协议的慢病毒转导与肠组织体下游分析

该程序的总体目标是从原代小鼠肠上皮产生稳定转导的类器官，用于肠道类器官的下游分析。这是通过首先用慢病毒包装载体和慢病毒质粒切割 HEC 2 93 T 细胞来实现的，编码目标基因以产生高滴度的慢病毒颗粒。第二步是用多种生长因子预处理培养的小鼠肠道类器官，以获得囊性高增生隐窝。

接下来，用高滴度慢病毒转导类器官，并在基质胶中孵育转导的类器官。最后一步是将完全生长的转导类器官包埋在石蜡中，用于下游免疫组织化学分析。最终，慢病毒类器官转导用于在可靠、可重复和快速的肠上皮体外模型中产生遗传改变。

与癌细胞系等现有方法相比，该技术的主要优点是类器官是未突变的置换干细胞层次结构。在文本细胞极化中，它可以分化成小肠上皮的所有不同细胞类型。此外，转导的类器官可用于研究特定的遗传元件，从而超过使用转基因小鼠以及成本和速度的各个方面。

慢病毒颗粒的生产是一个为期五天的方案，首先在细胞培养基中 162 平方厘米的烧瓶中将 HEC 2 93 T 细胞分裂至 60% 至 80% 的 co fluness。第二天，将细胞在 37 摄氏度的加湿细胞培养箱中孵育过夜。按照方案文本中的说明制备 DNA 转染溶液和聚乙烯胺或 PEI 转染溶液。

将 DNA 转染溶液加入 PEI 溶液中，涡旋或倒置多次，然后孵育 5 分钟。在室温下。将 2 mL DNA 转染加 PEI 溶液滴注到 HEC 2 93 T 细胞上，并在 4 小时后在 37 摄氏度下孵育 4 小时。

刷新培养基。要去除 PEI，请在第 4 天在 37 摄氏度下将细胞孵育两天，将上清液收集在 50 毫升试管中。向细胞中加入新的培养基，将培养瓶放回培养箱中，将收集的上清液以 500 G 离心 5 分钟。

要去除死细胞，然后使用 60 毫升大注射器将 SUPERNAT 推过 0.45 微米过滤器。第二天将过滤后的 supernat 在 4 摄氏度下储存过夜。收集离心机并过滤第二批上清液，如第一批所示。

将两批上清液混合在超速离心管中。以 50， 000 GS 离心 90 分钟。离心完成后，非常小心地取出含有超速离心管的胶囊，并将其放入层流罩中。

打开装有超速离心管的胶囊，小心地倒出培养基，将沉淀物倒入管的上侧。重要的是要记住管状上诉的哪一侧会形成，因为病毒丸可能难以可视化。接下来，使用微量移液器去除最后一点培养基，同时注意不要搅动超速离心管底部侧面可见的不透明棕色沉淀。

重新将此沉淀悬浮在 500 微升补充有烟酰胺激酶抑制剂和多脑复苏的类器官培养基中。在这种培养基中悬浮很重要，因为高滴度病毒将在转导前两天直接用于类器官的转导。将完整的 0.95 平方厘米的类器官孔分成 48 孔板的新孔中。

遵循先前发布的方案。目标是在类器官培养中获得大约 50 个小类器官。补充有糖原合成酶激酶抑制剂和烟酰胺的培养基。

获得囊性高增生隐窝。在转导当天用 P 1000 微量移液器将类器官孵育两天，收获类器官。上下移液 matra 凝胶和培养基，从而破坏混合物。

将混合物放入 15 毫升试管中。使用 PES 进一步破坏混合物 移液器，其中远端开口已通过熔化而减小 通过以 100 Gs 离心 5 分钟来沉淀类器官。然后去除 500 μL 预热的 1 x 胰蛋白酶的上清液，并重悬类器官，孵育 3 分钟。

在 37 摄氏度的水浴中，加入 3.5 mL 细胞系培养基离心机 5 分钟，使胰蛋白酶失活。在 500 Gs.去除超级苦蛋白，将沉淀物留在大约 20 微升的培养基中。将最后少量培养基中的类器官转移到孔中。

在 48 孔板上。将先前制备的高滴度慢病毒在转导培养基中加入到类器官中并重悬。将类器官病毒混合物在 37 摄氏度下在培养箱中孵育 1 小时，以便在 1 小时后转导，向类器官病毒混合物中加入 1 毫升类器官培养物、培养基，重悬，并将混合物转移到 850 GS 的微量离心管离心机中 5 分钟。

要沉淀类器官，请去除上清液并重悬沉淀。在 20 微升冰冷的 matra 凝胶中，将液滴放在孔的中间。在 48 孔板中，在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。

使液滴在 15 分钟后凝固。小心加入 250 微升类器官培养物。补充有烟酰胺和激酶抑制剂的培养基。

在 70 摄氏度的培养箱中预热铝块以保持石蜡液体。从含有完全生长的类器官的单个孔中取出培养基，保持包埋的类器官完好无损，并将 1 毫升 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液直接添加到孔中。用 1 毫升 PBS 代替多聚甲醛。

将固定的类器官重悬于 PBS 中，并转移到玻璃瓶中。让类器官沉到底部一分钟。接下来，吸出 PBS 并替换为 70% 乙醇，其中溶解了几滴 eoin 溶液。

为了在整个包埋过程中实现类器官的可视化，请将类器官在室温下置于 70% 乙醇中 30 分钟。小心移液除去 70% 乙醇。由于粉红色的 eoin 颜色，类器官可以通过肉眼看到。

用 96% 乙醇替换包埋溶液，并以这种方式在室温下放置 30 分钟。随后，将类器官通过 70% 乙醇、90% 乙醇、96% 乙醇、100% 乙醇、100% 乙醇、二甲苯和二甲苯。倒出最后的二甲苯洗涤液，将石蜡倒入玻璃瓶中。

立即将样品瓶放入 70 摄氏度的预热铝块中 30 分钟。30 分钟后，用预热的 PE 或移液管用新的干净石蜡更换石蜡。倒出石蜡，并使用预热害虫或带有大开口的移液管将类器官移液到石蜡块模具中，形成一层液体石蜡。

用本生灯加热解剖针，并尽可能地向石蜡块模具的中心纵所有类器官。当类器官在模具中的定位令人满意时，稍微冷却模具以固化石蜡层。通过在顶部倒入更多石蜡来完成块，并添加标准组织学包埋盒。

在该方案中，用慢病毒转导肠上皮的类器官。正常的类器官生长为 K 隐窝绒毛结构，其中许多隐窝来自共享的绒毛结构域。用 GSK 三 B 抑制剂 CHIR 9 9 0 21 处理这些类器官后，类器官转导后增殖增加，隐窝变成囊性。

使用慢病毒 EGFP 过表达，类器官表达荧光 EGFP 转导增强步骤，这些步骤可以在转导功效低时进行，例如接种或长时间的病毒孵育是不需要的，因为这些步骤不会增加已经很高的疗效。随后，这些类器官被加工用于 RNA 技术和免疫组织化学。该代表性图像是小鼠肠道类器官的切片，在固定前与 BRDU 孵育 1 小时后进行 BRDU 染色。

观看此视频后，您应该对如何使用慢病毒或逆转录病毒颗粒从原代肠上皮细胞转导类器官有很好的了解。