在生物标志物分析临床试验场单次抽血时，准备外周血单核细胞颗粒和血浆
March 20th, 2021
本协议详细介绍了可用于转化生物标志物分析的临床试验现场高质量PBMC和血浆生物采样剂的临床可实施制备。
PBMC 和血浆样本在早期临床开发中获取简单明了，信息量很大。此强大的协议可最大限度地减少临床部位引入的分析前变异性。此协议快速易用，需要基本的实验室设备和最少的操作人员专业知识来将血液加工成 PBMC 和血浆。
它与医院繁忙的实验室日相容。对本协议产生的血液成分的下游分析可以告知药动力学和药理动力学关系、药物剂量调度和目标参与证明，并提供对药物作用机制的见解，支持实时和内省分析。我们使用此协议进行肿瘤学研究，特别是分析 DNA 损伤响应机制。
然而，本协议收集的材料可能与许多疾病领域和多种治疗方式相关。每次采样接受8毫升献血后，记录抽血时间，并轻轻地倒置每根管子8至10次，然后将抗凝血剂处理过的血液样本转移到标有辐射标签的每个管中。对于临床样本，在倒置管子后立即离心。
将 0.2 灰色管放在预热 X 光柜中，关上门，在管子上涂抹 0.2 灰色剂量。用七根灰色管替换低剂量辐照管，并调整剂量，将七个灰色辐射剂量应用于高剂量辐照样品。两个样品都辐照后，在37摄氏度下孵育所有三根管子一小时。
在高速离心分离细胞之前，将样品转移到细胞制备管中，确保将单元设置为 x g 或等效的 RCF。离心后，在深色背景下查看管子，以识别血浆、红血球和浅色涂层。使用血清移液器，将大约一半的等离子体转移到标有15毫升圆锥形离心机，而不会干扰薄薄的涂层，并将等离子管储存在湿冰上。
然后，使用牧场移液器将包含缓冲涂层的整个 PBMC 转移到新的 15 毫升管中，并将室温 PBS 添加到 PBMC 中，最终体积为每个样品 15 毫升。通过反转将细胞轻轻混合五次，以较低的速度通过离心收集细胞，确保检查离心装置。吸气所有，但最后500微升的超细酸盐，而不打扰颗粒。
将新鲜的 PBS 添加到每个管的最终体积 10 毫升中，然后通过轻轻倒置管子来恢复。使用细胞的40微升等离子体进行计数。计数后，用另一个离心器收集细胞，并尽可能去除超自然分子，而不会干扰颗粒。
为了存储PBMC以供以后处理，用温和的管道将颗粒重新注入50微升的新鲜PBS中，并将每个细胞悬架转移到湿冰上标有1.5毫升的低温中。然后用首选的方法将细胞闪光冻结，并将它们放在零下80度的冷冻箱中。记录细胞被冻结的时间。
或者，将颗粒以每份样品一毫升或冷冻混合物中补充，并将细胞悬浮物转移到标有冷冻的单独细胞中。然后放置管子和预冷冷冻箱，存放零下80摄氏度。要冻结等离子体，将大量等离子体加起来，在不干扰残余颗粒的情况下，将大量等离子体加到五个两毫升微管中，并记录每个管中的等离子体总体积。
然后，立即在零下80摄氏度的冰柜中直立地冷冻等离子体。对于样品的西面污点分析，用适量的裂解缓冲器补充与细胞颗粒体积相等的蛋白酶和磷酸盐抑制剂，用温和的管道重新注入每个管中的颗粒，并在冰上孵育细胞样本10分钟。在孵化结束时，将样品转移到1.5毫升管中，并在4摄氏度的30秒内用3个30秒的关闭周期将其声波化。
通过离心收集样品，并将超分子转移到新的1.5毫升管中。然后，将每个样品与加载缓冲器混合 40 微克，将样品煮沸五分钟。将每个通道的每个样本加载 20 微克，重复在 4-12% Bis-Tris 蛋白质凝胶中，并运行 SDS-PAGE。
从8毫升血液中获得的细胞数量因患者和疾病设置而异。一般来说，细胞颗粒体积小，颜色透明白色。有时颗粒会产生一些红细胞污染，这对制剂的质量有负面影响。
使用此协议的慢性淋巴细胞白血病患者的典型产量从 1.62 倍 10 到第四到 1.99 倍 10 到第九细胞每 8 毫升单核细胞制备，最终蛋白质浓度在 1.62 至 19.77 毫克/毫升之间。在这项对三个患者样本的代表性分析中，观察到在较高的电离辐射剂量下，转化后修改增加。有趣的是，在0.2灰色的低剂量下，阿塔夏-泰兰吉西亚突变和RAD50的磷酸化是实质性的，这表明这些转化后修饰可能作为药理动力学生物标志物进行实际审讯，用于治疗DNA双链断裂，肿瘤中具有良好的动态范围，以及周围血液样本。
为了获得最佳的样品准备，在室温下收集血液后一小时内处理血液，正确离心取样，并在黑暗背景下查看管子，以便能够区分浅色外套。
概述
本协议概述了在临床试验中为转化性生物标志物分析准备高质量的PBMC和血浆生物样本。它强调最小化预分析变异性，并为繁忙的临床环境中的易用性而设计。
关键研究组成部分
科学领域
- 临床试验方法
- 生物标志物分析
- 肿瘤学研究
背景
- PBMC和血浆样本在早期临床开发中至关重要。
- 稳健的协议有助于减少样本制备的变异性。
- 与标准实验室设备兼容，并且所需的专业知识最少。
- 适用于各种疾病领域和治疗模式。
研究目的
- 提供一种准备PBMC和血浆样本的可靠方法。
- 支持药代动力学和药效学研究。
- 促进药物作用机制的分析。
使用的方法
- 收集血样和立即处理。
- 离心分离血浆和PBMC层。
- 在适当的温度下储存样本以供后续分析。
- 蛋白质表达研究的蛋白质印迹分析。
主要结果
- PBMC的产量因患者和疾病背景而异。
- 在不同辐射剂量下观察到翻译后修饰。
- 磷酸化变化表明潜在的药效学生物标志物。
- 最佳处理条件可提高样本质量。
结论
- 该协议对于准备高质量的生物样本是有效的。
- 它可以适用于各种临床和研究应用。
- 及时处理和正确的离心对质量至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable biomarker analysis from peripheral blood is essential for establishing proof of mechanism and guiding therapeutic dose scheduling in clinical trials. This protocol minimizes pre-analytical variability at clinical sites, enabling consistent, high-quality PBMC and plasma sample preparation across multi-center studies. It supports translational biomarker workflows by providing standardized biosamples for pharmacodynamic and mechanistic hypothesis testing in oncology and other therapeutic areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through analysis of protein biomarkers and post-translational modifications in PBMCs.
