Name: 在心肌梗死小鼠模型中传递修正的mRNA (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: 学习使用修正mRNA在小鼠心肌梗死模型中进行基因递送的标准化方法。本方案展示心脏注射技术，实现目标基因的瞬时上调，适用于缺血再灌注等多种心脏损伤模型研究。

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作者感谢 Ann Anu Kurian&#160;在本手稿撰写过程中提供的帮助。本研究由授予 Zangi 实验室的心脏病学启动基金以及 NIH 资助项目 R01 HL142768-01 资助。

本文所述所有动物实验程序均已获得西奈山伊坎医学院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. modRNA 的合成
注意：modRNA 合成的详细信息可参见 Kondrat 等人13。
<ol>
	<li>订购质粒模板（材料表），并通过PCR扩增获得纯净的产物，作为mRNA模板使用。</li>
	<li>使用定制的核糖核苷混合物，在体外进行T7转录以制备修饰mRNA（modRNA）（材料表）：T7转录试剂盒、6 mM反向帽类似物（ARCA）30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G、75 mM鸟苷三磷酸、75 mM腺苷三磷酸、75 mM胞苷三磷酸、100 mM假尿苷-5-三磷酸，以及T7 DNase酶。</li>
	<li>使用转录纯化试剂盒（材料表）对步骤1.2中生成的modRNA进行纯化，并用南极磷脂酶处理。随后再次使用转录纯化试剂盒对modRNA进行纯化，并用分光光度计定量。</li>
	<li>使用乙醇和乙酸铵沉淀modRNA，然后将其重悬于10 mM Tris-HCl和1 mM EDTA溶液中。</li>
	<li>通过离心滤膜浓缩modRNA，用于体内递送，并使用自动化电泳平台检测其质量（材料表）。</li>
</ol>
2. 体内递送用修饰RNA注射液的制备
<ol>
	<li>根据修饰RNA（modRNA）浓度，计算注射100 µg 荧光素酶（Luc）/Cre modRNA 所需的体积。</li>
	<li>将计算出的modRNA体积与等体积的蔗糖溶液（用无核酸酶水配制，0.3 g/mL）和0.1 M 枸橼酸盐溶液（pH = 7）混合（推荐各取20 µL）。</li>
	<li>加入生理盐水将注射液终体积补至60 µL。</li>
</ol>
3. 心肌梗死手术
<ol>
	<li>麻醉与动物准备 
	注意：本研究使用8−12周龄的雄性和雌性CFW小鼠。
	<ol>
		<li>使用诱导舱以2%异氟烷对小鼠进行麻醉，并将其仰卧固定，鼻部和口腔覆盖面罩以维持麻醉状态。通过配备7−8 mm气道管和过滤器的呼吸机进行机械通气以维持麻醉。</li>
		<li>使用手术胶带将小鼠四肢固定于手术平台。剃除颈部区域及左侧肋骨部位的毛发，并使用70%乙醇和聚维酮碘进行消毒，重复消毒步骤两次。通过夹捏尾巴和后肢足部检查反射，以评估麻醉深度。</li>
		<li>持续监测并维持核心体温在正常体温范围（37.5−38 °C）。</li>
		<li>通过气管插管维持气道通畅。操作时将小鼠置于腹侧位，口部朝向实验者，轻柔拉出舌头。调整颈部角度，使插管路径伸直，然后插入插管导管。</li>
		<li>若动物无法通过插管呼吸，可实施气管切开术。沿正中线做颈部切口，使用显微镜分离皮肤、肌肉及气管周围组织。当气管清晰可见时，使用显微外科镊夹住气管颅侧部分，在声门下方两个软骨环之间的组织上打一小孔，将气管插管插入该处。</li>
		<li>观察小鼠胸廓运动，确认双肺均获得氧气供应。呼吸频率（RR）应约为每分钟120次，吸气压为17−18 cm H2O。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>左前降支（LAD）冠状动脉结扎
	<ol>
		<li>为实施LAD结扎，小心将小鼠翻转至右侧卧位。提起皮肤，在第3与第4肋间进行左侧开胸术，仔细分离组织和肌肉。使用电凝设备以防止出血。</li>
