Name: 用于测试（新）辅助疗法的不完全切除软组织肉瘤的小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: 了解不完全切除软组织肉瘤的小鼠模型，用于测试新辅助或辅助疗法。该标准化方法通过模拟术后残留病灶，帮助研究人员评估免疫治疗在术后伤口愈合环境中的疗效。

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本工作获得了“抗击肉瘤基金会”（Sock it to Sarcoma! Foundation）、澳大利亚和新西兰肉瘤协会以及儿童白血病基金会的资助。 &amp;#38; 癌症研究基金会与永久慈善基金会。W.J.L. 获得西蒙·李研究员奖学金、澳大利亚国家健康与医学研究理事会研究奖学金以及西澳大利亚癌症委员会的资助。

实验所用动物购自澳大利亚西澳大利亚州珀斯的动物资源中心。动物饲养于澳大利亚西澳大利亚州珀斯的哈里·珀金斯医学研究所生物资源北区设施，环境为标准无病原体条件。所有实验均依照哈里·珀金斯医学研究所动物伦理委员会批准的方案进行。实验中使用8至12周龄的BALB/c小鼠。WEHI 164纤维肉瘤细胞系购自澳大利亚新南威尔士州韦斯特米德的CellBank Australia。
1. 细胞接种
<ol>
	<li>细胞和动物的准备
	<ol>
		<li>确保细胞系在推荐的培养基中培养。例如，将 WEHI 164 细胞系培养于添加了 2 mM L-谷氨酰胺、10% 胎牛血清、20 mM HEPES、0.05 mM 2-巯基乙醇、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基中。 
		注意：细胞从冷冻保存中复苏后，至少传代 3 次，最多可传代 5 次。为确保最佳细胞活力，应在细胞融合度达到 70–80% 时进行传代。肿瘤细胞系应检测支原体污染，因为感染可能改变细胞生长特性并影响体内的免疫反应。</li>
		<li>接种前一天，使用电动剃毛器剃除小鼠右下腹部的毛发。 
		注意：本实验使用 8–12 周龄、体重正常（16–22 克）的雌性 BALB/c 小鼠。</li>
		<li>接种当天，当 WEHI 164 细胞融合度达到 70–80% 时，通过胰蛋白酶消化收获细胞。
		<ol>
			<li>吸除组织培养瓶中的培养基，然后加入无菌磷酸盐缓冲液（1× PBS），以去除残留的胎牛血清（FBS）。</li>
			<li>吸除 PBS，向培养瓶（T75）中加入 3 mL 0.05% 胰蛋白酶，轻轻旋转培养瓶，使胰蛋白酶覆盖整个细胞表面。</li>
			<li>将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 3 分钟。定期检查细胞，轻敲培养瓶壁以观察细胞是否已脱落。</li>
			<li>从细胞培养箱中取出培养瓶，加入 5 mL 含胎牛血清的培养基以中和胰蛋白酶。 
			注意：避免细胞在胰蛋白酶中停留过久，以免损伤细胞并导致细胞活力降低。</li>
			<li>反复吹打细胞悬液，获得单细胞悬液，并将其转移至锥形离心管中。</li>
			<li>在 350 × g 条件下离心 3 分钟，使细胞沉淀。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤细胞三次。
		<ol>
			<li>将细胞重悬于 50 mL 无菌 1× PBS 中，通过上下吹打混匀洗涤细胞，然后在 350 × g 条件下离心 3 分钟，使细胞沉淀。</li>
			<li>吸除上清液，将细胞重悬于 15 mL 无菌 1× PBS 中，再次通过吹打混匀洗涤细胞，然后在 350 × g 条件下离心 3 分钟，使细胞沉淀。</li>
