一种用于肠道类器官慢病毒转导及下游分析的实验方案

本实验的总体目标是从原代小鼠肠上皮组织生成稳定转导的类器官，用于后续的肠道类器官分析。该目标的实现分为两个步骤：首先，用慢病毒包装载体和携带目的基因的慢病毒质粒共转染 HEC 293T 细胞，以产生高滴度的慢病毒颗粒；第二步，用多种生长因子预处理培养的小鼠肠道类器官，以获得囊状高增殖性的隐窝结构。

接下来，用高滴度的慢病毒感染类器官，并将感染后的类器官在基质胶中孵育。最后一步是将完全生长的感染类器官包埋于石蜡中，用于后续免疫组织化学分析。最终，慢病毒类器官转导技术可用于在体外构建可靠、可重复且快速的肠道上皮模型，并实现遗传修饰。

与现有的癌细胞系等方法相比，该技术的主要优势在于类器官具有非突变的、保留完整干细胞层级结构的特性。在体外培养中，它能够分化为小肠上皮中的所有不同类型细胞。此外，通过转导的类器官可用于研究特定的遗传元件，从而在成本和实验周期方面优于转基因小鼠的应用。

慢病毒颗粒的制备是一个为期五天的实验流程，首先将HEK 293T细胞以60%至80%的汇合度接种于162平方厘米的细胞培养瓶中，使用细胞培养基进行培养。将细胞在37摄氏度、湿润的细胞培养箱中孵育过夜。第二天，按照方案文本所述，分别制备DNA转染溶液和聚乙烯亚胺（PEI）转染溶液。

将DNA转染溶液加入PEI溶液中，涡旋混匀或颠倒数次，室温孵育5分钟。将2毫升DNA转染液与PEI的混合溶液滴加至HEK 293T细胞中，37°C孵育4小时。孵育4小时后，

更换培养基。在第4天，将细胞在37摄氏度下继续培养两天以去除PEI，收集上清液至50毫升离心管中。向细胞中加入新的培养基，将培养瓶放回培养箱，将收集的上清液在500 ×g下离心5分钟。

为了去除死细胞，使用一个60毫升的大注射器将上清液通过0.45微米的滤器。将过滤后的上清液在4摄氏度下保存过夜，次日收集。离心并过滤第二批上清液，操作步骤与第一批次相同。

将两批上清液合并至超速离心管中。在50,000 ×g条件下离心90分钟。离心结束后，极为小心地取出装有超速离心管的容器，并将其放入超净工作台中。

打开装有超速离心管的胶囊，小心倾倒培养基，使沉淀位于管的上侧。务必记住沉淀在管壁的哪一侧形成，因为病毒沉淀可能难以观察。接着，使用微量移液器去除残留的少量培养基，注意不要扰动超速离心管底部侧面可见的不透明棕褐色沉淀。

将该沉淀重悬于500 µL添加了烟酰胺激酶抑制剂和poly brain resus的类器官培养基中。此培养基中的悬浮至关重要，因为高滴度病毒将在转导前两天直接用于类器官的转导。将一个完整的0.95 cm²类器官培养孔分割至一个新的48孔板孔中。

按照先前发表的方案进行操作。目标是在类器官培养中获得约50个小型类器官。培养基中添加糖原合成酶激酶抑制剂和烟酰胺。

为了获得囊性增生性隐窝，将类器官在转导当天培养两天，然后用 P 1000 微量移液器收获类器官。将基质胶和培养基反复吹打，从而破坏混合物。

将混合物放入15毫升离心管中。使用移液枪进一步吹打混匀，移液枪的远端开口已通过熔化缩小。以100 ×g离心5分钟，使类器官沉淀。然后吸除上清液，加入500 µL预热的1×胰蛋白酶，重悬类器官，37°C孵育3分钟。

在37摄氏度水浴中，加入3.5毫升细胞系培养基以终止胰蛋白酶活性，随后在500 ×g条件下离心5分钟。弃去上清液，保留含有约20微升培养基的沉淀。将类器官连同此少量培养基转移至培养孔中。

在48孔板中，将先前制备的高滴度慢病毒加入转导培养基中，与类器官混合并重悬。在37摄氏度培养箱中孵育类器官与病毒的混合物1小时，以允许转导发生。1小时后，向类器官-病毒混合物中加入1毫升类器官培养基，重悬后转移至微量离心管中，在850 ×g条件下离心5分钟。

为了沉淀类器官，移除上清液并重悬沉淀物。取20 µL冰冻的Matra胶，将液滴置于培养板孔的中央。在37°C条件下孵育15分钟。

液滴在15分钟后凝固。小心加入250 µL类器官培养基，培养基中添加烟酰胺和激酶抑制剂。

将铝块置于70摄氏度的培养箱中预热，以保持石蜡处于液态。从长满类器官的单个孔中移除培养基，保留包埋的类器官完整，然后直接向孔中加入1毫升4%多聚甲醛（Paraformaldehyde）的PBS溶液。用1毫升PBS替换多聚甲醛溶液。

将固定的类器官重悬于 PBS 中，转移至玻璃小瓶。静置一分钟，使类器官沉降至底部。随后用移液器吸除 PBS，加入含有数滴伊红溶液的 70% 乙醇。

为了在包埋过程中持续观察类器官，将类器官置于室温下的70%乙醇中30分钟。用移液器小心吸除70%乙醇。由于呈粉红色的伊红染色，类器官可用肉眼观察。

用96%乙醇替换包埋液，并在室温下放置30分钟。随后依次将类器官通过70%乙醇、90%乙醇、96%乙醇、100%乙醇、100%乙醇、二甲苯和二甲苯。倒掉最后一次的二甲苯，向玻璃小瓶中倒入石蜡。

立即将小瓶放入预热至70摄氏度的铝块中，孵育30分钟。30分钟后，用预热的聚乙烯管或移液器更换为新鲜干净的石蜡。倒出石蜡，使用带有大开口的预热研钵或移液器，将类器官移入石蜡包埋模具中的液态石蜡层内。

用本生灯加热解剖针，尽可能将所有类器官移至石蜡包埋模具的中央。当类器官在模具中的位置满意后，轻微冷却模具以使石蜡层凝固。再倒入更多石蜡覆盖顶部以完成包埋块，并加入标准组织学包埋盒。

在此方案中，使用慢病毒对肠上皮类器官进行转导。正常的类器官生长为具有共享绒毛区域的隐窝绒毛结构，多个隐窝由此区域延伸而出。当这些类器官经GSK-3β抑制剂CHIR 99021处理后，在类器官转导后细胞增殖增加，隐窝结构变为囊状。

通过慢病毒介导的EGFP过表达，类器官可表达荧光EGFP，且无需进行可能用于提高转导效率的增强步骤（如接种或延长病毒感染时间），因为这些操作无法进一步提升本已很高的转导效率。随后，这些类器官可用于RNA相关技术和免疫组织化学分析。该代表性图像为小鼠肠道类器官切片，在固定前经BrdU孵育一小时，随后进行BrdU染色。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用慢病毒或逆转录病毒颗粒对原代肠上皮类器官进行转导。