Name: 协议的慢病毒转导与肠组织体下游分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学习慢病毒转导技术用于原代小鼠肠道上皮类器官的稳定基因修饰，结合定量RT-PCR、RNA微阵列和免疫组织化学进行下游分析。该方法为研究肠道上皮生物学提供了可靠、可重复的体外模型。

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J. Heijmans 获得荷兰癌症基金会（KFW）提供的奖学金资助。G.R. van den Brink 获得欧洲研究理事会欧洲共同体第七框架计划（FP7/2007-2013）资助协议编号 241344 以及荷兰科学研究组织（GvdB）VIDI 项目资助。

1. 转染试剂聚乙烯亚胺（PEI）的制备
<ol>
	<li>将约150 mg的PEI溶解于100 ml的H2O中。</li>
	<li>逐滴加入HCl调节溶液pH至7.4，直至溶液变澄清，并持续搅拌至完全溶解，此过程可能需要10至60分钟，然后加水定容至终浓度为1 mg/ml。</li>
	<li>溶液澄清后，将PEI溶液经无菌0.22 µm滤膜过滤，分装为每份5 ml，于-80 °C冰箱中保存。</li>
</ol>
2. 慢病毒颗粒的制备
第1天：
<ol>
	<li>将HEK293T细胞以60%-80%的融合度接种于162 cm2培养瓶或大型培养皿中，培养基为细胞系培养液（DMEM，添加10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和2 mM谷氨酰胺补充剂）。</li>
</ol>
第2天：
<ol start="2">
	<li>通过将慢病毒包装载体（7 µg pVSVg；5 µg pRSV rev；13 µg pMDL）与20 µg编码目的基因或目的shRNA的慢病毒质粒混合，制备含45 µg总质粒DNA的DNA转染溶液。用DMEM调整体积至1 ml。</li>
	<li>将90 µl浓度为1 mg/ml的PEI加入930 µl DMEM中，制备PEI转染溶液，并在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>将DNA转染溶液加入PEI溶液中。涡旋振荡或反复倒置数次，室温孵育5分钟，以获得DNA转染复合物。</li>
	<li>将2 ml DNA转染溶液滴加至HEK293T细胞中，在37 °C、湿润的细胞培养箱中孵育4小时。</li>
	<li>4小时后更换培养基以去除PEI。添加新培养基前无需洗涤细胞。 
	注意：PEI具有细胞毒性，孵育时间超过4小时可能对HEK293T细胞造成损伤。</li>
</ol>
第4天：
<ol start="7">
	<li>弃去上清液，加入新鲜培养基。保留上清液（含有病毒），此上清液将在步骤 2.10 中使用。</li>
	<li>将上清液转移至 15 ml 离心管中。为去除死细胞，以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>使用较大的 60 ml 注射器将上清液通过 0.45 µm 滤膜过滤。于 4 °C 过夜保存。</li>
</ol>
第5天：
<ol start="10">
	<li>收集第二批上清液；按照步骤 2.8–2.9 进行离心和过滤。</li>
	<li>将步骤 2.9 和 2.10 中获得的上清液合并至超速离心管中，在超速离心机中以 50,000 × g 离心 90 分钟。</li>
	<li>非常小心地取出装有超速离心管的转头外壳，放入超净工作台中，并记住离心时离心管在转头中的方向。</li>
	<li>打开盛有超速离心管的转头外壳，小心倾倒上清液，使沉淀位于管的上方一侧。由于病毒沉淀可能难以观察，需记住沉淀形成于管的哪一侧。使用移液器小心吸除残留的上清液，注意不要扰动可见于超速离心管底部侧壁的不透明棕褐色沉淀。</li>
	<li>将该沉淀重悬于 500 µl 器官样培养基中，培养基中添加 10 mM 烟酰胺、10 µM Chir99021、10 µM Y27632 和 8 µg/ml 多聚素（polybrene）。使用该培养基重悬至关重要，因为需使用高滴度病毒直接转导器官样结构。</li>
	<li>可选步骤：将病毒在该培养基中分装为两份，每份 250 µl，于 -80 °C 冻存。</li>
</ol>
3. 类器官的慢病毒转导
第0天：
<ol>
	<li>在转导前两天，将一个完整的0.95 cm2培养孔中的类器官分种至新孔中，目标获得约50个小型类器官。类器官的分种操作请参照先前发表的方案1（图3A、B）。</li>
	<li>在类器官培养基中添加10 µM Chir99021和10 mM烟酰胺，以获得囊状高增殖性隐窝（图3C）。 
