手术应激探索术后免疫抑制的机制和评估新围手术期免疫疗法的小鼠肿瘤模型

该程序的总体目标是观察围手术期给予免疫治疗对减少转移以及肿瘤和手术应激小鼠模型的影响。这是通过首先在小鼠记忆脂肪垫中注射四个 T 1 肿瘤细胞以建立原发性肿瘤来实现的。在癌症手术前 13 天或前 1 天，进行免疫治疗，假设其可在肿瘤细胞植入后第 14 天减轻术后转移性疾病。

切除原发肿瘤，然后以腹部肾切除术和小鼠亚群的形式进行额外的手术负荷。最后一步是牺牲和量化所有小鼠中转移性肺肿瘤结节的数量。最终，这种自发性转移和手术应激的小鼠模型用于显示围手术期免疫治疗的有益效果。

这种方法可以帮助回答外科肿瘤学领域的关键问题，例如大手术如何影响免疫系统，并因此影响术后转移性疾病的形成，以及如何使用免疫疗法来减轻这种影响。演示此程序的将是 Christiano 10 dusa，一名研究技术人员和 Rebecca 博士的实验室 建立肿瘤细胞培养物。首先将未修饰的 41 个肿瘤细胞放入 10 厘米组织培养板中的完整 DMEM 中，并在 37 摄氏度 5%CO2 下在组织培养箱中孵育。

根据需要每周分流培养物 2 至 3 次，使细胞不超过 80% 汇合度。在建立细胞培养物后的一个月内，通过从组织培养板中吸出培养基开始收获肿瘤细胞。加入 10 毫升含有 2 毫升 EDTA 的 1 X 无菌 PBS，并在 37 摄氏度、5% CO2 下孵育板 5 至 7 分钟。

然后从板中取出 PBS 溶液后，用 PBS 冲洗板 2 到 3 次，并将细胞转移到 50 毫升锥形管中。接下来，在台式离心机中以 500 Gs 和 4 摄氏度离心细胞 5 分钟。吸出上清液后，重悬细胞沉淀和无血清 DMEM。

接下来，使用细胞计数器测定细胞浓度，用无血清培养基将细胞稀释至每 500 微升 6 个细胞的 10 倍，并在手术前一小时将细胞置于冰上。用每公斤丁丙诺啡 0.05 毫克皮下注射小鼠以控制疼痛。用 2.5% ISO 氟麻醉鼠标后，捏住脚垫以确保足够的麻醉水平。

然后在 30 号半英寸超细注射器中精确加载 50 微升肿瘤细胞悬液。轻敲注射器的侧面以去除气泡。继续 ISO 氟麻醉，将小鼠腹侧朝上放在手术台上。

现在将针头水平直接引入第四个记忆脂肪垫中，然后慢慢分配注射器体积。完成注射大约需要一分钟。注射后使用棉签清洁任何泄漏。

让鼠标从麻醉中恢复过来，然后再将其放回笼子。在细胞注射后 13 天，每 8 小时皮下注射 0.05 毫克/千克丁丙诺啡，持续两天，继续疼痛管理。使用外部卡尺测量原发肿瘤的大小。

用卡尺测量最大纵径或长度和最大横径或宽度。修正的椭球体公式用于计算肿瘤体积为长度乘以宽度平方的一半。此时，假设原发肿瘤测量约为 1 立方厘米，则已制备首选的围手术期治疗试剂，在这种情况下是溶瘤病毒 x 中的无菌 PBS。

在一个 27 号半英寸胰岛素注射器中精确加载 100 微升溶瘤病毒疗法。去除注射器中的所有气泡。接下来，将鼠标放入限制器中，让尾巴可触及。

使用温自来水，轻轻加热尾巴。要可视化外侧尾静脉，请选择外侧尾静脉并注射溶瘤病毒。如果针头适当地插入侧静脉，则按下注射器时不应感到阻力。

完成后，在 Postum 细胞注射 14 天时将鼠标放回笼中过夜。手术前一小时用每公斤丁丙诺啡 0.05 毫克皮下注射小鼠以进行疼痛管理，使用 2.5% ISO 氟诱导并维持麻醉。做一个 1 到 2 厘米的皮肤切口后，轻轻地从乳腺脂肪垫上去除整个原发性 4 T 1 肿瘤，肿瘤和任何附着的碎片应成块出来。

