Name: 3D多色DNAFISH工具研究人类原细胞核结构 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 学习三维多色DNA FISH技术，用于可视化人类原代细胞核内多个基因组位点的相互作用与定位。该方法可在单细胞水平直接研究核结构，为基因调控和基因组学研究提供有力工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢意大利米兰国家分子遗传学研究所（Istituto Nazionale di Genetica Molecolare &#34;Romeo ed Enrica Invernizzi&#34;（INGM）成像中心）在3D多色DNA FISH图像采集过程中提供的技术支持，特别感谢C. Cordiglieri的协助。本研究工作获得了以下对B.B.的资助：EPIGEN意大利旗舰项目、法国肌病协会（AFM-Telethon，项目编号18754）以及意大利卫生部青年研究人员项目（GR-2011-02349383）。本研究工作还获得了以下对F.M.的资助：Cariplo基金会（青年项目，项目编号2018-0321）。

1. 使用缺口平移法进行DNA探针的制备与标记
<ol>
	<li>使用特定试剂盒（材料表）纯化和清洁细菌人工染色体（BACs）、质粒或PCR产物，用ddH2O重悬，通过琼脂糖凝胶电泳检测并定量。</li>
	<li>在0.5 mL低吸附DNA管中，根据表1混合所有试剂，对第1.1步获得的1.5−2 µg DNA进行切口平移反应，终体积为50 µL。 
	注意：直接标记的探针可提高信噪比。市面上有通过切口平移法使用不同Alexa荧光染料制备直接或间接标记探针的试剂盒。</li>
	<li>将切口平移反应混合物置于恒温混匀仪中，在16 °C孵育一定时间，具体时间取决于起始DNA材料的长度：PCR产物（每份2,000 bp的PCR产物混合物）孵育45分钟，BAC DNA和质粒则最长孵育4小时。</li>
	<li>通过2.2%琼脂糖凝胶电泳检测第1.3步生成的探针大小。 
	注意：最佳探针大小为&#60;200 bp（图1A）。
	<ol>
		<li>如果DNA消化不足，向反应体系中加入5 U DNA聚合酶I和0.05 U DNase I，在16 °C继续孵育1−2小时，随后重新检测。用0.5 mM EDTA（终浓度）终止反应。探针可储存于-20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>针对每次DNA FISH实验，根据探针来源的起始DNA材料沉淀相应量的探针：来自切口平移PCR产物的探针取200 ng，来自切口平移BAC的探针取100 ng，或来自切口平移质粒的探针取300 ng。加入ddH2O至终体积150 µL，20 µg未标记的鲑鱼精DNA，3.5 µg物种特异性Cot-1 DNA，3倍体积的100%乙醇，以及1/10体积的3 M乙酸钠（pH 5.2）。在-80 °C沉淀1小时。</li>
	<li>在4 °C以最大转速离心1小时，弃去上清液。用70%乙醇洗涤沉淀两次。</li>
	<li>将沉淀物溶于2 µL 100%甲酰胺（pH 7.0）中，在40 °C振荡30分钟（可能需要数小时），然后加入等体积的4x盐-柠檬酸钠（SSC）/20%硫酸葡聚糖。
	<ol>
		<li>配制20x SSC：将175.3 g NaCl和88.2 g柠檬酸钠溶于终体积为1 L的H2O中。高压灭菌、过滤并分装。 
		注意：对于多色DNA FISH实验，不同探针可共同沉淀，但可能相互退火的探针除外。在此类特定情况下，应分别处理，按探针数量比例分配第1.5−1.7步所述试剂进行沉淀和重悬。仅在甲酰胺中重悬后才将探针混合。若使用大于或小于10 mm的玻璃盖玻片，应根据载玻片面积按比例调整第1.5−1.7步所用试剂的体积。杂交探针可在-20 °C长期保存（最长可达两个月）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞固定、预处理和透化
注意：透化和去蛋白步骤是关键步骤。反应时间及试剂浓度很大程度上取决于细胞类型、细胞质丰度以及细胞核形态。
<ol>
	<li>人原代T淋巴细胞的细胞固定、预处理和通透
	 