			<li>吸除上清液，将细胞精确重悬于 10 mL 无菌 1× PBS 中，按步骤 1.1.4.2 的方法洗涤细胞，并取少量（约 100 µL）细胞悬液转移至离心管中用于细胞计数。在 350 × g 条件下离心 3 分钟，使细胞沉淀。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>采用台盼蓝排斥法，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞数量。将细胞重悬于无菌 1× PBS 中，调整浓度至 5 × 106 个细胞/mL。将细胞悬液置于冰上保存。 
		注意：肿瘤细胞的活力应等于或高于 80%，以确保肿瘤生长的可重复性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>皮下接种
	<ol>
		<li>充分混匀细胞悬液，用 26 G 针头的注射器吸取 100 µL 细胞悬液（含 5 × 105 个细胞）的无菌 1× PBS。每次装填新注射器前均需重新混匀细胞悬液。 
		注意：整个操作过程中应将细胞置于冰上，以维持细胞活力。</li>
		<li>适当固定小鼠，确保可接触其右下腹部区域。在已剃毛的右下腹部皮下接种细胞。 
		注意：接种时应略微抬起针头，确保针头位于皮下而非腹腔内，此时可在皮肤下观察到针头。接种后皮肤下应形成类似气泡的隆起。</li>
		<li>根据相关伦理审批要求监测小鼠状态，当肿瘤生长至约 50 mm2 时进行手术切除。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 肿瘤的部分手术切除
注意：本方案需要两名研究人员；一名负责手术操作（手术者），另一名负责小鼠监测（助手）。
<ol>
	<li>手术准备
	<ol>
		<li>接种后第12天，当肿瘤大小达到约50 mm2时，在手术前30分钟，于颈背部皮下注射100 µL（0.1 mg/kg）的丁丙诺啡。</li>
		<li>设置手术区域，使用覆盖实验服的加热垫，并设置麻醉用鼻罩。使用热珠灭菌器在使用前及每只动物之间对手术器械进行灭菌，确保器械冷却后再使用。&#160;准备好以下清洁且易于取用的手术器械：氯己定、棉签、纱布、眼用凝胶、两把弯头镊子、剪刀、施夹器、取夹器、备用夹子（图2A, 2B）。</li>
		<li>将加热恢复舱预热至37 °C，并另设一个加热垫用于术后恢复（图2C）。&#160;将已灭菌的器械放置在无菌表面，例如高压灭菌垫上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>将小鼠放入诱导舱中，使用4%异氟烷（4%浓度，100%氧气，流速1 L/min）进行麻醉，直至呼吸频率降至约每分钟60次（每秒1次）（通常耗时&#60;1分钟）。 
		注意：切勿让小鼠在舱内停留过久，以免导致窒息或死亡。每次仅允许一只小鼠处于麻醉状态。</li>
		<li>将小鼠转移至手术台上的加热垫，将其鼻部置于鼻罩中，以3–4%异氟烷（100%氧气，流速0.5 L/min）维持麻醉状态。持续监测呼吸频率，以确保麻醉深度适当。 
		注意：助手必须在整个手术过程中监测小鼠呼吸，以确保维持适当的麻醉水平。若呼吸过慢，应降低麻醉剂浓度；若麻醉过浅，则应提高浓度。若小鼠出现喘息，应立即将其移离鼻罩，降低麻醉浓度，并等待呼吸恢复正常后再重新置于鼻罩下。</li>
		<li>进行&#34;夹趾测试&#34;和&#34;角膜反射测试&#34;14，以确认小鼠在开始手术前已完全麻醉。 
		注意：小鼠任何部位的移动均表明其未完全麻醉，应立即通过提高麻醉浓度追加麻醉。</li>
		<li>在小鼠眼部涂抹少量眼用凝胶，以防角膜干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术操作（主刀）
