研究其在生态相关环境中对细菌聚集的影响。

我们使用微流控和毫流控装置（图1）研究细菌在动态营养条件下的聚集特性。通过相差显微镜记录细菌群体在光解释放化学脉冲后的聚集-消散动态视频，从中提取细菌运动轨迹（图2 和 图3）。通过对数百万条轨迹进行平均，获得了径向漂移速度和细菌浓度的时空动态数据。在独立实验中，通过更高空间和时间分辨率的观测，获得了无化学梯度条件下细菌游动行为的统计特征（图4）。
<img alt="用于细菌密度测量与分析的PDMS和PCTE膜微流控装置设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60589/60589fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：在动...

本文介绍了一种在微流控和毫流控装置内通过光解反应生成动态化学梯度环境的实验方案。该方法适用于研究多种生物学过程，包括微生物在单细胞水平和群体水平上的运动行为、营养摄取以及对化学物质的适应性。

我们展示了一种生成可控、动态化学脉冲的方法——其中局部趋化因子在特定位置突然释放并可供细胞响应……

该方法可用于阐明微生物在动态化学梯度中移动时的微尺度生态学特征与行为，揭示其在生态学相关微环境中的隐性权衡、营养动力学及种群动态。通过将微流控技术与光解作用相结合，我们可生成受控的化学脉冲，使局部化学引诱物在微尺度上突然释放，从而测量微生物种群在首次暴露于非稳态化学梯度时的趋化反应。使用计算机辅助设计（CAD）软件设计通道结构，并将其打印至透明胶片上以制作光刻掩模。根据手稿在洁净室中通过软光刻技术制备母版。在40毫升烧杯中，按10:1的比例将弹性体与其固化剂混合，制备PDMS混合物。使用塑料刮刀充分搅拌，直至液体均匀。立即将PDMS混合物置于室温下的真空腔中脱气45分钟。为加快脱气进程，可周期性释放真空，以破裂在界面处形成的气泡。使用加压清洁器清除母模表面的灰尘。然后将脱气后的PDMS混合物倒入模具上，在80摄氏度的烘箱中烘烤两小时。用刀片在距离微结构约五毫米处切割PDMS，然后小心地将PDMS从模具上剥离。打孔以作为微通道的入口和出口。用胶带密封微通道，以防止灰尘积聚。使用3D设计软件设计三维形状，并用高分辨率3D打印机打印PDMS模具的母模。按照之前的方法制备并脱气PDMS混合物后，用胶带轻拍母模表面以清洁之。将模具放在天平上。然后，避开模具的中央区域，倒入23.4克未固化的PDMS混合物，使PDMS高度达到0.5毫米，与模具高度一致。使用压缩空气去除残留的气泡。将PDMS铸型置于模具上，放入45摄氏度的烘箱中至少烘烤12小时。随后，轻轻剥离固化的PDMS层，并打孔作为进样口和出样口，用于注入细菌悬液。用氧气等离子体分别对培养皿表面和PDMS模具表面处理两分钟以进行活化。通过轻轻按压将PDMS模具键合到培养皿上，避免按压模具特征结构所在区域。将键合有PDMS三维模具的培养皿置于45摄氏度的烘箱中，至少加热12小时，以增强化学键合强度。接下来，在室温下将纳米多孔聚碳酸酯膜置于氧气等离子体腔中活化一分钟。在化学通风橱内，使用聚丙烯管将市售的3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液用去离子水稀释至体积比1%。将稀释后的3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液转移至培养皿中，并将活化后的膜浸入该溶液中反应20分钟。然后，用镊子将膜从3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中取出，放置在洁净室擦拭纸上晾干。为了制备将位于膜上并用于清洗细菌区域的PDMS微流控通道，请重复此前进行单化学脉冲实验时的微流控装置制备步骤。将PDMS清洗通道与功能化膜键合时，首先将PDMS清洗通道和聚碳酸酯膜在氧气等离子体腔体中处理两分钟以进行活化。等离子体处理后立即轻轻按压PDMS清洗通道使其与功能化膜接触。务必轻柔地将PDMS与膜压合，否则膜可能会不可逆地粘附到200微米高PDMS微通道的顶部。随后，将已键合的PDMS清洗通道-聚碳酸酯膜层压结构以及先前键合到培养皿上的3D PDMS模具一同放入氧气等离子体腔室中处理两分钟，以进行活化。