生成受控动态化学景观，研究微生物行为

该方法可以阐明微尺度生态学和微生物在动态化学梯度中的行为，并揭示其在生态相关微环境中的隐性权衡、营养动力学和种群动态。通过将微流体技术与光解相结合，我们生成受控化学脉冲，其中局部化学反应物在微尺度上突然可用，以测量微生物群首先暴露在不稳定的化学梯度下的化学反应。使用 CAD 软件设计通道，并打印到透明胶片上以创建照片蒙版。

根据手稿，在洁净的房间里用软光刻制作主人。在 40 毫升烧杯中，以 10 比 1 的比例将弹性体与固化剂结合，准备 PDMS 混合物。用塑料刀，大力混合，直到液体是均匀的。

立即在真空室中脱气 PDMS 混合物，在室温下 45 分钟。为了加快过程，定期释放真空，以打破接口上形成气泡。使用加压清洁剂清除主机表面的灰尘。

然后将脱气的PDMS混合物倒入主炉上，在80摄氏度的烤箱中烘烤两小时。在大约 5 毫米的距离内，用刀片切割 PDMS，然后小心地从主结构上剥下 PDMS。打孔作为微通道的入口和出口。

用胶带密封微通道，防止灰尘积聚。使用 3D 设计软件设计 3D 形状，并使用高分辨率 3D 打印机打印 PDMS 模具的主形状。在准备和脱气 PDMS 混合物之前一样，通过用胶带涂抹清洁母体表面。

将母版放在刻度上。然后，在避开主的中央区域的同时，倒入 23.4 克未处理的 PDMS 混合物，以便通过将主主的高度与 0.5 毫米的高度相匹配，获得所需的 PDMS 高度。借助压缩空气清除任何剩余的气泡。

将 PDMS 在 45 摄氏度的烤箱中放入主机上，烘烤至少 12 小时。然后，轻轻剥离硬化的PDMS层，并打孔入口和出口孔，用于注射细菌悬浮液。使用氧气等离子体激活培养皿表面和 PDMS 模具两分钟。

将 PDMS 模具粘合在培养皿上，轻轻将模具压在培养皿上。避免按要素的位置。将培养皿粘合到 PDMS 3D 模具中，在 45 摄氏度的烤箱中至少 12 小时，以加强化学粘结。

接下来，在室温下在氧离子室中激活纳米聚碳酸酯膜一分钟。在化学罩下，使用聚丙烯管将三氨基丙基三氧硅烷在去维化水中的商用溶液按体积稀释至1%。将稀释的3氨基丙基三氧硅烷溶液转移到培养皿中，将活性膜浸入3-氨基丙基三氧硅烷溶液中20分钟。

然后，用钳子从3氨基丙基三氧硅烷溶液中去除膜，放在洁净室擦拭干燥。对于位于膜上的PDMS微流体通道的制造，允许清洗细菌竞技场，重复制造微流体装置进行单化学脉冲实验，如以前一样。要将 PDMS 洗涤通道与功能化膜粘合，请首先使用氧等离子室激活 PDMS 洗涤通道和聚碳酸酯膜两分钟。

血浆处理后，通过轻轻将 PDMS 洗涤通道轻轻压到膜上，将功能化膜和 PDMS 洗涤通道接触。轻轻压在一起 PDMS 和膜非常重要，否则膜可能会不可逆转地粘合到 200 微米高度 PDMS 微通道的天花板上。然后，激活粘合层压 PDMS 洗涤通道聚碳酸酯膜和以前粘合到 Petri 盘的 3D PDMS 模具，将其放入氧气等离子室两分钟。

将膜夹在两个 PDMS 层之间，然后一起按压。将培养皿粘合到烤箱中的三明治结构中，在 45 摄氏度下至少 12 小时，以加强化学粘结。首先，在真空下保持毫流体室20分钟。

然后，将含有毫流体室的培养皿放在显微镜舞台上。使用移液器，在人工海水中用一毫摩尔4-甲氧-7-硝基丁醇-笼-L-谷氨酸溶液中GP-荧光Vibrio ordalii的稀释细菌悬浮液填充膜下方的腔室。用细菌悬浮液填充通道后，用纸巾多吸溶液，用 PDMS 插头密封进气口和插座，轻轻将其压入孔中。

将注射器填充为一毫摩尔4-甲氧-7-硝基丁醇-笼-L-谷氨酸的人工海水溶液，并附在膜上方洗涤通道的入口和出口上。将油管连接到废物储液罐，并确保油管完全浸入液体废物储液罐中，以避免压力振荡。将注射器泵上的流量设置为每分钟 50 微升。

启动注射器泵，以建立膜上方洗涤通道中的流量。启动控制 LED 光束和显微镜阶段的软件，并在不同位置和强度生成用户定义的脉冲序列。在数小时和多个连续位置使用 4 倍目标以覆盖大型表面的常规时间间隔录制视频。

在这项研究中，微流体和毫流体装置用于研究动态营养条件下的细菌化疗反应和积累特征。最大强度预测显示细菌位置，由白色痕迹指示，在脉冲释放后 0.5 秒的间隔内和脉冲释放后 40 秒。在脉冲释放后60秒，细菌轨迹也以黑色显示。

阴影区域表示光解在视场中间时间零秒释放的化学脉冲，随后扩散。此处显示了细菌浓度，以及视场中心脉冲释放后径向漂移速度的时间动力学。漂移速度的负值对应于向脉冲中心定向的化学运动。

在没有化学梯度的情况下，这里提供了细菌种群的游泳统计数据。轨迹表示微通道中三维细菌运动的二维投影。测量的细菌游速的概率分布由伽马分布拟合。

从细菌轨迹中，提取了连续方向之间时间的概率分布。利用调整方向模式、游泳速度分布和生物体的重新定向统计为个体模型提供信息。这种方法已经测试在海洋细菌Vibrio ordalii对氨基酸谷氨酸进行化疗，但建议的方法广泛适用于不同的物种和化学跟踪物组合，以及化学外的生物过程，如空间异构和动态条件下的人口和社区动力学。

微生物生态学和微生物学的经典技术，如批量培养或化疗的生长，在很大程度上忽视了微生物生境的时空特征。通过光解在微尺度上近乎瞬时地产生化学脉冲，旨在从各种来源再现海洋细菌在野外遇到的营养脉冲类型，例如，在下沉的有机颗粒背后的羽状物扩散，或从开水浮游植物细胞传播的养分。氨基硅烷溶液毒性极重，应格外小心处理。

我们仅在烟罩下工作，并佩戴防护设备，如实验室外套、安全护目镜和手套。我们还负责处理产生的废物。