	注意：当新分种的类器官在含有Chir99021的条件下培养时，囊状隐窝的发育效果最佳。</li>
</ol>
第2天：
<ol start="3">
	<li>使用移液器反复吹打 Matrigel 和培养基，利用 1000 µL 微量移液器破坏类器官混合物，随后将混合物转移至 15 mL 离心管中。</li>
	<li>使用尖端开口经熔融缩小的巴斯德移液器进一步破坏类器官。在 100 × g 条件下离心 5 分钟，使类器官沉淀。 
	注意：离心速度需根据离心机型号进行调整。必须确定能够使破碎后的类器官与混合物有效分离的精确离心速度。</li>
	<li>弃去上清液，加入 500 µl 预热的 1× 胰蛋白酶溶液（相当于 0.25% 胰蛋白酶）。将类器官重悬于胰蛋白酶中，并在 37 °C 水浴中孵育 3 分钟。</li>
	<li>加入 3.5 ml 细胞系培养基（DMEM，添加 10% FCS、1% 青霉素/链霉素和谷氨酰胺）以终止胰蛋白酶反应。在 500 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，保留约 20 µl 培养基中的沉淀。将含有少量培养基的类器官转移至 48 孔板中的一个孔内。</li>
	<li>按照步骤 2.14 所述，在转导培养基中加入高滴度慢病毒，重悬后继续进行步骤 3.10。若转导效率较低，可增加步骤 3.9。 
	注意：为实现高效转导，通常向一个类器官孔中加入 250 µl 高滴度慢病毒的一份等分试样。这相当于本方案第 2 步所述单次制备所得慢病毒总量的 50%。</li>
	<li>可选：为提高转导效率，可进行自旋感染（spinoculation），即将含有类器官的 48 孔板置于预热至 32 °C 的离心机中，在 600 × g 条件下旋转 1 小时。</li>
	<li>将类器官-病毒混合物放入培养箱，在 37 °C 条件下孵育 1 小时，以促进转导过程。</li>
	<li>可选：为进一步提高转导效率，可在培养箱中继续于 37 °C 孵育类器官额外 3 小时。</li>
	<li>加入 1 ml 类器官培养基，重悬类器官-病毒混合物，转移至微量离心管中，在微量离心机中以 850 × g 离心 5 分钟，使类器官沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 20 µl 冰冷的 Matrigel 中。由于该材料在温度升高时会凝固，建议使用经多次反复吸取冰冻 PBS 预冷的枪头进行操作。</li>
	<li>将液滴置于 48 孔板每孔中央，在 37 °C 培养箱中孵育 15 分钟，使其凝固。</li>
	<li>15 分钟后，小心加入 250 µl 类器官培养基，并补充 10 mM 烟酰胺、10 µM Chir99021 和 10 µM Y27632。破碎后的类器官小片段将在 24 小时内形成小型囊状类器官。</li>
</ol>
第5天：
<ol start="16">
	<li>更换培养基，并添加筛选抗生素（使用嘌呤霉素时，浓度为 4 µg/ml）。</li>
</ol>
第7天：
<ol start="17">
	<li>更换为添加了筛选抗生素的标准类器官培养基。 
	注意：在撤除 Chir99021 后 2-3 周，出芽过程将完成。筛选后，类器官可在不含筛选抗生素的条件下培养。</li>
</ol>
4. 类器官RNA制备用于定量RT-PCR或微阵列分析
<ol>
	<li>进行RNA制备时，按照试剂盒生产商的说明书使用商业试剂盒。移除类器官的培养基，直接向含有类器官的Matrigel半球中加入350 µl含β-巯基乙醇的RLT缓冲液。使用P1000移液器吹打重悬材料。</li>
	<li>根据生产商说明书继续完成后续RNA制备步骤。</li>
	<li>可选：使用Ovation Pico WTA系统进行扩增以提高RNA得率，初始需加入总量为50 µg的RNA，具体操作依据生产商说明书。</li>
	<li>可选：在进行RNA微阵列分析前，使用2100生物分析仪配合真核生物总RNA纳米芯片对样本进行质量控制检测，目标RNA完整性数值（RIN）应达到8.5或以上（图5），具体操作依据生产商说明书。</li>
</ol>
5. 类器官的石蜡包埋与免疫组织化学处理
<ol>
	<li>在开始类器官包埋前，将一个带有可容纳12 mm直径玻璃管孔洞的铝块放入70 °C的培养箱中预热，以保持石蜡处于液态。</li>
	<li>取一个含有完全生长的类器官的单孔，移除培养基，保留包埋的类器官完整无损。</li>
	<li>直接向孔中加入1 ml 4%多聚甲醛PBS溶液，并在4 °C下固定1小时至过夜。</li>
	<li>用1 ml冰冷的PBS替换多聚甲醛。 