	<ol>
		<li>用含酒精的氯己定对术区进行三次擦拭。使用镊子和剪刀，在肿瘤旁3 mm处沿背部做一条1 cm长的直线切口（图3A, 3B）。 
		注意：使用尺子将每只小鼠的切口标准化为1 cm，有助于在不同小鼠间对伤口愈合情况进行一致评估。将切口位置设于距肿瘤3 mm处，可便于后续进行瘤内辅助治疗，同时避免药物从伤口泄漏。</li>
		<li>使用镊子分离肿瘤与腹膜之间的筋膜及皮下脂肪组织。皮下肿瘤通常附着于皮肤侧。</li>
		<li>用镊子轻轻夹住带瘤侧的皮肤，将切口撑开，并将肿瘤&#34;外翻&#34;，使其暴露于体外（图3C, 3D）。 
		注意：需切除的肿瘤部分应靠近切口，以确保有足够的皮肤覆盖伤口。切除肿瘤时需小心，避免损伤皮肤。</li>
		<li>使用剪刀从靠近切口的肿瘤基底部开始，将需切除的一半肿瘤的包膜剪除。</li>
		<li>对于50%减瘤手术，从肿瘤中线横切。使用弯头镊子将需切除的部分（50%）挖出，并清除减瘤区域内的任何残留组织。</li>
		<li>对于75%减瘤手术，先按上述第2.3.5步完成50%肿瘤切除，然后将剩余的50%肿瘤再对半切开，使用弯头镊子挖出其中的25%部分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关闭手术切口
	<ol>
		<li>将剩余肿瘤复位至皮肤下方，使用镊子将两侧皮瓣拉拢，对齐切口边缘。</li>
		<li>在距切口边缘5 mm处固定皮肤，从靠近镊子的一侧开始使用外科夹闭合切口。根据需要使用足够数量的夹子，确保无皮下组织暴露。通常使用三到四个夹子，夹子之间间隔约2 mm。 
		注意：若某个夹子未正确固定，应使用取夹器将其移除，并更换新的夹子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠术后恢复（助手）
	<ol>
		<li>将小鼠放入预热至37 °C的加热恢复舱中，使其苏醒。</li>
		<li>将小鼠笼子置于加热垫上。在加热舱内持续观察小鼠，直至其从麻醉中恢复（清醒并能行走），然后将其放回笼中。继续将笼子置于加热垫上10分钟，直至小鼠活动明显增加。</li>
		<li>为小鼠提供湿润软食。术后1小时观察小鼠恢复情况，并确认夹子仍处于原位。&#160;确保笼子一半在加热垫上、一半在加热垫外，以便无人看护时动物可自行调节体温。</li>
		<li>术后6–8小时（当天结束前），在颈背部皮下注射0.1 mg/kg丁丙诺啡（100 µL）。次日清晨再次监测小鼠，并再次给予0.1 mg/kg丁丙诺啡（100 µL，皮下注射）。根据需要补充湿润食物。</li>
		<li>在接下来的七天内每日监测小鼠。七天后可使用取夹器移除夹子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>辅助或新辅助治疗
	<ol>
		<li>可根据研究所需的治疗方案，在围手术期对小鼠实施（新）辅助治疗。</li>
		<li>例如，在接种后第15天，腹腔注射（i.p.）单次100 µg抗CTLA-4抗体；或在接种后第15、17和19天，分别腹腔注射三次200 µg抗PD-1抗体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验对照
	<ol>
		<li>当使用该模型评估炎症或伤口愈合效应时，建议设置以下对照组：1）无手术对照组（仍可进行瘤内治疗）；2）假手术对照组：在皮肤上做切口，操作并暴露肿瘤，但不切除任何肿瘤组织，最后用夹子关闭切口。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