	注意：本方案适用于细胞体积小、细胞核小且胞质含量少的细胞。
	<ol>
		<li>使用玻璃盖玻片（直径10 mm，厚度1.5H）。</li>
		<li>用ddH2O清洗玻璃，再用70%乙醇清洗，晾干。每孔24孔板使用一片玻璃。</li>
		<li>直接在玻璃上加入200 µL 0.1% 聚-L-赖氨酸（w/v）（材料表），形成液滴。注意保持液滴停留在玻璃表面，避免接触孔壁，孵育2−5分钟。小心移除液滴，让玻璃在室温下干燥30分钟。</li>
		<li>重复步骤2.1.3两次。</li>
		<li>直接在玻璃上加入200 µL悬浮细胞（2 × 106/mL，体外原代T淋巴细胞的PBS悬浮液），在室温（RT）下孵育30分钟，使细胞贴附。</li>
		<li>快速移除液滴，加入新配制的4%多聚甲醛（溶于PBS/0.1% TWEEN 20，pH 7.0，过滤），在室温下固定贴附的细胞10分钟。</li>
		<li>在室温下用0.05% Triton X-100/PBS（TPBS）洗涤三次，每次5分钟。在室温下用0.5% TPBS通透10分钟。</li>
		<li>进行RNase处理：在24孔板中每孔加入250 µL PBS和2.5 µL RNase混合液（材料表），37 °C孵育1小时。</li>
		<li>用PBS冲洗，加入20%甘油/PBS，在4 °C下过夜（ON）孵育。
		 
		注意：此步骤时间可从1小时至过夜。载玻片可在4 °C下保存于20%甘油/PBS中最多7天。</li>
		<li>在干冰上冷冻（15−30秒），在室温下逐渐解冻，然后浸入20%甘油/PBS中。重复步骤2.1.9三次。</li>
		<li>在室温下用0.5% TPBS洗涤5分钟。在室温下用0.05% TPBS洗涤两次，每次5分钟。在室温下用0.1 N HCl孵育12分钟。用2x SSC冲洗。</li>
		<li>在室温下用50%甲酰胺（pH 7.0）/2x SSC过夜（ON）孵育。
		 
		注意：孵育时间可优化并适当缩短。载玻片可在50%甲酰胺/2x SSC中保存数天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人原代成肌细胞的细胞固定、预处理和通透
	 
	注意：本方案适用于细胞体积大、胞质含量高的细胞。
	<ol>
		<li>在24孔板的盖玻片上，使用生长培养基（DMEM高糖培养基，含20%胎牛血清（FBS）、25 ng/mL成纤维细胞生长因子（FGF）、10 ng/mL表皮生长因子（EGF）、10 µg/mL人胰岛素、1×谷氨酰胺、1×青霉素/链霉素）直接培养人原代成肌细胞，至少24小时（达到50−70%汇合度）。
		 
		注意：为促进细胞贴附，可在接种前用明胶、胶原或聚-L-赖氨酸对盖玻片进行包被处理。</li>
		<li>用PBS换液冲洗2−3次。加入新配制的4%多聚甲醛，在室温下固定细胞10分钟。</li>
		<li>在室温下用0.01% TPBS洗涤三次，每次3分钟。在室温下用0.5% TPBS通透10分钟。</li>
		<li>进行RNase处理：在24孔板中每孔加入250 µL PBS和2.5 µL RNase混合液（材料表），37 °C孵育1小时。</li>
		<li>用PBS冲洗，加入20%甘油/PBS，在室温下过夜（ON）孵育。
		 
		注意：此步骤时间可从1小时至过夜。载玻片可在4 °C下保存于20%甘油/PBS中最多7天。</li>
		<li>在干冰上冷冻（15−30秒），在室温下逐渐解冻，然后浸入20%甘油/PBS中。重复此步骤三次。</li>
		<li>在PBS中洗涤三次，每次10分钟。在室温下用0.1 N HCl孵育5分钟。用2x SSC冲洗。</li>
		<li>在室温下用50%甲酰胺（pH 7.0）/2x SSC过夜（ON）孵育。
		 