		<li>小心打开胸腔，暴露心脏，避免任何锐器接触肺组织。将牵开器置入切口以保持胸腔开放，清晰显露心脏。将肺组织移至切口边缘，去除覆盖心脏的那部分心包膜，以暴露心脏前表面。</li>
		<li>仔细辨认左前降支（LAD），其为位于肺动脉与左心耳之间的一条深浅红色血管。使用一根7-0丝线在LAD近端进行单次结扎。在第4与第5肋间置入胸腔引流管（28 G，静脉导管）。</li>
		<li>逐层关闭胸腔切口。使用6-0连续丝线缝合肋骨，使用5-0连续丝线缝合皮肤。确保预留适当窗口以便后续进行超声心动图测量。</li>
		<li>使用2 mL注射器以温热等渗溶液（1 L水中含9 g氯化钠）小心冲洗胸腔。将小鼠恢复为仰卧位。若已实施气管切开术，则拔出气管插管，使用7-0丝线单针缝合气管软骨环以闭合切口。为小鼠佩戴面罩，并使用5-0连续丝线缝合皮肤。</li>
		<li>在恢复阶段，将插管导管与呼吸机断开，允许自主呼吸。将动物置于保温灯下直至恢复意识。术后直至完全清醒前，不得无人看护。</li>
		<li>术后3天内每12小时皮下注射0.1 mg/kg体重的丁丙诺啡进行镇痛治疗。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. modRNA的心脏递送
<ol>
	<li>在心肌梗死（MI）后，使用胰岛素注射器（31 G）将步骤 2.3 中制备的 modRNA 总共 60 µL 进行肌肉注射（IM）。
	<ol>
		<li>在梗死区域周围的心肌三个不同部位各注射 20 µL modRNA（结扎线两侧各一，心尖部一个）。在左前降支（LAD）结扎后立即进行注射，关闭胸腔前完成。 
		注：modRNA 注射位点的代表性图像见图 1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 心肌梗死后心脏中蛋白质表达的验证
<ol>
	<li>使用生物发光成像系统检测荧光素酶modRNA表达 
	注意：心肌梗死（MI）后，将60 µL蔗糖柠檬酸盐缓冲液中配制的100 µg Luc mRNA直接注射至CFW小鼠心脏。
	<ol>
		<li>在MI及modRNA注射后24小时，使用诱导舱以2%异氟烷麻醉小鼠，并通过腹腔注射荧光素（150 mg/kg体重），以在体内验证Luc信号。</li>
		<li>使用生物发光成像系统每2分钟对小鼠成像一次，直至Luc信号达到饱和。</li>
		<li>使用成像分析软件对采集的图像数据进行定量。以仅注射生理盐水的小鼠作为Luc表达的基线读数，并减去生理盐水注射小鼠采集的背景信号。 
		注意：Luc信号以p/s/cm2/sr × 106表示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫染色验证Cre转染
	<ol>
		<li>为验证Cre转染，于注射后24小时通过腹腔注射100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg赛拉嗪处死动物，随后行颈椎脱位。在切开前，使用70%酒精棉片对胸部和腹部进行消毒。</li>
		<li>在胸骨下方约1 cm处作横向切口，并将剪刀朝头部方向推进，剪开肋骨以打开胸腔。</li>
		<li>打开胸腔后，向右心室腔内注射1 mL无菌PBS以清除多余血液。立即取出心脏并置于无菌PBS中，冲洗残留血液。</li>
		<li>将心脏在4%多聚甲醛（PFA）中固定24小时，随后在4 °C下于30%蔗糖溶液中孵育过夜。次日将心脏包埋于最佳切割温度介质中，并使用冷冻切片机切成10 µm厚的切片。</li>
		<li>使用抗心肌肌钙蛋白I（cTNI）一抗对切片进行染色，并用荧光标记的二抗进行标记。为识别细胞核，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色5分钟。使用荧光显微镜对切片进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 统计分析
<ol>
	<li>根据生理盐水组和 Luc 注射小鼠的 Luc 表达绘制柱状图，数据以均值 ± 标准误表示。使用非配对 t 检验比较两组（****p &#60; 0.0001）。</li>
</ol>

