通过顺序毛细管辅助组装对微生物和微粒进行图案化

我们提出了一种技术，该技术在微流体平台中使用毛细管辅助组装，将悬浮在液体中的微尺寸物体（例如细菌和胶体）图案化为聚二甲基硅氧烷衬底上的规定阵列。

这种方法允许在微流体通道内产生用户定义的微生物模式。一旦被模式化，就可以监测微生物，以评估它们的长期生理学和高通量的相互作用。毛细管力的使用可实现非特异性的图案化路线，这适用于不同类别的材料。

例如，胶体颗粒和细菌。此外，它允许产生大型阵列，并精确控制感兴趣材料的空间排列。迄今为止，我们测试并将该方法应用于胶体颗粒和微生物细胞。

因此，它可以在材料工程和需要定量单细胞分析的领域（如药物筛选）中找到应用。首先，通过将弹性体与其交联剂混合来制备PDMS混合物。然后用力搅拌混合物，使两种组分均匀混合，直到形成气泡并且PDMS混合物看起来不透明。

现在，在真空干燥器中对混合物进行脱气，直到所有气泡都被除去，混合物看起来又透明了。为了获得400微米厚的微流控芯片模板地板，将三克混合物倒在硅主板上，并将硅母模放在旋转涂布机上，以21倍G旋转涂覆5秒，54倍G旋转涂覆10秒。如前所述，再次脱气以去除被困的气泡。

将20克PDMS混合物倒入3D打印模具中，制成微通道，该微通道将用作微流控芯片的顶部，并如前所述将其脱气30分钟。将硅晶圆和3D打印模具在70摄氏度下烘烤至少两个小时，然后沿着3D打印模具的轮廓切割PDMS并将其剥离。在微通道周围用刀片切割PDMS，并打孔，这些孔将用作微流体通道的入口和出口。

现在，切割PDMS并将其从硅母板上剥离，并将PDMS层切割成更小的碎片，其微流体通道的尺寸相同，这些微流体通道将粘合在模板顶部。使用1%洗涤剂溶液轻轻擦拭模板和微孔五分钟，然后用去离子水冲洗。接下来，用异丙醇冲洗模板和微通道，然后用去离子水冲洗它们。

现在，在室温下用压缩空气在一个酒吧中干燥模板和微通道一分钟。将模板和微通道置于等离子清洗机中，粘合表面朝上。打开等离子清洗机后，等离子体处理模板和微通道40秒，然后从等离子清洗器中取出，并立即将微通道粘合在模板顶部。

将微流控芯片储存在70摄氏度的烘箱中五天，以确保PDMS疏水回收。在实验当天，在实验前几个小时将盒式培养箱设置为37摄氏度，然后在显微镜台上设置注射器泵和加热的玻璃板，设置与盒式培养箱相同的温度。实验前90分钟，将微流控芯片放入装有100%乙醇的容器中，用100%乙醇冲洗通道至少10分钟，然后将微流控芯片置于真空干燥器中并脱气至少30分钟。

现在将乙醇与蒸馏水交换，并对芯片进行至少30分钟的真空处理。将微流控芯片放入70摄氏度的烤箱中10分钟，以除去通道中残留的任何液体痕迹。将一毫升MOPS培养基移入离心机小瓶中，加入10微升0.132摩尔磷酸钾。

将100微升过夜培养物等分到离心机小瓶中，并以2，300倍G离心培养物两分钟。轻轻丢弃上清液，将沉淀重悬于一毫升新鲜MOPS培养基中，其中含有0.015%的吐温20和0.01%的磷酸钾，并将细菌悬浮液装入一毫升注射器中。要固定注射器和管道连接，请直接将针头插入管道。

现在将注射器安装在注射器泵上，并通过位于通道上游部分的入口将悬浮液注入微流体芯片中，直到悬浮液用陷阱覆盖模板区域。将注射泵设置为每分钟0.07至0.2微升的流速，以抽出细菌悬浮液并通过显微镜软件监测图案化过程。一旦模板被细胞图案化，增加退出流速以快速清空微流体通道，并用先前脱气至少30分钟并在30摄氏度下预热的新鲜LB冲洗它。

现在，将注射泵设置为每分钟两微升的流速，以轻轻冲洗通道。一旦通道被填满，再次增加流速。以所需的放大倍率和时间间隔获取细菌生长的图像。

将900微升的0.015%吐温20水溶液移液到离心机小瓶中，然后将100微升的原始胶体悬浮液移入其中。以13，500倍G离心悬浮液一分钟，并用吐温20水溶液轻轻地替换上清液。将胶体悬浮液装入一毫升注射器中，并通过微流体管将注射器连接到芯片上。

通过位于通道上游部分中央部分的入口将悬浮液注入微流控芯片中，并逐渐推动悬浮液直到模板被覆盖。以每分钟0.07至0.2微升的流速取出胶体悬浮液，并通过显微镜软件对图案化过程进行成像。一旦半月板快速到达模板的末端，就增加流速。

利用直通道几何形状来图案化荧光大肠杆菌菌株的固定相位细胞，沉积5， 000个分析陷阱中的83%。图案细菌在通道充满新鲜LB后的1.5小时内的不同时间恢复生长。一旦恢复生长，单个细菌细胞开始形成单个菌落，这些菌落膨胀直到形成表层并且单细胞分辨率丧失。超过55， 000个捕集器的分析表明，在分析的捕集器中，分别有93%和89%的捕集器形成了由两微米和一微米直径颗粒制成的绿红色二聚体。

绿-红-绿修剪器在52%的陷阱中形成。图案化粒子之间的距离可以通过在相反方向上进行两次沉积来精确控制，从而在每个陷阱的两端捕获这些粒子。重要的是要确保整个模板的温度均匀，以防止在图案化过程中冷凝。

为此，我们在模板下方放置一个加热的玻璃板，并将其设置为与盒式培养箱相同的温度。该方法可用于涉及定量单细胞分析的各种生物学研究。一个独特的优势是其高通量特性，允许对数千个细胞进行模式化，在同一实验领域内提供大量统计数据。