		注意：孵育时间可优化并适当缩短。载玻片可在50%甲酰胺/2x SSC中保存数天。</li>
		<li>将保存在50%甲酰胺/2x SSC中的载玻片在2x SSC中平衡2分钟，然后在PBS中平衡3分钟。</li>
		<li>根据细胞类型，使用0.01 N HCl/0.0025%胃蛋白酶处理数秒至5分钟。在此步骤中，需在光学显微镜下观察细胞，一旦细胞核与胞质分离但仍保持完整结构（例如核仁仍清晰可见且完整），立即终止反应（步骤2.2.11）。</li>
		<li>用50 mM MgCl2/PBS洗涤两次，每次5分钟，以灭活胃蛋白酶。</li>
		<li>在1% PFA/PBS中后固定1分钟。在PBS中洗涤5分钟。在2x SSC中洗涤两次，每次5分钟，然后加入50%甲酰胺/2x SSC，孵育至少30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 3D 多色 DNA FISH 杂交
<ol>
	<li>在 80 °C 下使探针变性 5 分钟，然后迅速置于冰上。</li>
	<li>将杂交探针加样至洁净的显微镜载玻片上。将带有细胞的盖玻片细胞面朝下覆盖在探针液滴上。</li>
	<li>用橡胶胶水密封盖玻片，待橡胶胶水完全干燥后，将载玻片置于加热块上，在 75 °C 下变性 4 分钟。 
	注意：变性时间与温度可适当调整，最高可达 80 °C。</li>
	<li>在漂浮于水浴中的金属盒内，于 37 °C 过夜杂交。 
	注意：为提高信噪比，杂交温度可升至 42 °C。</li>
	<li>去除橡胶胶水，将载玻片浸入 2x SSC 溶液中，小心剥离玻璃盖玻片，并转移至 6 孔板中的 2x SSC 溶液内。</li>
	<li>在 37 °C、90 rpm 振荡条件下，于 2x SSC 溶液中洗涤 3 次，每次 5 分钟；随后在 60 °C、90 rpm 振荡条件下，于 0.1x SSC 溶液中洗涤 3 次，每次 5 分钟；最后用 4x SSC/0.2% TWEEN 20 溶液短暂漂洗。</li>
</ol>
4. 3D 多色 DNA FISH 检测
注意：对于直接标记的探针，跳过步骤 4.1 和 4.2。
<ol>
	<li>在24孔板中，加入4x SSC/0.2% TWEEN 20/4% 牛血清白蛋白（BSA），37 °C下封闭20分钟，置于摇床培养箱中，转速为20 rpm。</li>
	<li>加入适当浓度的抗地高辛抗体（1:150）和/或链霉亲和素（1:1,000）（材料表），用4x SSC/0.2% TWEEN 20/4% BSA稀释，在37 °C黑暗湿润环境中孵育35分钟。</li>
	<li>在6孔板中，用4x SSC/0.2% TWEEN 20于37 °C洗涤3次，每次5分钟，摇床培养箱中转速为90 rpm。</li>
	<li>用PBS平衡后，在24孔板中用2%甲醛/PBS于室温固定2分钟。 
	注意：直接标记的探针无需进行后固定。</li>
	<li>用PBS短暂洗涤5次。在室温下用1 ng/mL DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）/PBS染色5分钟。</li>
	<li>用PBS短暂洗涤5次。用抗荧光淬灭封片液（材料表）封片。</li>
</ol>
5. 三维多色DNA FISH显微镜观察与分析
<ol>
	<li>使用显微镜系统获取三维图像。 
	注意：此处使用的是宽场显微镜，连续光学切片之间的轴向距离为 0.2−0.25 μm（图 1B）。</li>
	<li>使用不同的软件和工具分析三维图像堆栈（本实验中使用 NuCLεD 或三维核接触定位器 Nuclear Contacts Locator in 3D）。 
	注意：NuCLεD 工具的开发旨在自动分析荧光细胞图像 z 堆栈中的三维多色 DNA FISH 数据。NuCLεD 可在三维空间中重建细胞图像堆栈中的细胞核，并检测和定位荧光三维斑点。该工具可测量斑点在细胞核内的相对位置（例如，距细胞核质心和/或细胞核边缘的距离）、每个细胞核的最大半径以及斑点间的距离。该工具及其所用算法在 Cortesi 等人16的研究中已有详细描述。</li>
	<li>分析由 NuCLεD 获取的数据（例如，特定基因组位点与细胞核质心之间的三维距离以及接触频率）。 
	注意：对于特定基因组位点与细胞核质心之间的三维距离，应将距离值根据每个细胞核的最大半径进行归一化处理，并以归一化距离的频率分布图表示这些数据。在长距离相互作用研究中，预期接触频率范围为 10−20%21，斑点间距离的阈值可能有所变化，通常设定在约 2 µm35。
	<ol>
		<li>为进行统计分析，每份生物学重复样本应分析约 100 个细胞核。将特定基因组位点间的三维距离表示为低于所选阈值距离的累积频率分布，并采用 t-检验评估分布差异的显著性。同时，计算相互作用阳性细胞核（即斑点间距离低于所选阈值距离）的百分比，并使用 Fisher 精确检验评估百分比差异的显著性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories%2C+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li>
<li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772(2016).</li>
<li>van Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).</li>
<li>Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+genome+organization+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial genome organization and cognition.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).</li>
<li>Pombo, A., Dillon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+genome+architecture%3A+players+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).</li>
<li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li>
<li>Therizols, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+decondensation+is+sufficient+to+alter+nuclear+organization+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells.</a> Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).</li>
<li>Gonzalez-Sandoval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear+Anchoring+of+H3K9-Methylated+Chromatin+Stabilizes+Induced+Cell+Fate+in+C.+elegans+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos.</a> Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).</li>
<li>Hubner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+nuclear+landscapes+during+human+myelopoietic+cell+differentiation+maintains+co-aligned+active+and+inactive+nuclear+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 47(2015).</li>
<li>Aymard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+long-range+contacts+unveils+clustering+of+DNA+double-strand+breaks+at+damaged+active+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).</li>
<li>Sellou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly%28ADP-ribose%29-dependent+chromatin+remodeler+Alc1+induces+local+chromatin+relaxation+upon+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).</li>
<li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li>
<li>Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+TADs%3A+How+Alterations+of+Chromatin+Domains+Result+in+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease.</a> Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).</li>
<li>Cortesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4q-D4Z4+chromatin+architecture+regulates+the+transcription+of+muscle+atrophic+genes+in+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy.</a> Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).</li>
<li>Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+divergence+of+regulatory+strategies+at+Hox+Loci+and+the+origin+of+tetrapod+digits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits.</a> PLoS Biology. 12 (1), 1001773(2014).</li>
<li>Woltering, J. M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrapod+axial+evolution+and+developmental+constraints%3B+Empirical+underpinning+by+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model.</a> Mechanisms of Development. 138, Pt 2 64-72 (2015).</li>
<li>de Laat, W., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3C-based+technologies+to+study+the+shape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">3C-based technologies to study the shape of the genome.</a> Methods. 58 (3), 189-191 (2012).</li>
<li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+decade+of+3C+technologies%3A+detailed+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li>
<li>Finn, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Heterogeneity+and+Intrinsic+Variation+in+Spatial+Genome+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization.</a> Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).</li>
<li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+chromatin+interactions+with+single-molecule+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision.</a> Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).</li>
<li>Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+on+tissue+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).</li>
<li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+three-dimensional+localization+microscopy+across+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes.</a> Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+genomic+loci+in+living+human+cells+by+an+optimized+CRISPR%2FCas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system.</a> Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).</li>
<li>Nelles, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+Tracking+in+Live+Cells+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9.</a> Cell. 165 (2), 488-496 (2016).</li>
<li>Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifaceted+FISH+approach+to+study+endogenous+RNAs+and+DNAs+in+native+nuclear+and+cell+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocol+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures.</a> Current Protocol of Human Genetics. , Chapter 4, Unit 4 15(2013).</li>
<li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+nuclear+positioning+of+the+monoallelically+expressed+astrocyte+marker+GFAP%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP.</a> Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).</li>
<li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).</li>
<li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).</li>
<li>Skinner, B. M., Johnson, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+morphologies%3A+their+diversity+and+functional+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance.</a> Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).</li>
<li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pluripotent+regulatory+circuitry+connecting+promoters+to+their+long-range+interacting+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements.</a> Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).</li>
<li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li>
<li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+super-resolution+imaging+of+chromosomes+and+in+situ+haplotype+visualization+using+Oligopaint+FISH+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes.</a> Nature Communication. 6, 7147(2015).</li>
<li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).</li>
<li>Samacoits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+framework+to+study+sub-cellular+RNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A computational framework to study sub-cellular RNA localization.</a> Nature Communication. 9 (1), 4584(2018).</li>
<li>Cardozo Gizzi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy-Based+Chromosome+Conformation+Capture+Enables+Simultaneous+Visualization+of+Genome+Organization+and+Transcription+in+Intact+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms.</a> Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).</li>
<li>Mateo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+DNA+folding+and+RNA+in+embryos+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution.</a> Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).</li>
<li>Nir, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Walking+along+chromosomes+with+super-resolution+imaging%2C+contact+maps%2C+and+integrative+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling.</a> PLoS Genetics. 14 (12), 1007872(2018).</li>
<li>Bintu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+chromatin+tracing+reveals+domains+and+cooperative+interactions+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方法介绍了一种在多种人类原代细胞上进行三维多色DNA荧光原位杂交（FISH）的逐步操作方案。尽管DNA FISH技术已被广泛应用，但由于所用样本的特性，许多实验室仍难以在保存完好的三维间期细胞核上成功实施三维多色DNA FISH23，24。
探针切口平移是成功实现三维多色DNA荧光原位杂交（FISH）的关键步骤；该反应可使用多种不同的模板（如BAC、fosmid、质粒、PCR产物），并可根据模板长度相应调整反应时间和酶浓度。适当的探针消化至关重要（图1），探针消化不当（图2）将导致无信号或非特异性信号（图3A）。通透化、去蛋白化和胃蛋白酶消化步骤是极为关键的操作环节，其条件选择高度依赖于所用的细胞类型。对于细胞核较小且细胞骨架含量较低的细胞（例如体外分离...