无利益冲突声明。

我们提供了一种小鼠软组织肉瘤不完全手术切除模型的实验方案，用于测试围手术期治疗策略。同时，我们标准化了手术切口方法，以便在治疗后对小鼠间的伤口愈合情况进行评估。
肿瘤接种位置是本方案的重要环节。我们选择皮下肿瘤模型，以便于手术操作和局部治疗的实施，同时尽量减少对小鼠的负担。还需确保肿瘤生长在皮下间隙而非腹腔内，否则可能导致意外的疾病发生和死亡。
在为本方案选择肿瘤细胞系时，我们建议选用在体内生长形成实体瘤（例如 WEHI-164 模型）的细胞，而非形成半固体瘤（如 B16 模型）的细胞，因为后者在技术上难以进行部分切除。此外，如果肿瘤开始穿透皮肤生长（通常出现在面积大于 100 mm2 的肿瘤中），则不建议进行减瘤手术，因为皮肤可能坏死，术后愈合不良。我们通过在肿瘤面积达到 50 mm2 时进行减瘤手术，克服了这一问题。
由于我们的模型可用于评估伤口愈合对治疗效果的影响，我们建议设置对照组/假手术组作为比较。对照组可采用未经处理...

手术仍是许多实体瘤的主要治疗手段1，包括软组织肉瘤2,3。尽管癌症外科技术不断进步，并可与（新）辅助治疗联合应用，但在原发肿瘤切除术后，癌症复发和转移的风险仍然较高4,5。在软组织肉瘤中，复发尤其常发生在手术部位的局部及区域范围内，导致发病率和死亡率升高。在临床实践中，常难以获得足够的切缘（例如由于解剖结构的限制），从而导致切除不彻底并引发肿瘤复发6。已知手术应激及随后的伤口愈合过程会形成一种免疫抑制性的肿瘤微环境，有利于肿瘤复发7,8。因此，在发现和开发针对软组织肉瘤的新疗法（特别是免疫疗法）时，理想情况下应充分考虑手术后的伤口愈合反应。
大多数辅助治疗的临床前研究最初使用皮下同系移植或异种移植小鼠模型进行，但未纳入手术应激和伤口愈合反应9,10。因此，我们建立了一种结合不完全手术切除的同系皮下小鼠软组织肉瘤模型。将 WEHI 164 纤维肉瘤细胞皮下接种，待肿瘤形成后，切除 50–75% 的肿瘤体积（图 1A–E）。残留肿瘤组织会持续再生。该模型可在考虑手术应激和伤口愈合影响的前提下，用于评估辅助治疗的效果。多个研究团队已在若干研究中采用类似的不完全切除手术模型，并证实其具有良好的可重复性和有效性11,12,13。本文中，我们对该实验方案进行了详细描述。

<table><tbody><tr><td>26 号 0.5 mL 胰岛素注射器</td><td>Becton Dickinson, Australia</td><td>326769</td><td>无</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>21985023</td><td>无</td></tr><tr><td>麻醉气体机</td><td>Darvall Vet, Australia</td><td>SKU: 2848</td><td>无</td></tr><tr><td>抗 CTLA-4 抗体</td><td>BioXcell, USA</td><td>BE0164</td><td>无</td></tr><tr><td>抗 PD-1 抗体</td><td>BioXcell, USA</td><td>BP0273</td><td>无</td></tr><tr><td>盐酸布托啡诺注射液，0.3 mg/mL</td><td>RB healthcare UK Limited, UK</td><td>55175</td><td>处方订购</td></tr><tr><td>氯己定外科洗手液 4%</td><td>Perigo Australia, Australia</td><td>CHL01449F(scrub</td><td>无</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>CellSera, Australia</td><td>AU-FBS-PG</td><td>无</td></tr><tr><td>精细镊子 10.5 cm</td><td>Surgical house, Western Australia</td><td>CC74110</td><td>无</td></tr><tr><td>带齿精细镊子 12 cm</td><td>Surgical house, Western Australia</td><td>CC74212</td><td>无</td></tr><tr><td>哈尔斯特德镊子 14 cm</td><td>Surgical house, Western Australia</td><td>CD01114</td><td>无</td></tr><tr><td>加热舱</td><td>Datesand Ltd, UK</td><td>Mini-Thermacage</td><td>无</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>15630080</td><td>无</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein Animal Health, Australia</td><td>SKU: 29405</td><td>处方订购</td></tr><tr><td>润滑眼膏</td><td>Alcon</td><td>n/a</td><td>无</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 1000 倍浓缩液</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>15140122</td><td>无</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 10 倍浓缩液</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>70013-032</td><td>无</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm 伤口夹</td><td>Able scientific, Australia</td><td>AS59038</td><td>无</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm 伤口夹施加器</td><td>Able scientific, Australia</td><td>AS59036</td><td>无</td></tr><tr><td>Reflex 伤口夹移除器</td><td>Able scientific, Australia</td><td>AS59037</td><td>无</td></tr><tr><td>啮齿类动物 Qube 麻醉呼吸回路</td><td>Darvall Vet, Australia</td><td>#7885</td><td>无</td></tr><tr><td>罗斯韦尔帕克纪念研究所 (RPMI) 1640 培养基 + L-谷氨酰胺</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>21870092</td><td>无</td></tr><tr><td>虹膜剪 STR 11 cm</td><td>Surgical house, Western Australia</td><td>KF3211</td><td>无</td></tr><tr><td>虹膜剪 STR 9 cm</td><td>Surgical house, Western Australia</td><td>JH4209</td><td>无</td></tr><tr><td>小型诱导舱</td><td>Darvall Vet, Australia</td><td>SKU: 9630</td><td>无</td></tr><tr><td>TrypLE express 1x</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>12604-021</td><td>无</td></tr><tr><td>Germinator 500 玻璃珠灭菌器</td><td>Cellpoint Scientific Inc., USA</td><td>5-1460-DK</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于测试（新）辅助治疗的软组织肉瘤不完全切除小鼠模型

