用于研究人类原代细胞核结构的3D多色DNA FISH技术

3D 多色 DNA FISH 技术能够在保存的细胞核内可视化多个基因组位点，从而在单细胞水平上模糊界定它们之间的相互作用和定位。3D 多色 DNA FISH 可直接用于研究细胞核结构。通常，该技术与基于染色体捕获的技术联合使用，使其成为在单细胞中验证 C 数据的有效工具。

示范该实验步骤的是 Federica Marasca，她是我实验室的博士后。首先根据起始 DNA 材料的长度，将缺口平移反应混合物置于 16 摄氏度的恒温混匀仪中孵育。

孵育结束后，在2.2%琼脂糖凝胶上检测探针的大小。每次DNA FISH实验中，根据探针所来源的起始DNA材料量，将适量探针沉淀：加入150 µL双蒸水、20 µg未标记的鲑鱼精子DNA、3.5 µg物种特异性的Cot-1 DNA、三倍体积的100%乙醇以及十分之一体积的3 mol/L醋酸钠，在-80 °C下孵育1小时。孵育结束后，在4 °C下以最大转速离心样品1小时。

弃去上清液后，用500微升70%乙醇将沉淀洗涤两次。第二次洗涤后，在2微升100%甲酰胺中重悬沉淀，并在40摄氏度下振荡探针30分钟，然后加入等体积的含20%硫酸葡聚糖的4X柠檬酸钠盐水溶液。对于细胞核较小、胞质含量较少的小细胞进行固定前处理和通透时，首先将200微升PBS中的2×10⁶个细胞直接加入24孔板各孔中的玻璃盖玻片上，室温静置30分钟，使细胞沉降。

孵育结束后，迅速将 PBS 替换为 300 微升新鲜配制的含 0.1% Tween 20 的 4% 多聚甲醛。10 分钟后，在室温下用 300 微升 0.05% TPBS 洗涤固定后的细胞，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。最后一次洗涤后，在室温下用 300 微升 0.5% TPBS 对 T 细胞进行 10 分钟的通透处理，随后每孔加入 250 微升用 PBS 按 1:100 稀释的 RNase 混合液，在 37°C 下处理 1 小时。

孵育结束后，用 300 微升 PBS 洗涤细胞，每孔加入 300 微升含 20% 甘油的 PBS，于 4 摄氏度过夜孵育。次日早晨，将玻片置于干冰上 15 至 30 秒，使细胞快速冷冻，随后在室温下逐步解冻样本，并将其浸入 300 微升含 20% 甘油的 PBS 中 30 秒。按照上述方法再进行三次冻融循环后，用 300 微升含 0.5% TPBS 的溶液在室温下洗涤样本 5 分钟，随后用 300 微升含 0.05% TPBS 的溶液在室温下洗涤两次，每次 5 分钟。

最后一次洗涤后，在室温下用 300 微升 0.1 N 盐酸处理细胞 12 分钟，随后用 300 微升柠檬酸钠盐溶液清洗两次。然后在室温下用含有 50% 甲酰胺的 2× 柠檬酸钠盐溶液 300 微升固定样品过夜。对于具有大量细胞质的大细胞的固定、预处理和通透，其固定、预处理和通透步骤可参照人原代 T 细胞的方法进行，并用 300 微升含 0.0025% 胃蛋白酶的 0.01 N 盐酸溶液处理样品，处理时间从数秒至五分钟不等。

在光学显微镜下观察细胞，一旦细胞核与细胞质分离但核仁仍可见且完整时，立即用 300 微升 50 毫摩尔氯化镁溶液洗涤两次，每次五分钟，以终止反应。对于三维多色 DNA FISH，将杂交探针在 80 摄氏度下变性五分钟，随后立即将探针置于冰上。将探针加样至洁净的显微镜载玻片上，并将每张含有细胞的盖玻片分别置于探针液滴上。

用橡胶胶水密封盖玻片边缘。待胶水完全干燥后，将样本置于75°C的加热块上变性。四分钟后，将样本置于37°C的水浴中，于金属盒内杂交过夜。

第二天早晨，剥去橡胶胶水，并将载玻片浸入2X柠檬酸钠盐水中，小心取下盖玻片。将每张盖玻片放入六孔板的独立孔中，每孔加入2毫升新鲜柠檬酸钠盐水，在37摄氏度下以每分钟90转的速度振荡洗涤两次，每次5分钟。孵育结束后，用含0.2% Tween 20的4X柠檬酸钠盐水2毫升短暂冲洗盖玻片。

进行三维多色DNA FISH检测时，将盖玻片转移至新的24孔板的各个孔中，在37摄氏度、20转/分钟的条件下，用300微升封闭缓冲液封闭非特异性结合位点，封闭20分钟。孵育结束后，在避光湿盒中，于37摄氏度下用适当浓度的抗地高辛素抗体和/或链霉亲和素（溶于封闭缓冲液）处理样本35分钟。孵育结束后，将样本转移至6孔板的各个孔中，用2毫升0.2% Tween 20和4×柠檬酸钠氯化钠溶液洗涤样本三次，每次5分钟，于90转/分钟振荡洗涤。

最后一次洗涤后，将样品在2毫升PBS中平衡，然后将盖玻片转移至新的24孔板中，每孔加入300微升含2%甲醛的PBS溶液，在室温下后固定2分钟。用300微升PBS对固定后的细胞快速洗涤5次，随后在300微升PBS中加入终浓度为1纳克/毫升的DAPI进行染色，室温孵育5分钟。再用PBS将盖玻片洗涤5次，最后使用适当的封片剂封片。

然后使用显微镜系统获取三维图像。三维多色DNA FISH技术可实现对固定三维细胞核内不同基因组位点的同步可视化。在DNA探针制备过程中，探针长度小于200个碱基对可确保三维多色DNA FISH实验的成功进行。

通过缺口平移法产生的次优DNA FISH探针可能发生部分或过度消化。过度消化的探针会导致非特异性信号，原因是杂交特异性降低，从而引起背景信号增强。对于人类原代T淋巴细胞以及细胞核较小、胞质含量较少的小细胞，建议采用12分钟的0.1 N盐酸处理，以促进DNA探针进入细胞核，同时保持细胞核的完整性。

对于小细胞，获得良好的DNA FISH信号无需进行细胞质消化。然而，对于人原代成肌细胞以及细胞核较大且细胞质丰富的细胞，胃蛋白酶消化步骤至关重要。若细胞骨架的胃蛋白酶消化时间过短或不充分，将阻碍探针进入细胞核，导致无法检测到DNA FISH信号。

然而，如果细胞经胃蛋白酶处理过度，细胞核将无法保持完整，从而失去其三维结构。成功的三维多色DNA FISH应在细胞核内观察到信号。建议使用新鲜的生物样本，在进行三维多色DNA FISH前对探针进行测试，配制新鲜的溶液，并精确控制孵育时间和温度。

请记住，甲酰胺和盐酸属于危险物质，必须始终在化学通风橱中使用，并佩戴适当的 disposable 材料。