高等真核生物需要在微小的细胞核三维空间内系统性地压缩和致密化大量的遗传信息1,2,3,4。目前我们已知，基因组在空间上被组织成不同的区室和拓扑关联结构域5，DNA多层次的折叠可导致不同基因组区域之间形成相互作用，可能涉及染色质环的形成6,7。染色质的三维动态成环可影响多种生物学过程，如转录8,9、分化与发育10,11、DNA修复12,13，而其异常则与多种疾病14,15,16以及发育缺陷15,17,18相关。
已开发出多种方法用于研究三维基因组结构。基于染色体构象捕获的技术（C-技术，3C、4C、5C、Hi-C及其衍生技术）已被用于研究固定细胞中的基因组结构3,4,19,20。这些方法依赖于捕获在空间上邻近的基因组位点之间的相互作用频率。C-技术根据其复杂程度不同，可检测细胞群体中的全局三维基因组结构和细胞核拓扑结构3,4,19,20。然而，三维相互作用在时间和空间上具有动态性，在单个细胞之间表现出高度异质性，包含多重相互作用，且存在广泛的多样性21,22。
三维多色DNA荧光原位杂交（FISH）是一种可在单细胞水平上可视化特定基因组位点的技术，能够以与C技术互补的方式直接研究细胞核的三维结构。该技术目前常用于明确验证C技术所得结果。三维多色DNA FISH利用与目标基因组位点互补的荧光标记探针。通过使用不同的荧光染料以及合适的显微镜设备，可在细胞核空间内同时可视化多个靶标23,24。近年来，FISH已与显微镜技术的进步相结合，实现了高分辨率下精细结构的可视化25,26，或与CRISPR-Cas技术联用，实现活细胞成像中核酸的可视化27,28。尽管该技术已被广泛采用，但由于所用生物材料需要特殊处理，三维多色DNA FISH在许多实验室中仍被认为具有操作难度。
本文提供了一套完整的三维多色DNA荧光原位杂交（3D multicolor DNA FISH）实验方案，涵盖从细胞与探针制备到数据分析的全过程，适用于多种人类原代细胞，可实现多个基因组位点的可视化，同时保持细胞核的三维结构。为了研究细胞核结构，必须完整保留细胞核的三维构象。因此，与以往其他已有方案29,30,31不同，本方法避免使用酒精梯度脱水以及将盖玻片长期储存在酒精中，因为这些步骤可能影响染色质结构32。本方法基于已有的保留三维结构的DNA FISH方案24,33进行优化，适用于多种人类原代细胞，无论是体外分离的细胞还是体外培养的细胞。针对不同细胞核形态和细胞学特征（如核压缩程度不同、细胞骨架丰度差异等）34，本方案提供了相应的通透和去蛋白化参数。而这些参数在其他方案中通常仅被笼统描述24,33，缺乏针对不同类型细胞操作步骤的明确区分。此外，我们开发了一个名为NuCLεD（nuclear contacts locator in 3D）的专用分析工具16，提供了一套自动化数据分析原则，可更准确地评估不同基因位点之间的三维空间邻近性及其在细胞核空间内的拓扑分布。