A Mouse Model of Incompletely Resected Soft Tissue Sarcoma for Testing (Neo)adjuvant Therapies

手术通常是许多实体瘤的首选治疗方法。然而，尽管采用了辅助治疗或新辅助治疗，原发性肿瘤切除后仍常出现局部复发。当手术切缘未能充分清除肿瘤时，会导致残留癌细胞的存在。从生物学和免疫学角度来看，手术并非无影响的事件；伤口愈合环境已知可同时诱导促肿瘤和抗肿瘤通路。因此，在开发旨在预防局部复发的药物时，临床前模型在测试新的（新辅助）辅助疗法时应纳入手术切除步骤，以更好地模拟接受手术治疗患者的临床实际情况。
本文描述了一种不完全手术切除 WEHI 164 软组织肉瘤的小鼠模型，可用于在伤口愈合反应背景下测试（新）辅助治疗策略。在该模型中，切除 50% 或 75% 的肿瘤，保留部分癌组织原位，以模拟临床手术后存在的肉眼可见残留病灶。该模型可在手术背景下评估治疗方案，同时兼顾可能影响（新）辅助治疗疗效的伤口愈合反应。若不进行辅助治疗，所有小鼠均会出现可重复的肿瘤再生长。使用检查点阻断进行辅助治疗可减少肿瘤再生。因此，该模型适用于在减瘤手术及其相关伤口愈合反应背景下测试治疗手段，并可推广至其他类型的实体瘤研究。

肿瘤生长至50 mm2大小时，是进行部分减瘤术的理想尺寸。在未接受辅助免疫治疗的情况下，对50 mm2肿瘤进行不完全手术切除，可导致100%（n=5）的肿瘤可重复性再生长（图4A）。接下来，我们利用该模型测试针对检查点分子细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）和程序性死亡受体1（PD-1）的抗体作为辅助免疫治疗的效果。使用抗CTLA-4或抗PD-1治疗小鼠，其治愈率分别为80%和25%（每组n=4-5）（图4B、4C）。抗PD-1治疗所引发的反应为测试新型联合疗法以进一步提高应答率提供了机会。
<img alt="小鼠肿瘤研究示意图；肿瘤接种、手术、辅助治疗阶段；治疗时间线。" class="xfigimg" src=...

