蛋白质组学设施提交和后续数据分析的TMT样品制备

该协议的主要优点是，它降低了标签成本，改善了蛋白质提取，并生成了高质量的数据。我们协议的主要优点是不同类型的样品的高标签效率、其可重复性和可靠的数据采集。根据 IACUC 批准的协议，从安乐死小鼠身上分离出四头肌肌肉组织样本后，称量 10 毫克肌肉组织，并使用钳子分离肌肉纤维。

要创建一个解硅，将分离的组织样品转移到两毫升管中，其中含有 200 微升的 1 毫米氧化硅珠和 500 微升的 CHAPS 解解缓冲液。将样品放在珠子干扰器中，并连续运行两次 45 秒。在第二个周期后，为了释放DNA结合蛋白，每次声波以50%的振幅对样品进行10次声波化，在冰上间隔30秒。

最后一次声波化后，将乳酸离心，将上经剂转移到新的离心管中。为了减少/alkylating试剂处理，将每个条件的200微克蛋白质转移到新的离心管中，并使用新鲜的 CHAPS 解液缓冲液，使每个管的最终体积达到 100 微升。接下来，在每个管中加入5微升的TCEP，并在55摄氏度下孵育样品一小时。

在孵化结束时，将9毫克的碘乙酰胺溶解在132微升100毫摩尔 TEAB中，并保护由此产生的375毫摩尔碘多乙酰胺溶液免受光。然后在每个样品中加入5微升的碘多乙酰胺，并在室温下孵育30分钟，防止光线。对于甲醇/氯仿沉淀，每100微升蛋白质中加入400微升甲醇，并短暂地涡旋样品。

要将沉积在样品管两侧的液体混合，请短暂地将样品离心，并在每个管中加入100微升氯仿。短暂涡旋后，快速将管子再次离心，收集管子两侧的液体，并在样品中加入300微升水。在相同的离心机条件下，大力提供涡流，获得均匀溶液并离心样品一分钟。

在离心机的末尾，小心地将管子转移到机架上，而不干扰层，并小心地取出上流液。将300微升甲醇加入剩余的间位和底相，并再次对样品进行旋转。离心样品两分钟，小心吸上超钠。

然后在气流下从每个样品中轻轻吸出尽可能多的液体，直到颗粒有点潮湿。每两分钟评估一次水化，约10分钟。如果需要，颗粒可以储存在零下80摄氏度，直到进一步加工。

为了消化蛋白质，将沉淀的颗粒重新沉淀在100微升的 TEAB 解压缓冲液中，并在 100 微克 trypsin 玻璃瓶的底部加入 100 微升的 trypsin 储存溶液。在室温下5分钟后，每100微克蛋白质加入2.5微升新鲜制备的三普辛溶液，并在37摄氏度下孵育样品过夜。对于肽标签，将每个0.8毫克TMT标签瓶与每个标签41微升无水乙酰酸盐溶解，并在室温下孵育试剂5分钟，偶尔进行涡旋，同时保护标签免受光线影响。

在孵化结束时，短暂地将小瓶离心，并仔细将41微升TMT标签试剂添加到每100微升样品中，在室温下孵育一小时。在孵化结束时，在室温下加入8微升5%羟基胺，15分钟，使反应淬火。然后将样品分成等等物，放入新的离心管中，储存在零下80摄氏度。

在本次代表性数据采集中，共分析了39，653种肽，其中4，457个与两种独特的肽相等或大于两种，3，829个包括所有通道的报告离子。与健康细胞相比，使用折叠变化截止物来确定患病蛋白质的相对分布，而健康细胞的丰度明显较低，观察到的蛋白质为108种，丰度显著提高。PANTHER 分析显示，根据患病细胞的显著降低或更高丰度，基于其分子功能，蛋白质分类列表。

对显著低或更高丰度蛋白质的串分析进一步确定了蛋白质之间的多重相互作用和强关联。可以执行其他方法来识别蛋白质与蛋白质的相互作用，按组对相互作用进行分类，并确定各种途径中的相互作用。蛋白质组学技术是生物医学研究领域中通过提供详细的蛋白质丰度信息来了解疾病发展机制的有力工具。