<table><tbody><tr><td>24孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>抗地高辛素 488</td><td>DBA</td><td>DI7488</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Biotin 11 d-UTP</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0081</td><td></td></tr><tr><td>BSA（牛血清白蛋白）</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Marienfeld</td><td>117500</td><td></td></tr><tr><td>CY3 d-UTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53022</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精中的单链脱氧核糖核酸</td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖（粉末）</td><td>圣克鲁斯</td><td>sc-203917A</td><td></td></tr><tr><td>地高辛-11-dUTP</td><td>罗氏</td><td>11093088910</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21969-035 500mL</td><td></td></tr><tr><td>DNA聚合酶I</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>18010-017</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>AMPD1</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs（C-G-A-T）</td><td>Euroclone</td><td>BL0423A/C/G</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644.2MG</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>02860-1L</td><td></td></tr><tr><td>FBS Hyclone</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH30109</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sigma</td><td>F8775-25mL</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25030-024 100 mL</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516-100mL</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>人类 &lt;em&gt;Cot-1&lt;/em&gt; DNA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15279-001</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素人</td><td>Sigma</td><td>I9278-5 mL</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>NaAc（醋酸钠，pH 5.2，3 M）</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>158127-25G</td><td></td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲盐水）</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉亲和素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15070-063 100 mL</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶</td><td>伯乐（Biorad）</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>PhasePrep BAC DNA 试剂盒</td><td>Sigma</td><td>NA0100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>PureLink 快速胶回收 &amp;amp; PCR 纯化组合试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>K220001</td><td></td></tr><tr><td>PureLink 快速质粒小提试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>K210010</td><td></td></tr><tr><td>RNase 混合酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM2288</td><td></td></tr><tr><td>橡胶水泥</td><td>Bostik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR</td><td>631-0114</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素 Alexa Fluor 647</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S21374</td><td></td></tr><tr><td>三水合柠檬酸钠</td><td>Sigma</td><td>1110379026</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253-500g</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250mL</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100mL</td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究人类原代细胞核结构的3d多色dna fish技术