<ol><li>Muruve, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innate+immune+response+to+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The innate immune response to adenovirus vectors.</a> Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).</li>
<li>Donsante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li>
<li>Calcedo, R., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+Immune+Response+to+AAV%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humoral Immune Response to AAV.</a> Frontiers in Immunology. 4, 341(2013).</li>
<li>Diebold, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+agonists+for+Toll-like+receptor+7+are+defined+by+the+presence+of+uridine+ribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides.</a> European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).</li>
<li>Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Based+Protein+Replacement+Therapy+for+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).</li>
<li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li>
<li>Hadas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Modified+mRNA+In+Vitro+Synthesis+Protocol+for+Heart+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy.</a> Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Cardiac+Delivery+of+Modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).</li>
<li>Zangi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li>
<li>Carlsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+VEGF-A+mRNA+Improves+Cardiac+Function+after+Intracardiac+Injection+1+Week+Post-myocardial+Infarction+in+Swine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine.</a> Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).</li>
<li>Huang, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+chemically+modified+mRNA-based+delivery+of+cytoprotective+factor+promotes+early+cardiomyocyte+survival+post-acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).</li>
<li>Magadum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+a+Single+N-Glycosylation+Site+in+Human+FSTL+1+Induces+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Cardiac+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).</li>
<li>Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Modified+mRNA+for+Myocardial+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).</li>
<li>Gan, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intradermal+delivery+of+modified+mRNA+encoding+VEGF-A+in+patients+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes.</a> Nature Communication. 10 (1), 871(2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基因治疗在显著推进心脏疾病治疗方面展现出巨大潜力。然而，早期临床试验中用于治疗心力衰竭（HF）的传统工具效果有限，且伴随严重副作用。修饰RNA（modRNA）作为一种非病毒基因递送方式，正日益成为心脏基因转移的热门工具。modRNA无需将基因定位于细胞核内即可进行翻译，因而能够实现高效且快速的蛋白表达。此外，由于mRNA不会整合到宿主基因组中，通过modRNA进行基因递送可避免诱变风险。因此，得益于相较于传统基因递送载体的诸多优势，modRNA已成为向心脏递送单个基因或基因组合最具吸引力的平台之一。然而，迄今为止，尚无标准化的操作流程用于损伤后将modRNA制备并递送至心脏。本研究旨在建立一种标准且优化的modRNA心内注射递送方案，以提升modRNA作为基因治疗工具的应用价值，并推动其向治疗用途转化。
在本实验方案中，通过用假尿苷替代尿苷，并在5’端使用ARCA加帽，制备修饰mRNA（modRNA）。这些对mRNA二级结构的修饰已被证明可实现比其他多种核苷酸修饰更高的蛋白质翻译效率8。此外，这种修饰后的mRNA结构可通过限制其被To...

基因治疗是一种通过递送核酸来治疗、治愈或预防人类疾病的强大工具。尽管在心脏病的诊断和治疗方法上已取得进展，但在心肌梗死（MI）和心力衰竭（HF）中实现有效的基因递送仍面临较大挑战。尽管基因治疗的过程看似简单，但考虑到在选择特定递送载体前需要优化的诸多因素，该方法实际上极为复杂。理想的递送载体应在人体内具有非免疫原性、高效性和稳定性。目前该领域已发展出两类递送系统：病毒性和非病毒性。常用的病毒系统包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒或腺相关病毒介导的基因转移，这些系统表现出卓越的转导能力。然而，由于其可引发强烈的免疫反应1、存在致瘤风险2或体内存在中和抗体3，限制了其在临床中的应用，这些因素仍是病毒载体在人类基因治疗中广泛而有效应用的主要障碍。另一方面，尽管裸质粒DNA递送具有良好的表达模式，但其转染效率较低；而mRNA递送则表现出高免疫原性，并易被RNase降解4。
随着mRNA领域的广泛研究，与传统载体相比，修饰mRNA（modRNA）因其多种优势而成为向心脏及其他多种器官递送基因的有力工具5。用天然存在的假尿苷完全取代尿苷可实现更强且更短暂的蛋白表达，同时几乎不激活先天免疫反应，并降低基因组整合的风险6。近期建立的实验方案采用优化剂量的抗反向帽类似物（ARCA），可进一步提高合成mRNA的稳定性和可翻译性，从而增强蛋白翻译效率7。
既往研究已表明，在心肌梗死（MI）后，通过修饰mRNA（modRNA）递送的多种报告基因或功能基因可在啮齿类动物心肌中表达。应用modRNA后，心肌损伤后较大范围的心肌区域（包括心肌细胞和非心肌细胞）均成功实现了转染8，从而诱导血管生成9,10、促进心肌细胞存活11以及心肌细胞增殖12。单次给予编码突变型人follistatin样蛋白1的modRNA可诱导成年小鼠心肌细胞（CMs）增殖，并在MI后4周显著改善心脏功能，减小瘢痕面积，增加毛细血管密度12。最近一项研究报道，在猪模型中应用VEGFA modRNA可改善MI后的心脏功能10。
因此，随着修饰mRNA（modRNA）在心脏领域的应用日益广泛，建立并优化一种在心肌梗死（MI）后向心脏递送modRNA的实验方案显得至关重要。本文介绍了一种制备和递送经纯化与优化的modRNA的方案，该modRNA采用生物相容性的柠檬酸盐-生理盐水配方，可在不引发任何免疫反应的前提下实现强效且稳定的蛋白质表达。本方案及配套视频展示了通过永久性结扎左前降支冠状动脉（LAD）建立小鼠心肌梗死模型的标准手术操作，随后进行三个位点的心内注射modRNA。本文旨在明确建立一种高度精确且可重复的modRNA递送方法，以促进modRNA技术在小鼠心肌组织中的应用，推动其在心脏基因治疗领域的广泛使用。