将膜夹在两层PDMS之间并压合。将键合好的培养皿置于45摄氏度的烘箱中至少12小时，以增强化学键合。开始时，将微流控腔室置于真空条件下20分钟。然后，将含有微流控腔室的培养皿放置在显微镜载物台上。使用移液器，通过膜下方的入口向腔室内加入稀释的细菌悬液，该悬液为含GFP荧光的鱼肠道败血症弧菌（Vibrio ordalii）悬浮于人工海水中、并含有1毫摩尔浓度的4-甲氧基-7-硝基吲哚啉基笼锁-L-谷氨酸（4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamate）溶液。在用细菌悬液充满通道后，用纸巾吸去多余的液体，并通过轻轻按压将PDMS塞子插入孔中，密封入口和出口。用含1毫摩尔4-甲氧基-7-硝基吲哚啉基笼锁-L-谷氨酸的人工海水溶液填充注射器，并将管路连接至膜上方灌流通道的入口和出口。将管路连接至废液储液罐，并确保管路完全浸没在液体废液储液罐中，以避免压力振荡。将注射泵的流速设置为50微升每分钟。启动注射泵，使膜上方的洗涤通道建立流动。启动控制LED光束和显微镜载物台的软件，并在不同位置以不同强度生成用户自定义的脉冲序列。使用4倍物镜，在数小时内定期以固定时间间隔记录视频，并覆盖多个相邻位置，以观察较大区域。本研究中，采用微流控和毫流控装置研究细菌在动态营养条件下的趋化反应及聚集特征。最大强度投影显示了脉冲释放后0.5秒内以及脉冲释放后40秒时细菌的位置，细菌位置以白色轨迹表示。脉冲释放60秒后，细菌的运动轨迹以黑色显示。阴影区域表示在视野中心于零秒时通过光解作用释放的化学脉冲，随后该脉冲发生扩散。此处展示了细菌浓度以及在视野中心释放脉冲后径向漂移速度的时间动态变化。漂移速度的负值对应于朝向脉冲中心的定向趋化运动。此处展示了在无化学梯度条件下细菌群体的游动统计结果。轨迹表示细菌在微通道中三维运动的二维投影。测得的细菌游动速度概率分布通过伽马分布进行拟合。从细菌的运动轨迹中提取了连续重新定向之间时间的概率分布。利用生物体的重新定向模式、游动速度分布以及重新定向统计特征，构建了一个基于个体的模型。该方法已在海洋细菌 Vibrio ordalii 向氨基酸谷氨酸进行趋化运动的实验中得到验证，但所提出的方法可广泛适用于不同物种与趋化物的组合，以及更广泛的生物学过程，例如在空间异质且动态变化条件下种群与群落的动态研究。在微生物生态学和微生物学中，传统的技术（如分批培养或恒化器培养）在很大程度上忽略了微生物生境的空间-时间特征。通过光解在微尺度上近乎瞬时地产生化学脉冲，旨在模拟海洋细菌在自然环境中从多种来源遇到的营养脉冲类型，例如下沉有机颗粒后方羽流的扩散，或裂解的浮游植物细胞释放的营养物质扩散。氨基硅烷溶液具有强烈毒性，必须极其小心地操作和处理。我们仅在通风橱内操作，并穿戴实验服、护目镜和手套等防护装备。同时，我们也会妥善处理所产生的废弃物。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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光遗传学对微生物代谢的控制为发酵过程提供了灵活的动态调控手段。本方案展示了如何在不同体积规模下建立蓝光调控的发酵系统，用于化学品和蛋白质的生产。...

光控发酵用于微生物化学品与蛋白质生产

本文描述了一种制备简单模型生态系统的方案，该系统可重现好氧甲烷氧化细菌自然生境中存在的甲烷-氧气逆向梯度，从而能够在空间分辨的背景下研究其生理特性。同时还介绍了对常见生化检测方法的改进，以适用于基于琼脂糖的模型生态系统。...

基于琼脂糖的甲烷-氧气逆梯度培养甲烷氧化菌的模型生态系统

我们介绍一种用于毫流体连续培养装置（MCCD）的实验方案，该装置可在恒定的低营养条件下（低至数百纳摩尔浓度）或在分钟时间尺度上的动态营养波动条件下培养细菌群体。...

用于研究的连续培养毫流体装置 大肠杆菌 在低且波动的营养条件下

学习利用微流控技术与光解技术生成受控动态化学脉冲，研究微生物趋化行为与种群动态。该方法可揭示微生物在生态相关微环境中的营养动力学与适应性权衡。

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