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

细胞生物学中的一个核心问题是基因组在细胞核空间内的组织方式，以及染色质结构如何影响基因表达、细胞身份和分化等过程。目前用于研究基因组三维结构的多种方法可分为两个互补的类别：基于染色体构象捕获的技术（C-技术）和成像技术。前者基于在固定细胞群体中捕获染色体构象及邻近DNA相互作用，而后者则基于在三维结构保存的细胞核上进行DNA荧光原位杂交（FISH），可在单细胞水平上同时可视化多个基因位点（多色），从而研究它们在细胞核内的相互作用和空间分布（三维多色DNA FISH）。三维多色DNA FISH技术的局限性在于只能可视化少数预先确定的基因位点，无法对细胞核结构进行全面分析。然而，鉴于其结果的可靠性，三维多色DNA FISH结合三维显微镜成像与图像重建，可作为验证基于C-技术结果的一种可行方法，并能够明确地在单细胞水平上研究特定基因位点的位置与组织方式。本文提出了一种适用于多种人类原代细胞的三维多色DNA FISH逐步操作方法，并详细讨论了在不同生物学背景下获得成功且具有信息量的三维多色DNA FISH实验所需的所有实际操作步骤、关键环节、三维成像概念及数据分析方法。

本文所述的三维多色DNA荧光原位杂交（FISH）方法可实现对固定三维细胞核内不同基因组位点的同时可视化（图1B）。该实验方案可用于测量等位基因之间以及不同基因组位点之间的距离，以评估其空间邻近性，并分析其在细胞核空间中的位置（例如，基因位点与细胞核中心或边缘的距离）16。然而，该方法在应用于不同细胞类型时，有许多关键步骤必须精确且针对性地优化；为确保三维多色DNA FISH实验成功，强烈建议特别关注以下步骤。
用于DNA探针制备时，检查探针大小是否合适 &lt;200 bp (图1A）。该尺寸可确保3D多色DNA FISH实验的成功进行（图1B）。通过缺口平移法产生的次优DNA FISH探针可进行部分消化（图2</s...

3D 多色 DNA FISH 是一种用于在三维保存的细胞核内可视化多个基因组位点的工具，能够在单细胞水平上明确界定这些位点在细胞核空间内的相互作用及其定位。本文介绍了一种适用于多种人类原代细胞的逐步实验方案。