<table><tbody><tr><td>三磷酸腺苷</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>包含于Megascript试剂盒中</td></tr><tr><td>南极磷酸酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>抗反向帽类似物，30-O-Mem7G(5')ppp(5')G</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>N-7003</td><td></td></tr><tr><td>生物发光成像系统</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>IVIS100电荷耦合器件成像系统</td></tr><tr><td>钝性拉钩</td><td>FST</td><td>18200-09</td><td></td></tr><tr><td>心肌肌钙蛋白I</td><td>Abcam</td><td>47003</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸胞苷</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>包含于Megascript试剂盒中</td></tr><tr><td>双通道麻醉系统</td><td>Harvard Apparatus</td><td>75-2001</td><td></td></tr><tr><td>镊子-Adson</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>镊子-Dumont #7</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸鸟苷</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>包含于Megascript试剂盒中</td></tr><tr><td>体外转录试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>5X MEGAscript T7试剂盒</td></tr><tr><td>插管套管</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaclear试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠呼吸机</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-4279</td><td></td></tr><tr><td>N1-甲基假尿苷-5-三磷酸</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>N-1081</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olsen Hegar持针器（带缝合剪）</td><td>FST</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>质粒模板</td><td>GeneArt, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尖头解剖剪</td><td>FST</td><td>14200-12</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Ethicon</td><td>Y433H</td><td>5.00</td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Ethicon</td><td>Y432H</td><td>6.00</td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Ethicon</td><td>7733G</td><td>7.00</td></tr><tr><td>T7 DNase酶</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>包含于Megascript试剂盒中</td></tr><tr><td>胶带站</td><td>Aligent</td><td>4200</td><td></td></tr><tr><td>转录纯化试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AM1908</td><td>Megaclear</td></tr><tr><td>Ultra-4离心滤器 10k</td><td>Amicon</td><td>UFC801096</td><td></td></tr></tbody></table>

在心肌梗死小鼠模型中递送修饰的mrna

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

心肌梗死（MI）是西方国家发病率和死亡率的主要原因。在过去十年中，由于基因治疗具有高效性和显著的治疗效果，已成为心脏病治疗的一种有前景的策略。为了修复心肌梗死后受损的心肌组织，已有多种研究采用基于DNA或病毒的基因治疗方法，但因目的基因表达水平低且难以控制，以及存在水肿、心律失常和心肌肥厚等问题而面临重大挑战。合成修饰的mRNA（modRNA）是一种新型基因治疗策略，可实现高效、短暂、安全、无免疫原性且可控的mRNA向心肌组织递送，且无基因组整合风险。由于这些显著特性，加之其在心脏中呈钟形的药代动力学特征，modRNA已成为治疗心脏病的一种颇具吸引力的方法。然而，为了提高其在体内的有效性，必须采用一种稳定且可靠的递送方法。因此，为最大限度地提高modRNA递送效率，并确保其在体内应用中结果的一致性，本文介绍了一种在小鼠心肌梗死模型中优化的modRNA心内注射制备与递送方法。该方案将使modRNA递送在基础研究和转化研究中更易于实施。