	可选：此步骤后可将固定的类器官在4 °C下保存于PBS中，最长可达1周。</li>
	<li>将固定的类器官重悬于1 ml PBS中，并转移至玻璃小瓶中。</li>
	<li>让类器官静置沉降至底部约1分钟，弃去PBS，加入70%乙醇，并在其中溶解数滴伊红溶液，以便在包埋过程中可视化类器官。</li>
	<li>将类器官置于室温下的70%乙醇中。30分钟后，小心倾去70%乙醇，由于伊红染色呈现轻微粉红色，可肉眼观察到类器官。更换为96%乙醇。</li>
	<li>重复步骤5.7，每次更换为下一种试剂。依次使类器官经过以下溶液：70%乙醇、90%乙醇、96%乙醇、100%乙醇、100%乙醇、二甲苯、二甲苯。</li>
	<li>倾去最后一次二甲苯洗涤液，向管中倒入石蜡。立即将管放入预热至70 °C的铝块中，孵育30分钟，然后更换为新鲜干净的石蜡。</li>
	<li>倒出石蜡，使用预热的大口巴斯德吸管将类器官转移至石蜡包埋模具中。使用本生灯保持巴斯德吸管处于温热状态。将所有类器官置于液态石蜡的一薄层中。</li>
	<li>尽可能使用加热的解剖针将所有类器官调整至石蜡包埋模具的中心位置。使用本生灯保持解剖针温热。</li>
	<li>当类器官在模具中的位置满意后，轻微冷却模具以使石蜡层凝固。</li>
	<li>在顶部再倒入更多石蜡完成包埋块，并加入标准组织学包埋盒。</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+on+cell+proliferation+of+the+gastrointestinal+mucosa+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+B%2C+Cell+Pathology+Including+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin1%2C+a+novel+intestinotrophic+mitogen%2C+ameliorates+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+transgenic+epithelial+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC transgenic epithelial organoids.</a> PLoS One. 8 (10), e76871(2013).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li>
<li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li>
<li>Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+murine+leukemia+virus+DNA+depends+on+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.</a> The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).</li>
<li>Bahnson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+enhancement+of+retroviral+mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer.</a> Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本视频方案描述了利用慢病毒转导原代肠上皮类器官，并通过定量RNA技术及免疫组织化学方法对这些类器官进行下游分析的过程。
慢病毒转导通常在培养板中的贴壁细胞或悬浮细胞中进行。由于类器官具有三维结构，病毒颗粒难以穿透，因此常采用多种方法以提高转导效率。使用 Chir99021 预处理类器官可促进其增殖，从而提高转导后的存活率。胰蛋白酶消化后应保持较小的细胞簇，因为单个细胞的存活率较低。与使用小鼠逆转录病毒的转导相比，慢病毒转导效率更高，通常无需采用离心增强转导（spinoculation）技术，后者虽已被证明可提高胚胎干细胞中的转导效率10。当使用小鼠逆转录病毒或慢病毒转导效率较低时，可选择性地采用离心增强转导以提高转导率。我们通常不检测病毒滴度，因为所有来自单次制备的病毒均用于转导最多两个面积为 0.95 cm2 培养孔所获得的类器官。此外，通常会使用抗生素筛选以去除未转导的细胞。然而，当遇到转导效率问题时，检测病毒滴度可能具有参考价值。
与贴壁细胞相同，提高筛选抗生素的浓度可增加病毒...