用于研究人类原代细胞核结构的3D多色DNA FISH技术

细胞生物学中的一个核心问题是基因组在细胞核空间内的组织方式，以及染色质结构如何影响基因表达等生物学过程。

3D 多色 DNA FISH 技术能够在保存的细胞核内可视化多个基因组位点，从而在单细胞水平上模糊界定它们之间的相互作用和定位。3D 多色 DNA FISH 可直接用于研究细胞核结构。通常，该技术与基于染色体捕获的技术联合使用，使其成为在单细胞中验证 C 数据的有效工具。示范该实验步骤的是 Federica Marasca，她是我实验室的博士后。首先根据起始 DNA 材料的长度，将缺口平移反应混合物置于 16 摄氏度的恒温混匀仪中孵育。孵育结束后，在2.2%琼脂糖凝胶上检测探针的大小。每次DNA FISH实验中，根据探针所来源的起始DNA材料量，将适量探针沉淀：加入150 µL双蒸水、20 µg未标记的鲑鱼精子DNA、3.5 µg物种特异性的Cot-1 DNA、三倍体积的100%乙醇以及十分之一体积的3 mol/L醋酸钠，在-80 °C下孵育1小时。孵育结束后，在4 °C下以最大转速离心样品1小时。弃去上清液后，用500微升70%乙醇将沉淀洗涤两次。第二次洗涤后，在2微升100%甲酰胺中重悬沉淀，并在40摄氏度下振荡探针30分钟，然后加入等体积的含20%硫酸葡聚糖的4X柠檬酸钠盐水溶液。对于细胞核较小、胞质含量较少的小细胞进行固定前处理和通透时，首先将200微升PBS中的2×10⁶个细胞直接加入24孔板各孔中的玻璃盖玻片上，室温静置30分钟，使细胞沉降。孵育结束后，迅速将 PBS 替换为 300 微升新鲜配制的含 0.1% Tween 20 的 4% 多聚甲醛。10 分钟后，在室温下用 300 微升 0.05% TPBS 洗涤固定后的细胞，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。最后一次洗涤后，在室温下用 300 微升 0.5% TPBS 对 T 细胞进行 10 分钟的通透处理，随后每孔加入 250 微升用 PBS 按 1:100 稀释的 RNase 混合液，在 37°C 下处理 1 小时。孵育结束后，用 300 微升 PBS 洗涤细胞，每孔加入 300 微升含 20% 甘油的 PBS，于 4 摄氏度过夜孵育。次日早晨，将玻片置于干冰上 15 至 30 秒，使细胞快速冷冻，随后在室温下逐步解冻样本，并将其浸入 300 微升含 20% 甘油的 PBS 中 30 秒。按照上述方法再进行三次冻融循环后，用 300 微升含 0.5% TPBS 的溶液在室温下洗涤样本 5 分钟，随后用 300 微升含 0.05% TPBS 的溶液在室温下洗涤两次，每次 5 分钟。最后一次洗涤后，在室温下用 300 微升 0.1 N 盐酸处理细胞 12 分钟，随后用 300 微升柠檬酸钠盐溶液清洗两次。然后在室温下用含有 50% 甲酰胺的 2× 柠檬酸钠盐溶液 300 微升固定样品过夜。对于具有大量细胞质的大细胞的固定、预处理和通透，其固定、预处理和通透步骤可参照人原代 T 细胞的方法进行，并用 300 微升含 0.0025% 胃蛋白酶的 0.01 N 盐酸溶液处理样品，处理时间从数秒至五分钟不等。在光学显微镜下观察细胞，一旦细胞核与细胞质分离但核仁仍可见且完整时，立即用 300 微升 50 毫摩尔氯化镁溶液洗涤两次，每次五分钟，以终止反应。对于三维多色 DNA FISH，将杂交探针在 80 摄氏度下变性五分钟，随后立即将探针置于冰上。将探针加样至洁净的显微镜载玻片上，并将每张含有细胞的盖玻片分别置于探针液滴上。用橡胶胶水密封盖玻片边缘。待胶水完全干燥后，将样本置于75°C的加热块上变性。四分钟后，将样本置于37°C的水浴中，于金属盒内杂交过夜。第二天早晨，剥去橡胶胶水，并将载玻片浸入2X柠檬酸钠盐水中，小心取下盖玻片。将每张盖玻片放入六孔板的独立孔中，每孔加入2毫升新鲜柠檬酸钠盐水，在37摄氏度下以每分钟90转的速度振荡洗涤两次，每次5分钟。孵育结束后，用含0.2% Tween 20的4X柠檬酸钠盐水2毫升短暂冲洗盖玻片。进行三维多色DNA FISH检测时，将盖玻片转移至新的24孔板的各个孔中，在37摄氏度、20转/分钟的条件下，用300微升封闭缓冲液封闭非特异性结合位点，封闭20分钟。孵育结束后，在避光湿盒中，于37摄氏度下用适当浓度的抗地高辛素抗体和/或链霉亲和素（溶于封闭缓冲液）处理样本35分钟。孵育结束后，将样本转移至6孔板的各个孔中，用2毫升0.2% Tween 20和4×柠檬酸钠氯化钠溶液洗涤样本三次，每次5分钟，于90转/分钟振荡洗涤。最后一次洗涤后，将样品在2毫升PBS中平衡，然后将盖玻片转移至新的24孔板中，每孔加入300微升含2%甲醛的PBS溶液，在室温下后固定2分钟。用300微升PBS对固定后的细胞快速洗涤5次，随后在300微升PBS中加入终浓度为1纳克/毫升的DAPI进行染色，室温孵育5分钟。再用PBS将盖玻片洗涤5次，最后使用适当的封片剂封片。然后使用显微镜系统获取三维图像。三维多色DNA FISH技术可实现对固定三维细胞核内不同基因组位点的同步可视化。在DNA探针制备过程中，探针长度小于200个碱基对可确保三维多色DNA FISH实验的成功进行。通过缺口平移法产生的次优DNA FISH探针可能发生部分或过度消化。过度消化的探针会导致非特异性信号，原因是杂交特异性降低，从而引起背景信号增强。对于人类原代T淋巴细胞以及细胞核较小、胞质含量较少的小细胞，建议采用12分钟的0.1 N盐酸处理，以促进DNA探针进入细胞核，同时保持细胞核的完整性。对于小细胞，获得良好的DNA FISH信号无需进行细胞质消化。然而，对于人原代成肌细胞以及细胞核较大且细胞质丰富的细胞，胃蛋白酶消化步骤至关重要。若细胞骨架的胃蛋白酶消化时间过短或不充分，将阻碍探针进入细胞核，导致无法检测到DNA FISH信号。然而，如果细胞经胃蛋白酶处理过度，细胞核将无法保持完整，从而失去其三维结构。成功的三维多色DNA FISH应在细胞核内观察到信号。建议使用新鲜的生物样本，在进行三维多色DNA FISH前对探针进行测试，配制新鲜的溶液，并精确控制孵育时间和温度。请记住，甲酰胺和盐酸属于危险物质，必须始终在化学通风橱中使用，并佩戴适当的 disposable 材料。