8至10周龄的小鼠使用异氟烷进行麻醉并实施气管插管。动物进入麻醉状态后，剃除左侧胸区毛发并用乙醇消毒，随后暴露心脏以进行左前降支（LAD）结扎。通过在左冠状动脉下方牢固打结缝合线实现动脉闭塞（示意图见图1A）。成功诱导心肌梗死（表现为左心室游离壁变苍白）后，使用胰岛素注射器将100 µg溶于柠檬酸蔗糖缓冲液中的Luc或Cre修饰RNA（modRNA）直接注射至损伤区域周围三个不同位点的心肌组织中（图1B）。每只动物的MI手术及modRNA注射过程持续30−45分钟。术后动物存活率约为90%。手术完成后，逐层紧密缝合胸腔和皮肤，并在动物恢复自主正常呼吸后立即撤除呼吸机支持。
在完成左前降支（LAD）结扎并随后注射 Luc modRNA 后，我们通过生物发光成像系统检测了注射后 24 小时的 Luc 蛋白表达，以验证 Luc modRNA 的转染效果（图 2A）。根据我们先前发表的研究，尽管转染后蛋白表达可持...

本方案介绍了一种在小鼠心肌梗死后利用修饰型mRNA（modRNA）瞬时上调目的基因的简单且连贯的方法。

在心肌梗死小鼠模型中递送修饰的mRNA

心肌梗死（MI）是西方国家发病率和死亡率的主要原因。在过去十年中，基因治疗已成为一种有前景的……

修饰RNA是一种将基因转移至心脏及其他器官的新型方法。本方案将提供一种精确的方法，用于在心肌梗死后暂时性地向心脏递送目的基因。该方法不仅限于心肌梗死模型，还可应用于缺血再灌注以及横主动脉缩窄模型。修饰RNA正被用于多项人类临床试验中。然而，目前尚无使用该方法将基因转入心脏的标准化操作流程。通过可视化演示，研究人员将能够准确地将修饰RNA注射至心脏的适当部位。本次操作将由本实验室的博士后研究员 Ajit Magadum 和动物管理主管 Elena Chepurko 进行示范。根据先前配制的 modRNA 浓度，计算出每 100 微克注射剂量所需的 modRNA 体积。配制等体积的蔗糖溶液和柠檬酸盐溶液。然后加入计算好的modRNA体积，并加入足够的生理盐水，使注射总体积达到60微升。麻醉动物后，将其仰卧放置，口部朝向实验操作者。为通过气管插管维持呼吸道通畅，需轻柔地拉出舌头。调整颈部角度以拉直插管路径，并插入插管导管。观察小鼠的胸廓运动，以确认双肺均获得氧气供应。呼吸频率应约为每分钟120次。开始左冠状动脉前降支结扎时，将小鼠小心地翻转至其右侧。提起皮肤，在第三和第四肋骨之间进行左侧开胸术。小心打开胸腔，避免任何尖锐物体接触肺部。将拉钩置入切口以保持胸腔开放，从而清晰暴露心脏。接着，将肺组织移至切口边缘，去除覆盖心脏的那部分心包膜。仔细辨认位于肺动脉与左心耳之间的一条深部淡红色血管，即前降支冠状动脉（LAD）。用单股丝线结扎近端前降支。使用胰岛素注射器，向心脏递送总共 60 微升的修饰 mRNA 溶液。在三个不同部位，每个部位注射 20 微升，进行肌内注射。在结扎部位的每侧各一个位点，以及心脏心尖一个位点。在正确位点注射修饰RNA的最佳方法是在结扎左前降支（LAD）后，在显微镜下观察组织变色情况。注射时，切勿刺入过深，以免进入心腔并进入循环系统。逐层缝合胸部切口。首先使用6-0丝线连续缝合固定肋骨，然后使用5-0丝线连续缝合皮肤。在恢复阶段，移除套管，让动物自主呼吸。将动物置于加热垫上，直至其恢复意识。在动物完全清醒之前，不得无人看管。为控制术后疼痛，需在手术后三天内每12小时皮下注射一次布托啡诺，剂量为每千克体重0.1毫克。在CFW小鼠进行左前降支冠状动脉结扎及荧光素酶modRNA注射24小时后，通过生物发光成像系统检测荧光素酶蛋白的表达，以验证转染效果。通过比较对照小鼠与注射了荧光素酶修饰RNA（luciferase modRNA）的小鼠图像，可以清晰检测到荧光素酶信号。荧光素酶信号的定量分析显示，经处理小鼠的蛋白表达水平显著高于对照小鼠。通过检测Cre modRNA在转基因ROSA26 mTmG小鼠中的翻译及生物分布，验证了其表达。 手术及cre modRNA注射后24小时，取材并进行免疫染色处理，所用标记物包括心肌细胞标志物心肌肌钙蛋白I以及细胞核标志

