3D多色DNAFISH工具研究人类原细胞核结构

3D 多色 DNA FISH 是一种工具，用于可视化 3D 保留核内的多个基因组位点，明确定义其在单个细胞级别的核空间内的相互交互和定位。在这里，描述了一个分步协议，用于广泛的人类原细胞。

3D 多色 DNA FISH 能够可视化保存的核内的多个基因组位点，从而模糊地定义它们在单细胞级别的相互相互作用和定位。3D多色DNA鱼允许直接研究核结构。通常，它与基于染色体捕获的技术结合使用，使该技术成为单细胞内C数据验证的可用工具。

演示程序将是费德里卡马拉斯卡。她是我实验室的博士后首先根据起始DNA材料的长度在16摄氏度的热混合器中孵育刻痕转换混合物。

在孵育结束时，检查2.2%的加糖凝胶上的探头尺寸。对于每个DNA鱼实验， 根据起始DNA材料，在150微升双蒸馏水中生产探针，20微克未标记鲑鱼精子DNA，3.5微克特定Cot-1 DNA，三卷100%乙醇，以及1/10体积的3个醋酸钠，在零下80摄氏度下1小时。在孵育结束时，以最高速度将样品在4摄氏度下离心一小时。

丢弃上经剂后，用500微升70%乙醇洗涤颗粒两次。第二次洗涤后，将颗粒重新注入两个微升100%甲酰胺中，并在40摄氏度下摇动探针30分钟，然后加入20%脱酸硫酸盐中等量的4X盐水柠檬酸钠。对于小核小细胞和少量细胞质的小细胞的固定预处理和渗透，首先在PBS200微升中的第六细胞中加入2倍10，直接添加到24孔板的单个孔的玻璃盖玻片上，使细胞在室温下沉淀30分钟。

在孵育结束时，快速更换PBS与300微升新鲜准备的4%半成甲醛，并辅以0.1%Tween 20。10分钟后，在300微升0.05%TPBS中三次清洗固定细胞，在室温下每次清洗5分钟。上次洗涤后，在室温下用 300 微升 0.5 TPBS 渗透 T 细胞 10 分钟，然后用每井 250 微升的 RNAse 鸡尾酒在 PBS 中稀释 1:100，在 37 摄氏度下稀释 1:100。

在孵育结束时，在300微升PBS中冲洗细胞，并在每口井中加入300微升20%甘油，并在4摄氏度下进行隔夜孵育。第二天早上，将玻璃放在干冰上15至30秒，冷冻细胞，然后逐渐在室温下解冻样品，并在PBS中浸泡在300微升20%甘油中30秒。冷冻/解冻细胞三次后，在室温下用300微升0.5%TPBS清洗样品5分钟，随后在300微升中清洗两次0.05%TPBS，在室温下每次清洗5分钟。

最后一次洗涤后，用300微升0.1法兰酸在室温下处理细胞12分钟，然后用300微升盐水柠檬酸微升进行两次冲洗。然后在室温下将样品在300微升中，在2X盐水柠檬酸钠中固定50%的酰胺。对于具有大量细胞质的大细胞的固定、预处理和渗透，固定、预处理和渗透细胞与人体原生T细胞相似，并在0.01普通盐酸中用300微升0.0025%辣椒处理样品，几秒钟至5分钟。

在光学显微镜下观察细胞，并在核从细胞质中释放，但核仍然可见且完好无损，在300微升50毫摩尔氯化镁中停止反应。对于 3D 多色 DNA FISH，将杂交探测器在 80 摄氏度下变性 5 分钟，并立即将探测器放在冰上。将探头加载到干净的显微镜幻灯片上，并在每滴探针上放置一个细胞盖玻片。

用橡胶水泥密封盖玻片边缘。当水泥完全干燥后，将样品在 75 摄氏度的加热块上变性。4分钟后，在37摄氏度的温度下，在漂浮在水浴中的金属盒中对样品进行水化。

第二天早上，剥下橡胶水泥，用滑梯浸入2倍盐水柠檬酸钠中，小心地从盖玻片上抬起来。将每个盖玻片放入六孔板的单个孔中，每口井含有两毫升新鲜盐水柠檬酸钠，在 37 摄氏度下进行两次 5 分钟的洗涤，每分钟摇晃 90 圈。在孵育结束时，在4X盐水柠檬酸钠中用0.2%Tween 20的两毫升短暂冲洗盖玻片。

对于 3D 多色 DNA FISH 检测，将盖玻片转移到新的 24 孔板的单个孔中，并在 300 微升阻塞缓冲液中阻断任何非特异性结合，在 37 摄氏度和每分钟 20 转下进行 20 分钟。在孵化结束时，在37摄氏度的黑暗湿润室中，用适当浓度的抗二氮二氮素和/或链球菌素在阻尼缓冲液中稀释35分钟。在孵育结束时，将样品转移到六井板的单个孔中，用两毫升0.2%Tween 20和4X盐水柠檬酸钠洗涤三次，每次洗涤5分钟，每分钟摇晃90圈。

上次洗涤后，将样品平衡在两毫升 PBS 中，然后将盖玻片转移到新的 24 井板中，在 300 微升中固定 300 微升，每井 PBS 中甲醛为 2%，在室温下两分钟。在 300 微升 PBS 中短暂清洗固定细胞五次，随后在室温下用 DAPI 稀释，每毫升一毫微克，在 300 微升 PBS 中洗涤 5 分钟。在 PBS 中多次清洗盖玻片，然后使用适当的安装介质安装样品。

然后通过显微镜系统获取 3D 图像。3D 多色 DNA FISH 允许在保存的 3D 核中对不同基因组位进行当代可视化。对于DNA探针制备，小于200个碱基对的探针大小确保了成功的3D多色DNA FISH程序。

由刻痕翻译产生的不理想的DNA FISH探针可以部分或过度消化。过度消化的探头会导致非特异性信号，因为杂交中特异性的丧失以及背景的随从增加。对于具有小核和低细胞质的人类原发性T淋巴细胞和小细胞，建议进行12分钟0.1法线盐酸处理，以促进核对DNA探针的可访问性，并维护核完整性。

细胞质消化不需要获得DNA鱼良好的信号在小细胞。然而，对于具有大核和丰富细胞质的人类原发性肌细胞和细胞来说，百事可乐化步骤是根本的。短和次优的细胞骨架百化将阻碍探针进入核结束，没有DNA FISH信号。

然而，如果细胞过度化，核不会保持完好无损，失去他们的3D结构。一个成功的3D多色DNA鱼将导致在核内的信号存在。我建议使用新鲜的生物材料，在执行三维多色DNA鱼之前测试探针，准备新的解决方案，并精确测量孵化时间和温度。

请记住，甲酰胺和 HCL 是有害物质，应始终用于化学烟罩中，并配有适当的一次性材料。