肠上皮是体内增殖最迅速的组织之一，因此在癌症和干细胞研究领域引起了广泛关注。2009年，一种可在Matrigel中长期培养小肠隐窝并维持其三维结构的技术被发表1。这些被称为肠类器官的结构可通过标准技术进行培养，培养基中需添加多种明确的生长因子，包括Bmp信号通路抑制剂noggin（Nog）、Wnt信号通路增强剂rspondin 1（Rspo1）以及表皮生长因子（Egf），这些因子均被发现可促进肠上皮细胞的增殖2-4。
类器官在多个方面优于传统的癌细胞系，例如它们未发生突变，保留了干细胞层级结构，具有完整的细胞极性，并能分化为新生小肠上皮中所有类型的细胞谱系。由于类器官可通过转导携带外源基因或RNA干扰载体5，因此被广泛用于研究特定的遗传元件，在成本和实验速度方面优于使用转基因小鼠的研究。类器官中的转基因表达可通过小鼠逆转录病毒或慢病毒载体实现6,7。由于小鼠逆转录病毒仅能转导处于有丝分裂状态的细胞8，存在应用局限，因此对于类器官等难以感染的细胞，慢病毒转导更为常用。
经病毒转导并稳定表达转基因的类器官可用于多种下游分析，包括定量RNA分析和免疫组织化学。综上所述，由原代肠上皮细胞培养类器官已发展为一种常规技术，无需特殊实验室条件即可轻松实施，并已成为肠道上皮研究中细胞培养的新型标准。
在类器官中进行病毒转导及后续下游分析的技术操作繁琐耗时。为了辅助类器官实验，我们制作了本视频方案，展示对培养的类器官进行慢病毒转导的方法。我们还进一步说明了如何通过正确处理类器官以提高得率，从而增强基于RNA技术或免疫组织化学的下游分析效果。本方案中仅使用了源自小肠隐窝的类器官，但所述技术同样适用于结肠类器官。