在本方案中，我们描述了一种用于测试（新）辅助治疗的软组织肉瘤不完全手术切除的小鼠模型。

手术通常是许多实体瘤的首选治疗方法。然而，尽管进行了辅助治疗……，原发性肿瘤切除后仍常出现局部复发。

本方案旨在模拟肿瘤减瘤手术后残留病灶的临床情况，因此使我们能够在术后伤口愈合的背景下测试新的癌症治疗方法。该技术的优势在于，能够标准化手术造成的伤口大小以及残留肿瘤的量。该技术对于临床前研究尤为重要，可用于识别那些易发生局部复发的癌症（例如软组织肉瘤）的新疗法。这种可视化演示对于展示翻转技术至关重要，该技术可使我们暴露附着在皮肤侧的肿瘤。按照文本方案所述，首先在小鼠体内皮下接种已准备好的癌细胞以启动实验。接种后第12天，当肿瘤大小达到约50平方毫米时，在手术前30分钟，通过颈背部皮下注射给予小鼠100 µL的丁丙诺啡。在手术区域放置覆盖实验台布的加热垫，并设置麻醉用鼻罩。准备好清洁的手术器械，确保触手可及，包括氯己定、棉签、纱布、眼用凝胶、两个弯头镊子、剪刀、施夹器、取夹器和备用夹子。将加热培养箱预热至37摄氏度，并另设一个加热垫用于术后恢复。请注意，该操作需要两人配合完成。操作过程中必须由一名助手密切监测小鼠的呼吸情况。按照文本方案中所述方法对小鼠进行麻醉后，需进行夹趾试验和角膜反射试验，以确认小鼠已完全麻醉，方可开始手术。用少量眼用凝胶覆盖小鼠的眼睛，以避免眼睛干燥。首先用氯己定擦拭手术区域。使用镊子和剪刀，在距离肿瘤3毫米处沿背部做一条1厘米长的直线切口。不要直接切开覆盖肿瘤的皮肤，因为其愈合效果不佳。避免使用手术刀切割肿瘤，应使用镊子挖取肿瘤组织。用镊子将肿瘤与腹膜之间的筋膜及皮下脂肪组织剥离。皮下肿瘤通常附着于皮肤侧。用镊子轻轻夹住带瘤侧的皮肤，将伤口打开，并翻转肿瘤使其暴露于体外可见。使用剪刀从靠近切口处的肿瘤基部开始，将需切除一侧的肿瘤包膜剪除。对于50%的减瘤手术，应从肿瘤中部进行切割。使用弯头镊子将要切除的肿瘤部分挖出，并将减瘤区域内的任何残留物一并清除。对于75%的肿瘤减容，首先进行50%的肿瘤减容，然后将剩余50%的肿瘤切除一半。使用弯头镊子刮取25%的肿瘤组织。关闭手术部位时，将剩余肿瘤重新置于皮肤下方，用镊子将皮瓣拉拢，对齐伤口处的皮肤边缘。在距离伤口边缘5毫米处固定皮肤，并使用外科缝合夹从靠近镊子的一侧开始闭合伤口。根据需要使用足够数量的缝合夹，确保没有皮下组织暴露。通常使用3至4个缝合夹，每两个缝合夹之间间隔2毫米。将小鼠放入温暖的加热舱中使其恢复。将小鼠的笼子放在加热垫上。在加热舱中监测小鼠，直至其从麻醉状态中恢复。然后将小鼠放回笼中，将笼子继续置于加热垫上约10分钟，直至小鼠活动能力恢复。给予小鼠湿润且柔软的食物。术后1小时观察小鼠恢复情况。在当天结束时及次日早晨再次观察小鼠，确保夹子仍处于原位。根据研究所需的治疗方案，可在围手术期或新辅助治疗阶段的任意时间对小鼠进行处理。例如，在接种后第15天，通过腹腔注射给予小鼠一次剂量为100 µg的抗CTLA-4抗体。或者，在接种后的第15、17和19天，分别以每次200微克的剂量腹腔注射抗PD-1抗体，共给药三次。对面积为50平方毫米的肿瘤进行不完全手术切除（如虚线所示），在未接受辅助免疫治疗的情况下，肿瘤再生长的可重复性达到100%。因此，将肿瘤生长至50平方毫米作为部分减瘤的理想尺寸。随后利用该模型测试了针对检查点分子的辅助性免疫疗法，所用抗体包括细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4和程序性死亡受体1。使用抗CTLA-4抗体治疗小鼠，治愈率达到80%；而使用抗PD-1抗体治疗小鼠，治愈率为25%。抗PD-1治疗所产生的反应为测试其新的联合疗法提供了机会，以进一步提高治疗反应率。重要的是，残留的肿瘤必须保持与皮肤相连，否则血液供应将被切断，导致肿瘤发生坏死。通过该方案，可采用多种方法对肿瘤进行分析，例如流式细胞术，以评估手术对肿瘤浸润细胞的影响。该小鼠模型使我们能够探索伤口愈合如何影响癌症免疫治疗。

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