3d-multicolor-dna-fish-tool-to-study-nuclear-architecture-human

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

3D多色DNAFISH工具研究人类原细胞核结构

本文介绍了在临床环境中应用于胚胎植入前遗传学诊断（PGD）的单细胞FISH探针选择、卵裂球细胞核铺展技术、原位杂交以及信号判读方法。...

用于胚胎植入前遗传学诊断的荧光原位杂交技术

染色体组学：利用新型OctoChrome FISH检测技术同时检测全部24条人类染色体的数目与结构异常

染色体组学, 染色体异常, FISH检测, OctoChrome, 人类染色体, 数目变异, 结构重排, 分子细胞遗传学, 染色体分析, 荧光原位杂交

本实验方案描述了一种用于可视化DNA损伤应答中被激活的DNA双链断裂信号蛋白及其在有丝分裂过程中定位的方法。...

活细胞中DNA损伤应答蛋白的二维与三维实时成像

从癌症患者血液中分离和表征循环肿瘤细胞（CTC）是一种非侵入性液体活检方法，与疾病复发和进展相关。本视频介绍了在医用导丝上捕获的CTC上进行DNA荧光原位杂交（DNA...

三维DNA荧光原位杂交：一种在染色体上定位特定基因的技术

本文介绍了一种同时检测组蛋白修饰和DNA序列的实验方案，该方法结合免疫荧光、DNA荧光原位杂交（DNA FISH），并进行三维显微成像与分析（3D 免疫-DNA...

结合免疫荧光与DNA FISH技术对三维保存的间期细胞核进行分析以研究三维核结构的变化

我们描述了一种利用直接标记的荧光探针，通过三维DNA荧光原位杂交（3D DNA...

使用直接标记探针的稳定3D DNA FISH方法

电子能谱成像能够在纳米级分辨率下对核酸与蛋白质进行成像并加以区分。该技术可与miniSOG系统结合使用，后者能够在透射电子显微镜样品中特异性地标记目标蛋白。本文以双链断裂修复灶为例，说明这些技术的应用。...

miniSOG标记的DNA修复蛋白与电子光谱成像（ESI）联合可视化

活体成像是一种强大的工具，可用于研究神经系统发育背后的细胞机制。本文介绍了一种利用延时共聚焦显微镜实时观察斑马鱼发育过程中大量多色Brainbow标记细胞的技术。...

利用Brainbow技术和活体斑马鱼延时共聚焦成像可视化大脑发育过程

本文描述了一种在完整卵膜内利用光片显微镜对早期斑马鱼胚胎进行成像的样品制备策略。该方法分析了胚胎在原肠胚形成70%期和胚芽期时于卵膜内所采取的不同方位，并详细阐述了如何利用光片显微系统在整个胚胎范围内获得细胞尺度分辨率的成像策略。...

早期斑马鱼胚胎的光片显微成像与样品制备策略

本方法介绍了一种免疫荧光实验方案及定量分析流程，用于评估在具有不同核结构模式的人类T淋巴细胞中蛋白质的分布情况。该方案提供了从样品制备开始，到在Fiji中进行半自动化分析操作，最后通过Google...

一种用于分析多种细胞类型中核体动态变化的多功能流程

学习三维多色DNA FISH技术，用于可视化人类原代细胞核内多个基因组位点的相互作用与定位。该方法可在单细胞水平直接研究核结构，为基因调控和基因组学研究提供有力工具。

用于研究人类原代细胞核结构的3D多色DNA FISH技术

探索更多视频