将肿瘤保存在福尔曼中，以备以后免疫组织化学分析。切除肿瘤后，用两到三个 9 毫米的钉子闭合切口。下一步是对小鼠亚群进行大手术。

从穿过皮肤和皮下层的腹侧中线切口开始。然后在线性肘部做一个 3 到 4 厘米的切口以进入腹膜。现在，将上覆的肠道移至一侧，露出腹部的左侧内侧。

用盐水浸泡的无菌纱布保持肠道湿润。接下来，使用一对钝的手术钳轻轻抓住左肾。然后使用绑成环的 3.0 蜡涂层编织丝缝合线结扎左肾肺门。

用三个手术结固定缝合线。现在用手术剪刀去除左肾。仔细检查缝合带，以确保达到足够的止血效果。

接下来，使用五根 oh 编织可吸收缝合线用连续环形缝合线闭合皮下层。然后使用 9 毫米的钉子钉住皮肤层。每只动物的肾切除术应需要 10 分钟。

恢复后，将动物放回笼子中，在注射 4 次 T 1 肿瘤后 28 天每 8 小时给予 0.05 毫克/公斤皮下注射丁丙诺啡，继续疼痛管理两天，对小鼠实施安乐死并喷洒 70% 乙醇。首先用剪刀在胸腔下方做一个初始切口。沿胸腔腹侧中线切开皮肤和皮下层，露出胸部。

然后通过每侧的皮肤和组织做横向切口，直到颈部。现在，轻轻抓住肺部，同时剪掉结缔组织，直到肺部自由。切开分叉上方的气管，将左叶和右叶固定在一起。

接下来，将提取的肺浸入冷 PBS 中以去除任何残留血液，并通过拍摄肺部进行肿瘤转移评估并称重以进行肿瘤负荷量化，将它们置于 10% 缓冲的福尔辛中。4 次 T 1 肿瘤切除术后 14 天，收获肺并可视化转移，此处显示为未进行腹部肾切除术的小鼠的肺。一些转移的肿瘤是可见的。

相比之下，肿瘤切除后立即进行的外科肾切除术导致肺转移数量明显增加。这张照片显示了肿瘤切除和肾切除术后用溶瘤病毒治疗的小鼠的肺，这里显示的是肿瘤切除和肾切除术后用流感疫苗治疗的小鼠的肺 计数这些类别中的每一个类别的肺肿瘤结节都显示，与未手术的小鼠相比，肺转移和接受肾切除术手术的小鼠的数量明显增加， 或那些接受术前治疗干预的患者。接受肾切除术但未进行术前治疗的小鼠的肺重量明显高于其他测试类别。

因此，术前复制溶瘤病毒和灭活流感疫苗的给药显着挽救了肿瘤切除后大手术的促转移作用。这些图表显示了 NK 细胞数量正常或完整的小鼠以及使用 anasi ALO GM one 药理学耗尽 NK 细胞的小鼠的肺肿瘤数量。NK 耗尽小鼠围手术期溶瘤病毒或流感疫苗免疫疗法的治疗效果降低。

这表明 NK 细胞在预防疫苗治疗后转移方面起中介作用。为了进一步表征 NK 细胞功能，评估离体 NK 细胞杀伤，从手术应激和未处理的对照中纯化 DX 五个阳性细胞，与牦牛单靶细胞一起培养。黑色实线表示未治疗小鼠的 NK 细胞杀伤能力，黑色虚线表示手术应激小鼠的 NK 细胞杀伤能力。

从黑色实线向下移动到黑色虚线所显示的细胞毒性百分比降低表明 NK 细胞细胞毒功能和手术后小鼠存在缺陷。灰色实线表示接受免疫治疗（溶瘤病毒或流感疫苗）但未接受手术的小鼠的 NK 细胞杀伤。灰色虚线表示接受围手术期免疫治疗和手术的小鼠的 NK 细胞杀伤能力。

从灰色实线向下移动到灰色虚线所显示的细胞毒性百分比降低表明，尽管接受了围手术期免疫治疗，但手术后小鼠的细胞毒性功能存在缺陷。最重要的是，灰色虚线仍然比黑色虚线高得多。这表明有可能通过围手术期免疫疗法挽救手术诱导的 NK 细胞毒性功能障碍。

看完这个视频，你应该对如何通过建立原发性最佳肿瘤来创建自发性转移和手术应激的动物模型有一个很好的了解。切除原发性肿瘤，通过肾切除术诱导额外的手术负荷，并在终点评估肺转移性肿瘤结节。此外，您应该了解如何使用该模型来研究手术对先天免疫系统的抑制作用以及免疫疗法逆转这种影响的能力。