- Operational Value: Provides a robust, easy-to-implement method for isolating PBMCs and plasma from a single blood draw with minimal technical expertise.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems suitable for downstream biomarker assays, including circulating tumor DNA, cytokine, and metabolomics analysis.
- Operational Value: Ensures sample reproducibility and standardization through defined processing steps, reducing variability across clinical sites.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant systems by enabling longitudinal sampling to track biomarker evolution and immunological landscape changes.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation by providing storable, high-quality biosamples for mechanistic de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early biology to lead identification and preclinical work by delivering quantitative, reproducible biosamples for biomarker-driven decision making.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via analysis of DNA damage response markers and post-translational modifications in irradiated blood samples.
- Screening: Delivers assay-ready PBMC and plasma samples with standardized isolation and storage protocols for reliable compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurements of protein markers, circulating tumor DNA, and metabolomics to compare treatment conditions and inform pharmacodynamic relationships.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through longitudinal biomarker analysis and mechanistic hypothesis testing in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across therapeutic areas and trial phases due to its adaptability and minimal equipment requirements.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through measurable pharmacodynamic biomarkers such as phosphorylation of ATM and RAD50.
- Operational Value: Standardization and reproducibility of sample processing across sites, reducing pre-analytical variability in biomarker analysis.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reliable proof of target engagement and mechanism of action insights.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on consistent biomarker data from early clinical samples.
Implementation Considerations
- Requires basic laboratory expertise in centrifugation, pipetting, and sample handling.
- Depends on access to centrifuges, pipettes, cryovials, and ice for sample processing and storage.
- Necessitates cross-team standardization of timing, irradiation (if applicable), and storage procedures to maintain consistency.
- Requires adaptation considerations for non-irradiated samples or alternative downstream assays such as flow cytometry or nucleic acid extraction.
- Practical limitation: PBMC yield and pellet quality can vary by patient and disease state, affecting downstream protein concentration and analysis sensitivity.