<table><tbody><tr><td>聚乙烯亚胺</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>BD 356231</td><td></td></tr><tr><td>高级 DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>A9165-1G</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8045</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Y27632&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Lonza</td><td>BE02-007E</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma</td><td>P 7255</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基乙醇</td><td>Merck</td><td>8,057,400,0250</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Pico WTA 系统</td><td>NuGen</td><td>3300-12</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>玻璃小瓶，锥形，12&amp;nbsp;mm × 75&amp;nbsp;mm，5&amp;nbsp;mL</td><td>VWR</td><td>LSUKM12</td><td></td></tr><tr><td>伊红黄</td><td>VWR</td><td>1,159,350,025</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于肠道类器官慢病毒转导及下游分析的实验方案

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

被称为类器官的肠道隐窝-绒毛结构，在添加适当生长因子的条件下，可进行长期的三维培养。由于类器官在稳态干细胞分化、细胞极性以及终末分化细胞类型的组成方面均与原始组织高度相似，能够反映成年肠道上皮的所有已知特征，因此它们已成为上皮组织实验研究中的重要资源。利用慢病毒或逆转录病毒载体在类器官中表达外源基因或干扰RNA的技术，极大拓展了对肠道上皮及肠道干细胞进行功能分析的可能性，在速度和成本上均优于传统的转基因小鼠模型。在本视频方案中，我们展示了如何利用慢病毒载体对小肠类器官进行转导，具体示例包括使用多西环素诱导型外源基因或IPTG诱导型短发夹RNA，以实现基因过表达或基因敲低。此外，考虑到类器官培养所获得的细胞数量极少，且实验处理可能进一步减少细胞量，我们还详细说明了如何对类器官进行处理，以用于后续的定量RT-PCR、RNA微阵列分析和免疫组织化学检测。这些实现外源基因表达和基因敲低的技术，进一步提升了肠道类器官这一上皮结构在科研中的应用潜力，确立了类器官培养作为细胞培养的新标准。

