通用且高效的胃肠道类器官基因工程电穿孔方案

该方法可实现类器官等三维细胞培养物的高效转染，有助于开展多种基因工程应用。该实验方案具有普适性，可在一天内完成。

该方法无需复杂的准备工作或特殊且成本较高的电穿孔缓冲液。此转染方法已在肿瘤和正常类器官中得到验证，但也可调整用于球状体及二维细胞培养。若首次进行本实验方案，需谨慎操作类器官，因其各自对解离处理的增殖能力和反应可能存在差异。

在整个操作过程中通过显微镜持续观察。首先将48孔板在37摄氏度预热，用于电穿孔后的接种；然后根据论文中的说明配制基础培养基和类器官培养特异性培养基。每份电穿孔样品在48孔板中培养五个孔的类器官，每孔准备230 µL含10 µM Y-27632的消化试剂。

在显微镜下观察类器官。从孔中移除培养基，并在预先配制的解离液中通过机械法解离类器官。每五个孔的类器官合并为一个电穿孔样品，收集至一个15毫升离心管中。

通过涡旋振荡混匀管内物质，并在37摄氏度孵育5至15分钟，直至出现由10至15个细胞组成的细胞团簇，期间用显微镜检查解离情况。加入最多10毫升不含抗生素的基础培养基以终止消化反应。将管子以450 × g离心5分钟，弃去上清液，并用4毫升电穿孔缓冲液将细胞洗涤两次。

每次洗涤后，离心并弃去上清液。洗涤结束后，将类器官沉淀重悬于含有30微克质粒DNA的100微升电穿孔缓冲液中。将完整的DNA-类器官混合物转移至电穿孔比色皿中。

务必避免产生气泡。按照文稿中所述设置电穿孔参数，并用手指轻弹电击杯以轻轻混匀细胞。将电击杯放入电击杯室，按下电穿孔仪上的阻抗按钮，记录阻抗值。

按下启动按钮以开始电穿孔程序，并监控显示的电流、电压和能量数值。电穿孔后，立即向细胞中加入500微升不含抗生素的培养基，通过上下吹打混匀。将样品转移至新的15毫升离心管中，用基础培养基冲洗电穿孔杯以收集残留的细胞，随后在室温下孵育细胞40分钟。

将细胞在450 × g离心5分钟，弃去上清液。用100 µL基底膜基质重悬细胞沉淀，在预热的48孔板中每孔接种20 µL液滴。于37 °C孵育10分钟以促进凝胶聚合，每孔加入250 µL含有Y-27632和CHIR99021的培养基。

为确定转染效率，在转染后24至48小时于显微镜下观察转染对照组的荧光情况。进行FACS分析时，按照前述方法收集细胞，并消化10至20分钟，直至形成单细胞悬液。加入最多10毫升PBS，于450 × g离心5分钟，随后吸除并弃去上清液。

为了区分活细胞，将沉淀重悬于1毫升PBS中，并加入适当的抗体或碘化丙啶。轻轻敲击混匀细胞，在室温下避光孵育30分钟。孵育结束后，用10毫升PBS洗涤细胞，然后离心并弃去上清液。

将细胞沉淀重悬于200 µL PBS中，并通过100 µm细胞筛过滤至FACS管中。使用FACS仪器并采用适当的设门策略分析细胞，测定转染效率。四种不同癌症类型的类器官均使用30 µg小质粒或大质粒至少进行了三次电穿孔处理。

电穿孔48小时后，通过流式细胞术对细胞进行分析，并根据细胞形态、单细胞、活细胞及eGFP表达情况进行设门。在所有四种类器官中，小质粒的转染效率均高于大质粒。小质粒在胰腺导管腺癌（PDAC）类器官中的转染效率最高，GFP阳性细胞达92.1%；而大质粒的转染效率为46.7%。大质粒在结直肠癌（CRC）类器官中的转染效率更高，平均效率为53.4%，而小质粒的平均转染效率为84.3%。胃癌类器官是最难转染的类器官类型，两种质粒的转染效率均为最低。

作为概念验证，将编码 Cas9、GFP 和靶向 TP53 的两条 sgRNA 的质粒通过电穿孔导入人正常胃类器官中。通过添加 Nutlin3 筛选克隆，并对等位基因进行测序以确认 TP53 基因敲除。正如我们在人胃类器官中所展示的，高效的电穿孔技术可实现类器官培养中多种 CRISPR-Cas9 基因编辑操作，例如基因敲除或敲入，从而构建不同疾病的模型。