在心肌梗死小鼠模型中传递修正的mRNA

该协议提供了一种简单和连贯的方法，在小鼠心肌梗死后，使用modRNA暂时调节感兴趣的基因。

改性RNA是一种将基因转移到心脏和其他器官的新方法。该协议将提供准确的方法，将所需的基因暂时传递到心脏，心肌梗塞后。该方法不仅限于心肌梗塞，还可应用于缺血再灌注和横向大体收缩模型。

改性RNA正被用于几个人体临床试验。然而，没有标准化的协议，基因转移到心脏使用这种方法。视觉演示将使研究人员能够正确注射修饰的RNA在心脏的适当位点。

展示蛋白库的将是阿吉特·马加杜姆，一个博士后研究员，和埃琳娜·切普尔科，一个动物主管从我们的实验室。根据以前在 modRNA 中准备的浓度，计算 100 微克注射所需的 modRNA 体积。生产同等体积的蔗糖和柠檬酸盐溶液。

然后添加计算的模组RNA体积，并加入足够的盐水溶液，使注射量达到60微升。麻醉动物后，将其腹侧朝上，嘴朝向实验者。然后通过进行内切管保持空道，轻轻拉出舌头。

调整颈部的角度，拉直插管路径，并推入插管。观察小鼠的胸腔运动，以验证两个肺是否都接受氧气。呼吸速率应约为每分钟120次呼吸。

要开始 LAD 连接，请小心地将鼠标转向右侧。抬起皮肤，并在第三排和第四肋骨之间进行左侧胸腔切除术。小心地打开胸部，不要用任何锋利的物体接触肺部。

将缩回器放入切口，以保持胸腔开放，提供心脏的清晰视图。接下来，将肺移动到切口的边缘，并切除覆盖心脏的心包囊部分。仔细识别 LAD，一个深浅的红色容器，位于肺动脉和左动脉之间。

用一个丝绸缝合线将近近的LAD缝合。使用胰岛素注射器，向心脏总共提供60微升的modRNA溶液。在三个不同的地点注射20微升肌肉。

连接两侧的站点和心脏顶点上的一个站点。将修改后的RNA注射到正确的位点的最佳方法，是在LAD遮挡后，观察在显微镜下组织的变色。此外，当注射时，不要深入到组织，以达到心脏腔进入循环。

在层中关闭胸切口。第一次使用是 6 - 0 丝绸运行缝合线， 以适应肋骨。然后使用5-0丝线缝合线关闭皮肤。

对于恢复阶段，取出管，并允许自发呼吸。将动物放在加热垫上，直到它恢复知觉。在动物完全清醒之前，不要让动物无人看管。

为了管理手术后疼痛，每隔12小时注射丁丙诺啡皮下三天。每公斤体重0.1毫克。在CFW小鼠的LAD结扎和注射荧光素酶模组24小时后，通过使用生物发光成像系统检查荧光酶蛋白表达，验证了转染。

与注射荧光素模组RNA的小鼠相比，在比较对照小鼠的图像中可以清楚地检测到荧光素酶信号。白化酶信号的定量显示，治疗小鼠的蛋白质表达明显高于对照小鼠。通过检查其在转基因 ROSA26 mTmG 小鼠中的翻译和生物分布，验证了 Cre modRNA 表达。

手术后24小时和cre modRNA注射，艺术被修复和处理免疫着色与心肌细胞标记，心脏肌蛋白I，和核标记DAPI。由于绿色心肌细胞的出现，成功的cre表达是显而易见的。合并的图像显示两个可见注射部位周围的 cre 激活细胞。

蓝色是核污渍 DAPI 。经过修改的RNA平台可以在各种器官中提供单个基因或基因组合。因此，可用于治疗目的，如纠正遗传性疾病，或激活体内的有益机制。

改性RNA独特的药代动力学使我们能够在注射后立即评估基因功能。这使得研究人员能够瞄准信号通路，这些通路在梗死的最初几个小时内被改变。