类器官慢病毒转导
使用慢病毒颗粒进行类器官转导的技术依赖于在转导前后对类器官的正确处理。类器官（图 3A）经培养后被解离为单个隐窝结构（图 3B）。如先前报道，这些单个隐窝在存在GSK3抑制剂Chir99021的条件下培养时，会发育为囊状隐窝9（图 3C）。随后对类器官进行胰酶消化，以使病毒颗粒能够进入单个细胞。在使用慢病毒颗粒进行细胞转导时，可尝试多种方法以提高转导效率，例如离心增强转导（spinoculation）或延长与病毒颗粒的孵育时间。本研究使用高滴度的PGK-eGFP慢病毒，以便通过荧光显微镜观察转导效率。该质粒对类器官的转导效率很高，接近100%（图 4E, F）。因此，采用离心增强转导（图 4A, B）或延长与慢病毒颗粒孵育时间（图 4C, D）并未带来额外的提升效果。
...

在本视频方案中，我们将逐步讲解如何对原代肠上皮类器官进行慢病毒转导，并介绍这些培养物的后续处理及定量RT-PCR、RNA微阵列和免疫组织化学分析方法。

被称为类器官的肠隐窝-绒毛结构，在添加适当生长因子的情况下，可进行长期的三维培养。

本实验的总体目标是从原代小鼠肠上皮组织生成稳定转导的类器官，用于后续的小肠类器官分析。该目标的实现分为两个步骤：首先，用慢病毒包装载体和编码目的基因的慢病毒质粒共转染 HEC 293T 细胞，以产生高滴度的慢病毒颗粒；第二步，用多种生长因子预处理培养的小鼠肠类器官，以获得囊状高增殖性的隐窝结构。接下来，用高滴度的慢病毒转导类器官，并将转导后的类器官在基质胶中孵育。最后一步是将完全生长的转导类器官包埋于石蜡中，用于后续免疫组织化学分析。最终，慢病毒类器官转导技术可用于在体外构建可靠、可重复且快速的肠道上皮模型中实现遗传修饰。与现有的癌症细胞系等方法相比，该技术的主要优势在于类器官是未经突变的、具有正常干细胞层级结构的组织。在体外培养中，它能够分化为小肠上皮中的所有不同类型细胞。此外，通过转导的类器官可用于研究特定的遗传元件，从而在成本和实验周期方面优于转基因小鼠的应用。慢病毒颗粒的制备是一个为期五天的实验流程，首先将HEK 293T细胞以60%至80%的融合度接种于盛有细胞培养基的162平方厘米培养瓶中。将细胞在37摄氏度、湿润的细胞培养箱中孵育过夜。第二天，按照方案文本所述，分别制备DNA转染溶液和聚乙烯亚胺（PEI）转染溶液。将DNA转染溶液加入PEI溶液中，涡旋混匀或反复倒置数次，室温孵育5分钟。将2毫升DNA转染液与PEI的混合溶液滴加至HEK 293T细胞中，37°C孵育4小时。孵育4小时后，更换培养基。在第4天，将细胞在37摄氏度下继续培养两天以去除PEI，收集上清液至50毫升离心管中。向细胞中加入新的培养基，并将培养瓶放回培养箱。将收集的上清液在500 ×g下离心5分钟。为了去除死细胞，使用一个60毫升的大注射器将上清液通过0.45微米的滤器。将过滤后的上清液在4摄氏度下保存过夜，次日收集。离心并过滤第二批上清液，操作步骤与第一批次相同。将两批上清液合并至超速离心管中。在50,000 ×g条件下离心90分钟。离心结束后，非常小心地取出装有超速离心管的容器，并将其放入超净工作台中。打开装有超速离心管的胶囊，小心倾去上清液，使沉淀位于管的上侧。务必记住沉淀在管壁的哪一侧形成，因为病毒沉淀可能难以观察。接着，使用微量移液器小心吸除残留的少量上清液，注意不要扰动超速离心管底部侧面可见的不透明棕褐色沉淀。将该沉淀重悬于500微升类器官培养基中，培养基中需添加烟酰胺激酶抑制剂和poly brain resus。此重悬步骤至关重要，因为高滴度病毒将在转导前两天直接用于类器官的转导。将一个完整的0.95平方厘米类器官培养孔分种至48孔板中的一个新孔内。按照先前发表的方案进行操作。目标是在类器官培养中获得约50个小型类器官。培养基中添加糖原合成酶激酶抑制剂和烟酰胺。为了获得囊性增生性隐窝，将类器官在转导当天收获并继续培养两天。使用1000 µL移液器吸取类器官，反复吹打Matrigel与培养基混合物，从而破坏其结构。将混合物放入15毫升离心管中。使用移液枪进一步吹打混匀，移液枪的远端开口已通过熔化缩小。以100 ×g离心5分钟，沉淀类器官。然后吸除上清液，加入500 µL预热的1×胰蛋白酶，重悬类器官，并孵育3分钟。在37摄氏度水浴中，加入3.5毫升细胞系培养基以灭活胰蛋白酶，随后在500 ×g条件下离心五分钟。弃去上清液，使沉淀物保留于约20微升培养基中。将此少量培养基中的类器官转移至培养孔中。在48孔板中，将先前制备的高滴度慢病毒加入转导培养基后添加至类器官中并重悬。在37摄氏度培养箱中孵育类器官与病毒的混合物1小时，以允许转导发生。1小时后，向类器官-病毒混合物中加入1毫升类器官培养基，重悬后转移至微量离心管中，在850 ×g条件下离心5分钟。为了沉淀类器官，移除上清液并重悬沉淀物。取20微升冰上预冷的Matrigel，将液滴置于培养板孔中央。放入37摄氏度的48孔板中，孵育15分钟。液滴在15分钟后凝固。小心加入250 µL类器官培养基，培养基中添加烟酰胺和激酶抑制剂。将铝块置于70摄氏度的培养箱中预热，以保持石蜡处于液态。从长满类器官的单个孔中移除培养基，注意保持包埋的类器官完整，然后直接向孔中加入1毫升4%多聚甲醛PBS溶液。用1毫升PBS替换多聚甲醛溶液。将固定的类器官重悬于 PBS 中，并转移至玻璃小瓶。静置一分钟，使类器官沉降至底部。随后用移液器吸去 PBS，加入 70% 乙醇，其中溶解数滴伊红溶液。为了在包埋过程中持续观察类器官，将类器官置于室温下的70%乙醇中30分钟。用移液器小心吸除70%乙醇。由于呈粉红色的伊红染色，类器官可用肉眼观察。用96%乙醇替换包埋液，并在室温下放置30分钟。随后依次将类器官通过70%乙醇、90%乙醇、96%乙醇、100%乙醇、100%乙醇、二甲苯和二甲苯。倒掉最后一次的二甲苯，向玻璃小瓶中倒入石蜡。立即将小瓶放入预热至70摄氏度的铝块中，孵育30分钟。30分钟后，用预热的聚乙烯管或移液器更换为新鲜干净的石蜡。倒出石蜡，使用带有大开口的预热移液管或移液器，将类器官移入石蜡包埋模具中的液态石蜡层内。用本生灯加热解剖针，尽可能将所有类器官移至石蜡包埋模具的中央。当类器官在模具中的位置满意后，轻微冷却模具以使石蜡层凝固。再倒入更多石蜡完成包埋块，并加入标准组织学包埋盒。在此方案中，使用慢病毒对肠上皮类器官进行转导。正常的类器官生长为具有共享绒毛区域的隐窝绒毛结构，多个隐窝从该区域延伸而出。当这些类器官经GSK-3β抑制剂CHIR 99021处理后，在类器官转导后细胞增殖增加，隐窝结构变为囊状。通过慢病毒介导的EGFP过表达，类器官可表达荧光EGFP，当转导效率较低时，可进行增强转导的步骤；但在此模型中，由于转导效率已经很高，因此无需进行接种或延长病毒孵育等操作，因为这些步骤不会进一步提高转导效率。随后，这些类器官可用于RNA相关技术和免疫组织化学分析。该代表性图像为小鼠肠道类器官切片，在固定前经BrdU孵育1小时后进行BrdU染色。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用慢病毒或逆转录病毒颗粒对原代肠上皮类器官进行转导。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