delivery-of-modified-mrna-in-a-myocardial-infarction-mouse-model

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

在心肌梗死小鼠模型中传递修正的mRNA

在小鼠急性缺血/再灌注损伤和慢性重塑的研究中，涉及多种基因操作和/或心肌内注射基因、蛋白质、细胞和/或生物材料，这些操作随时间维度叠加进行。本视频展示了缺血/再灌注、永久性冠状动脉结扎以及心肌内注射研究的显微外科操作步骤。...

冠状动脉结扎与心肌内注射在小鼠心肌梗死模型中的应用

在小鼠中诱导实验性心肌梗死的手术操作首先在第三和第四肋骨之间进行左侧开胸，以暴露心脏前表面和左肺。随后结扎左冠状动脉，关闭胸腔，小鼠可自行恢复。...

小鼠冠状动脉结扎术的改良技术

我们介绍一种外科手术方法，用于诱导实验性缺血/再灌注（I/R）损伤，以模拟小鼠模型中的心肌梗死（MI），该方法可更清晰地定位左前降支动脉（LAD）上的结扎位置，从而提高小鼠MI实验的可重复性。...

通过左前降支动脉结扎建立心肌缺血-再灌注损伤的小鼠模型

超声心动图引导下的经皮心肌内注射是一种高效、可靠且可靶向的小鼠心脏基因转导剂或细胞递送方法。按照本方案所述步骤操作，实验人员可迅速掌握这种用途广泛且微创的技术。...

超声引导下经胸心肌内注射小鼠技术

本文描述了一种在小鼠中建立心肌梗死的高可重复性模型，该模型仅需最少的侵入性操作。该模型易于实施，具有高重复性和高存活率。因此，该模型将减少实验所需的动物数量，符合3R原则（替代、优化和减少）的要求。...

小鼠心肌梗死诱导的微创手术操作

本文介绍了一种外科手术方法，用于实现小鼠左前降支冠状动脉的永久性结扎。该模型对于研究心肌梗死的病理生理学及其伴随的生物学过程具有重要意义。...

采用左前降支冠状动脉永久性结扎的小鼠心肌梗死模型

本文展示了一种用于研究小鼠心肌冷冻损伤后心脏重塑的模型。...

小鼠心肌梗死的冷冻损伤模型研究

在充分麻醉的条件下，通过肋间切口将小鼠心脏外置，并使用大多数实验室 readily available...

一种改良的简易小鼠心肌梗死诱导方法

本文介绍一种简单且可重复的方法，通过显微操作对小鼠左前降支冠状动脉进行精确结扎，从而诱导心肌梗死或心肌缺血-再灌注损伤。...

小鼠心肌梗死与心肌缺血-再灌注损伤的诱导

本文介绍了一种在小鼠中永久性结扎左冠状动脉的外科手术方法。该模型可用于研究心肌梗死后的心脏病理生理学变化及相关炎症反应。...

左冠状动脉结扎：一种小鼠心肌梗死的外科模型

学习使用修正mRNA在小鼠心肌梗死模型中进行基因递送的标准化方法。本方案展示心脏注射技术，实现目标基因的瞬时上调，适用于缺血再灌注等多种心脏损伤模型研究。

在心肌梗死小鼠模型中递送修饰的mRNA

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