二维和三维活细胞成像的DNA损伤反应蛋白
2012年9月28日
该协议描述了一个可视化的DNA双链断裂以及其定位在有丝分裂过程中DNA损伤激活的信号蛋白的方法。
该演示使用二维和 3D 活细胞成像来了解参与 DNA 损伤反应的蛋白质的时空关系。首先，使用含有适当荧光标记物的表达构建体转染或转导您选择的细胞系。在这里，M Cherry 和 GFP 接下来获取一系列对照视频，显示正常条件下荧光标记的细胞。
然后应用适当的处理并捕获处理对荧光细胞过程的影响数据，并分析蛋白质时空关系的视频数据。最终，活细胞荧光显微镜可以详细描述细胞动力学，例如响应 DNA 损伤剂形成 53 BP 一个病灶或 53 BP 在有丝分裂期间的行为。当我们想研究不同的治疗方法如何影响某些细胞系的有丝分裂时，我们第一次对 2D 和 3D 生活方式成像产生了兴趣。
与传统方法相比，这种实验方法使我们能够更容易地研究 DNA 损伤反应和基因组稳定性的维持。此外，您可以使用这种方法来研究某些蛋白质在各种信号通路和各种细胞系中的相互作用。与细胞化学等传统技术相比，生活方式成像的主要优势在于它允许实时研究 DNA 损伤反应蛋白。
优化正确的录制条件可能具有挑战性。此演示可用于查看确保成功所需的许多小步骤。请记住，在最大限度地减少照片漂白、找到正确的记录间隔和正确的记录时间长度等方面，坚持是有回报的。
使用质粒转染或转导合适的细胞系，用于 mCherry 和 GFP 融合蛋白表达。在药物选择下保持培养物，并在图像采集前一天定期检查荧光蛋白的表达。使用胰蛋白酶收获细胞。
然后将低密度培养物接种到 3.5 厘米荧光培养皿玻璃底板上。该协议是使用蔡司细胞观察器 SD 转盘共聚焦显微镜开发的，配备 axio 观察器 Z 一个支架首先，验证 CO2 气体是否流向培养系统的 CO2 模块。如果显微镜由防振 Airtable 支撑，则打开 Airtable 的气源。
现在打开显微镜支架旋转圆盘单元相机、孵育模块、HXP 照明器、电动载物台、氩激光器和计算机的电源。打开要使用的激光线的开关。启动 Axio 视觉软件。
Avision 软件可以使用特定于显微镜及其控制组件的窗口和下拉菜单进行自定义。因此，每个用户界面在成像前大约一小时具有可能的独特外观。找到培养箱的控件，然后打开上腔室和载物台板的加热装置。
将温度设置为 37 摄氏度。打开 CO2 控制并将水平设置为 5%选择用于成像的物镜 在本研究中。物镜需要使用折射率与水相似的浸没介质。
如果您需要长时间对多个位置进行成像，请务必使用足够的浸没介质，以免示波器变干。将培养皿放在载物台上，并使用显微镜控制器或软件使物镜与底部接触。将发射光对准目镜，并为感兴趣的荧光信号选择合适的宽场滤光片组。
现在通过目镜观察。使用软件或显微镜控件聚焦图像并找到合适的细胞区域。使用软件中的共聚焦转盘装置将发射的光从目镜引导到端口。
为本研究打开合适的激光器。对于每个通道，通过将 kuo optic 可调谐滤光片控制调整到适当的水平来调整激光的强度。接下来，选择合适的二向色镜和发射滤光片。
打开旋转光盘单元的快门。现在选择实时窗口以显示当前视野。现在打开摄像机控制窗口。
选择要使用的相机并将曝光时间设置为大约 100 毫秒。根据需要调整百分比和 EM 增益。此外，打开共聚焦旋转盘单元的控件，并通过输入为捕获合适图像而设置的相机曝光时间来调整旋转盘的速度。
单击 set 以锁定更改。现在打开多维采集窗口。选择通道选项卡并加载或选择为 Flora Fours 定义的相应通道。
为确保图像配准，请对两个通道使用公共二向色镜。将软件设置为自动对焦。进入 MDA 窗口，然后单击 ZS 堆栈选项卡。
选择当前焦点位置的 ZS 堆栈。设置 10 微米 Zack 的范围，并为步数选择最佳，以确保通过 Z 轴进行奈奎斯特采样。选择 Time （时间） 选项卡。
设置成像时间点之间的间隔和会话的总持续时间。要对培养皿中的多个细胞进行多点成像，请打开 MDA 窗口。选择 position 选项卡，并验证是否选中了 apply 设置在每个位置的时间点之前或之后。
现在选择 mark.使用实时取景查找，四处移动培养皿并选择合适的视野。单击多维采集菜单中的开始开始实验并录制对照视频。
继续添加适当的处理，并在定义的时间段内以确定的时间间隔录制实验视频。对于该细胞系和监测有丝分裂的整个过程，我们使用了 7 分半钟的间隔，持续了 4 到 5 小时。您必须确定细胞系和要研究的特定设置。
打开 velocity 软件，创建并命名一个新库，然后导入实验视频文件以查看文件。尝试使用扩展焦距设置，根据需要调整视频。Velocity 配备了一系列工具，可帮助提高您采集的图像的质量。
如果显微镜上的设置合适，以后编辑时会节省很多时间。通常，转移您的图像并调整亮度和对比度是有帮助的，您的具体需求会根据您的实验而变化：以 3D 方式查看细胞。切换到 3D 不透明度设置。
这允许 3D 渲染的单元在空间中旋转，从而提供单元内感兴趣结构的多个视角。电影。与控件相比，可以根据用户偏好将静止图像导出为多种文件类型。暴露于 CPT 的成纤维细胞在 5 到 10 分钟内形成病灶，并在整个记录期间保持这些病灶。
有趣的是，在人胚胎肾细胞中，53 BP 1 在有丝分裂开始时与染色质分离，在凝聚染色体周围形成薄薄的雾霾。随着 teleph 的发生和有丝分裂结束 53 BP 一，再次聚集到不同的病灶中。我们希望该视频能让您研究参与 DNA 损伤反应以及其他途径的蛋白质的时空关系。
例如，在染色质动力学领域，该技术用于研究 53 BP 1 结合如何影响 DNA 端粒末端的运动。在创建转基因细胞后，可以在大约 4 到 8 小时内进行 2D 和 3D 活细胞成像。确保适当调整显微镜设置以获得最佳成像效果。
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概述
该协议描述了一种方法，用于可视化DNA损伤信号蛋白在DNA损伤响应中的激活及其在有丝分裂期间的定位。该演示利用二维和三维活细胞成像来探索DNA损伤响应中涉及的蛋白质的时空关系。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- DNA损伤响应
- 活细胞成像
背景
- 了解DNA损伤响应对细胞周期调节至关重要。
- 荧光标记物有助于可视化活细胞中的蛋白质动态。
- 二维和三维成像技术增强了空间和时间分析。
- 53 BP1是DNA损伤响应中的关键蛋白质。
研究目的
- 可视化DNA损伤信号蛋白的激活和定位。
- 分析DNA损伤剂对细胞动力学的影响。
- 研究有丝分裂期间蛋白质的行为。
使用的方法
- 用荧光标记物构建体转染或转导细胞系。
- 在正常条件下获取荧光标记细胞的对照视频。
- 应用处理并捕捉处理效果的数据。
- 分析视频数据以了解蛋白质的时空关系。
主要结果
- 活细胞荧光显微镜揭示了53 BP1焦点形成的动态。
- 有丝分裂期间的蛋白质行为受DNA损伤剂的影响。
- 二维和三维成像为研究细胞对处理的反应提供了见解。
- 可以有效分析蛋白质的时空关系。
结论
- 该方法允许对DNA损伤响应蛋白进行详细观察。
- 活细胞成像是研究细胞动力学的强大工具。