协议的慢病毒转导与肠组织体下游分析

来源：Van Lidth de Jeude, J. F., 等. 肠类器官慢病毒转导及下游分析方案. J. Vis. Exp.

用于免疫组织化学分析的慢病毒转导小鼠肠道类器官的处理

本方案介绍了Lgr5阳性原代类器官的培养以及后续的逆转录病毒转导操作。该方法可实现由Cre诱导的外源转基因过表达或敲低，从而在新型模型中开展功能研究 体外 器官型 模型系统.

原代肠道类器官培养中逆转录病毒感染的视频方案

肠道类器官培养通常由完整的隐窝建立，无法实现对自我更新和分化过程的细胞特异性分析。本方案描述了分离纯化的干细胞（Lgr5+）和微环境细胞（潘氏细胞）的重建培养，这些细胞能够形成类器官，同时允许在培养前对其进行生化和遗传修饰，并开展功能分析。...

用于肠道干细胞与微环境细胞功能分析的类器官重建实验（ORA）

我们详细描述了以下操作步骤：1）利用磁性纳米颗粒高效构建用于慢病毒或逆转录病毒转导的肠道类器官；2）对经基因工程改造的类器官制备冷冻切片。该方法为高效调控类器官中的基因表达以研究其下游效应提供了有力工具。...

利用磁性纳米颗粒转导病毒载体对原代小鼠肠道类器官进行遗传工程改造以用于冰冻切片

本方案描述了如何从人肠道类器官的顶侧或基底侧进行感染，以利用单细胞RNA测序（scRNAseq）技术在单细胞水平上表征宿主与病原体之间的相互作用。...

在生物安全三级（BSL-3）条件下建立用于病原体感染与单细胞测序的胃肠道类器官模型

本方案提供了建立小鼠小肠类器官、从小鼠小肠固有层中分离1型固有淋巴细胞，以及在两种细胞类型之间建立三维（3D）共培养体系的详细操作步骤，用于研究肠上皮细胞与1型固有淋巴细胞之间的双向相互作用。...

小鼠小肠上皮类器官与固有淋巴细胞的共培养

在此，我们介绍一种用于生成大鼠肠道类器官并将其应用于多种下游实验的方案。大鼠常被作为首选的临床前模型，而稳定的肠道类器官系统填补了该领域对一种可靠的体外模型的需求。 体外 系统以配合 体内...

大鼠肠道类器官的生成与操作

本方案描述了一种在病毒感染的人肠道类器官中进行钙成像的方法，并提供了一种分析策略。...

利用基因编码钙指示剂对病毒感染的人肠道类器官单层进行活体钙成像

该方案结合了人类肠道类器官技术与单细胞转录组学分析，为此前尚未深入探索的肠道生物学提供了重要见解。...

利用人肠道类器官在单细胞转录水平研究小肠上皮

本文介绍了一种新颖的实验方案和试剂组合，旨在利用高内涵分析技术，对化合物和处理因素在神经元与星形胶质细胞共培养体系中的神经毒性效应进行高灵敏度检测。结果表明，高内涵分析技术是评估神经毒性的全新且富有前景的技术手段。...

一种用于神经毒性高内涵分析的神经元与星形胶质细胞共培养实验方法

学习慢病毒转导技术用于原代小鼠肠道上皮类器官的稳定基因修饰，结合定量RT-PCR、RNA微阵列和免疫组织化学进行下游分析。该方法为研究肠道上皮生物学提供了可靠、可重复的体外模型。

一种用于肠道类器官慢病毒转导及下游分析的实验方案

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