胃肠道有机体遗传工程的通用高效电穿孔协议
2020年2月18日
该协议描述了一种有效的电穿孔方法，用于转染四个不同胃肠道有机体实体，其质粒较大（范围为10 kB）。它可以在一天内执行，不需要大量准备或特殊的，成本密集型电穿孔缓冲器。
此方法能够有效转染 3D 细胞培养物，如器官。可以促进基因工程的各种应用。该协议是通用的，可以在一天内执行。
它不需要大量制备或特殊的、成本密集型的电穿孔缓冲液。这种转染方法在肿瘤和健康的器官中得到证明，但也可以适应球体和二D细胞培养。如果首次执行此协议，重要的是小心处理器官，因为它们的个体增殖和对分离的反应。
在整个过程中，对它们进行微观监控。首先在37摄氏度的温度下预热48孔板，用于电穿孔后播种，然后根据手稿方向准备基底和有机培养特定的介质。在48孔板中培育5口有机体，每井制备230微升分离试剂，每孔10微摩尔Y-27632。
在显微镜下监测器官。从井中去除培养介质，在准备好的分离混合物中机械分离有机体。将每个电穿孔样品的五口水池入一个 15 毫升管中。
通过涡旋混合管内的内容，在37摄氏度下孵育5至15分钟，直到出现10至15个细胞的簇，用显微镜检查分离。无需抗生素，就加入多达10毫升的基础介质，从而停止消化。将管子在450倍g下离心5分钟，丢弃上经剂，用四毫升电穿孔缓冲液清洗细胞两次。
每次洗涤后，离心机并丢弃上经剂。洗涤后，用30微克质粒DNA将有机体颗粒重新在100微升电穿孔缓冲液中。将完整的DNA-有机混合物分配到电穿孔盒中。
确保避免气泡。设置文本手稿中描述的电穿孔参数，然后用手指轻点电池以轻轻混合细胞。将保素放入保素室，然后按电穿孔器上的阻抗按钮，记下阻抗值。
按"开始"按钮启动电穿孔程序，并控制显示的电流、电压和能量的值。电穿孔后，立即在细胞中加入500微升无抗生素培养剂，通过上下移液混合。将样品转移到新的15毫升管中，用基底介质冲洗库维特，收集剩余的细胞，然后在室温下孵育细胞40分钟。
将细胞以450倍g离心5分钟，然后丢弃上看液。将颗粒重新在100微升的地下室基质中，将20微升的颗粒滴在预预热的48井板中。在37摄氏度下孵育板10分钟进行聚合，并添加250微升培养基，每井补充Y-27632和CHIR99021。
要确定转染效率，请在 24 至 48 小时后在显微镜下检查转染控制中的荧光。对于 FACS 分析，收集上述细胞并消化 10 到 20 分钟，直到单个细胞存在。加入多达10毫升的PBS，以450倍g离心细胞5分钟，然后吸气并丢弃上一代。
要区分活细胞，将颗粒重新在PBS的一毫升中，并加入合适的抗体或碘化钠。在黑暗中敲击并孵育细胞，轻轻混合细胞30分钟。孵育后，用10毫升PBS清洗细胞，然后离心并丢弃上经剂。
将细胞颗粒重新悬浮在 200 微升 PBS 中，并通过 100 微米滤株将悬浮液过滤到 FACS 管中。使用适当的浇注策略使用 FACS 机器分析细胞，并确定转染效率。四个不同癌症实体的有机体至少使用30微克的小质粒或大质粒进行电位分。
他们在电穿孔后48小时用流式细胞分析，并进行了细胞形状、单细胞、活细胞和eGFP表达的封闭分析。在所有四个器官实体中，小质粒的转染效率都高于较大的质粒。在具有92.1%GFP阳性细胞的PDAC器官中，小质粒的最有效的转染， 而大质粒的转染效率为46.7%较大的质粒更高效地转染成CRC器官，平均效率为53.4%，而小质粒的转染效率为84.3%，转染最困难的实体是胃癌器官，这显示了两个质粒最低的转染效率。
作为概念证明，人类正常的胃器官被电穿孔与质粒编码的Cas9，GFP和2sgRNA针对TP53。克隆由 Nutlin3 管理选择，TP53 淘汰通过等位基因的测序得到确认。正如我们用人类胃器官演示的，高效的电穿孔使各种CRISPR Cas9基操作器官培养物，如敲除或敲孔，因此可以模拟不同的疾病。
概述
本协议描述了一种用于将较大质粒转染胃肠道类器官的高效电穿孔方法。该方法快速，不需要复杂的准备或昂贵的缓冲液。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 基因工程
背景
- 类器官等3D细胞培养的转染具有挑战性。
- 需要有效的方法进行基因操纵。
- 该协议适用于各种类器官类型。
- 在操作过程中，对类器官的小心处理至关重要。
研究目的
- 开发一种可靠的类器官电穿孔方法。
- 促进类器官培养中的基因工程应用。
- 评估不同类器官类型的转染效率。
使用的方法
- 类器官解离和电穿孔混合物的制备。
- 使用特定参数进行质粒DNA的电穿孔。
- 通过荧光和FACS分析监测转染效率。
- 在类器官中应用CRISPR-Cas9进行基因编辑。
主要结果
- 观察到较小质粒的转染效率更高。
- PDAC类器官对小质粒的效率最高。
- 胃癌类器官的转染率最低。
- 在正常胃类器官中成功展示了基因编辑。
结论
- 电穿孔方法对各种类器官类型有效。
- 它能够有效地进行疾病建模的基因操纵。
- 未来的应用可能包括更广泛的基于CRISPR的技术。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient genetic engineering of patient-derived gastrointestinal organoids is critical for translational disease modeling and target validation in early drug discovery. This universal electroporation protocol enables rapid, reproducible transfection of diverse organoid types, supporting high-confidence functional genomics and CRISPR-based manipulation. The method streamlines genetic perturbation workflows, reducing technical barriers and accelerating preclinical hypothesis testing across oncology and regenerative medicine portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust genetic perturbation of organoids for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by facilitating CRISPR-mediated knockout and knockin studies.
- Improves predictive confidence in disease-relevant 3D models for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, genetically modified organoids for downstream phenotypic screening.
- Delivers reproducible transfection efficiencies quantified by FACS, supporting assay reliability.
- Facilitates scalable preparation of engineered organoid systems for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Enables modeling of patient-specific mutations and disease states in organoid cultures.
- Provides continuity from discovery-stage genetic manipulation to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Supports alignment with translational biomarkers through precise genome editing.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling seamless transition from genetic hypothesis testing to functional validation in disease-relevant organoid systems.
- Discovery Biology: Facilitates rapid null hypothesis testing and pathway interrogation in 3D models.
- Screening: Provides reproducible, quantitative transfection outputs for assay development.
- Analytics: Delivers FACS-based efficiency metrics for cross-condition comparison and optimization.
- Translational Research: Bridges engineered organoid models to preclinical disease studies and biomarker exploration.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable protocol for diverse organoid and spheroid systems across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with minimal preparation and no need for specialized buffers.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and enhances capital efficiency by enabling rapid genetic manipulation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture and handling to ensure viability and reproducibility.
- Needs access to standard electroporation equipment and FACS analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of gating strategies and transfection efficiency metrics.
- Adaptable to various organoid types and potentially to spheroids and 2D cultures with protocol adjustments.
- Efficiency may vary by organoid entity and plasmid size, requiring empirical optimization.