- 了解这些过程可以为针对DNA损伤的治疗策略提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Live cell 2D and 3D imaging of DNA damage response proteins such as 53BP1 enables direct visualization of spatiotemporal protein dynamics following genotoxic stress. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery, particularly for targets and pathways involved in genomic stability. Integrating these imaging approaches informs target validation and portfolio triage decisions in oncology and genome maintenance programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables real-time interrogation of DNA repair pathway activation and protein recruitment.
- Supports functional validation of DDR targets by visualizing protein localization and kinetics.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying pathway engagement and cellular context.
- Provides predictive confidence for advancing DDR modulators or synthetic lethality strategies.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live cell systems for quantitative assessment of DDR protein dynamics.
- Enables reproducible measurement of foci formation and chromatin changes post-treatment.
- Supports assay standardization for compound screening targeting DNA repair pathways.
- Allows for scalable adaptation to multiple cell lines and genetic backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant models of genomic instability.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of DDR-targeting agents.
- Enables risk-adjusted advancement by linking mechanistic readouts to translational endpoints.
- Supports biomarker development for DDR pathway engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging method integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting both hypothesis-driven target validation and downstream assay development for DDR-focused programs.
- Discovery Biology: Visualizes protein recruitment and chromatin remodeling in response to DNA damage, clarifying pathway function.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts of DDR protein foci for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of spatiotemporal protein dynamics and comparison across treatments or cell lines.
- Translational Research: Connects mechanistic imaging outputs to disease-relevant models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for studying diverse DDR proteins and pathways across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in DDR target validation.
- Operational Value: Standardizes live cell imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust mechanistic data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of DDR-targeting assets and translational biomarker strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging, fluorescent protein engineering, and image analysis.
- Demands access to advanced confocal microscopy and environmental control systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to various cell lines and DDR proteins with appropriate construct design.
- Imaging conditions must be optimized to minimize photobleaching and ensure data quality.
