基于细胞外基质与无细胞外基质的小鼠睾丸类器官生成方法

这些方案使用户能够在二维或三维培养条件下，于含细胞外基质（ECM）或无脱细胞基质（DCM）的环境中，大量生成结构模拟且具有内分泌功能的睾丸类器官。这些技术具有高度可重复性，易于应用于常规生物学实验室环境，且仅需使用常见的工具和材料。睾丸类器官是一种用于体外模拟精子发生过程及生殖内分泌学的新型工具，未来可能实现对体外配子发生的深入研究。

将已处死的小鼠仰卧置于解剖板上，并用70%乙醇消毒腹部。用镊子提起下腹部皮肤，用剪刀剪开。在腹部左下和右下腹股沟区域找到睾丸，切断其与输精管及任何锚定结缔组织的连接。

然后将整个睾丸从动物体内取出，放入含有预平衡BM的培养皿中。在解剖显微镜下，用小型显微解剖剪或用两把精细镊子轻轻撕开，于每侧睾丸一端的白膜上做一个小切口。在切口对侧固定睾丸的同时，用精细镊子轻轻挤压，并以扫动的方式向白膜上的切口处推进，即可将睾丸组织作为一个完整的整体挤出。

将组织切成更小的片段。将组织片段放入1毫升预热的解离溶液一中，在37摄氏度下孵育10分钟。孵育结束后，用P1000移液器轻轻吹打睾丸组织片段50次。

确保小管彼此之间以及与间质组织完全分离。如果仍有团块存在，则额外孵育5分钟，并再次进行吹打。每1毫升消化混合液中加入33微升透明质酸酶储存液。

然后用 P1000 移液器吹打 50 次，并将样品在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。孵育结束后，用 P200 移液器吹打 50 次。在确认无可见的管状结构或细胞团块后，加入 FBS 至样品总体积的 10% 以终止消化酶反应，并用 P200 移液器吹打数次。

用培养基润湿40微米细胞筛的中心区域，吸去液体，然后将样品加入预先润湿的细胞筛中，过滤以获得单细胞悬液。将悬液在100 × g条件下离心7分钟。弃去上清液，用新鲜骨髓培养基（BM）重悬细胞。使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上计数活细胞，然后再次离心并用新鲜BM重悬细胞。对于二维无细胞外基质（ECM-free）培养，直接将单细胞悬液接种到四孔腔室载玻片上，并将载玻片放入35°C培养箱中。

对于二维细胞外基质（ECM）培养，将100微升冰冷的、按1:1比例稀释的细胞外基质培养基加入四孔腔室载玻片中，确保凝胶覆盖培养皿底部。将载玻片置于培养箱中至少30分钟，使ECM聚合形成凝胶，随后将细胞悬液加于其上。对于三维无ECM培养，将琼脂糖三维培养皿放入24孔板中，并加入1毫升基础培养基（BM）。在35°C培养箱中用BM平衡至少30分钟，弃去BM后，再用1毫升新鲜BM重复平衡一次。移除孔中所有BM，在三维培养皿中央凹陷区域之外但不进入其中的位置加入200微升新鲜BM，然后吸除微孔插入物中央细胞接种凹陷区域内残留的BM。

将单细胞悬液加入中心凹槽中，轻轻吹打混匀。将培养皿置于35摄氏度、湿润的培养箱中进行培养。次日，缓慢而小心地移除琼脂糖三维培养皿周围的原有培养基，并更换为1毫升新鲜BM培养基。类器官应已在过夜培养后聚集成团，沉降至底部。

进行三维细胞外基质（ECM）培养时，通过将BM中的细胞悬液与冷的预解冻ECM等比例混合，制备单细胞悬液。反复吹打数次以确保充分混匀。然后立即将混合液分配至四孔板中，确保液体覆盖板底的整个表面。

将腔室载玻片在 35 摄氏度下孵育，并使其内容物聚合至少 30 分钟。聚合完成后，在培养物上方加入 500 微升 BM。所有类器官模型均在 35 摄氏度下进行培养。

对于所有培养类型，每隔两天更换一半的培养基，补充新鲜的BM培养基。本方案用于在24小时内利用幼年小鼠睾丸细胞实现类器官的生成。成功生成的组织最初表现为三维细胞簇。

在ECM环境中，细胞簇与其周围环境之间具有清晰的边界。还观察到细胞簇在ECM上迁移并相互融合。与所有其他培养方法相比，3D ECM培养需要显著更长的时间来从头组装新结构。

3D无细胞外基质培养在每个3D琼脂糖培养皿孔中形成了最大的细胞簇，每个孔内均包含一个大而致密的单一细胞簇。为了评估类器官模型是否与天然组织相似，对这些生物结构进行了细胞特异性标志物检测，并通过免疫荧光进行可视化观察。2D细胞外基质和3D无细胞外基质方法所生成的类器官均表现出高度模拟睾丸区室化结构的内部形态。

对3D细胞外基质非依赖性组装的类器官进行了长期分析。类器官培养14天后，检测了细胞和结构特异性标志物，观察到类似小管的结构。

在为期12周的培养中，通过促性腺激素刺激，对3D无细胞外基质类器官的内分泌功能进行了研究。从类器官条件培养基中定量检测了睾酮和抑制素B。12周后，去除促性腺激素48小时，导致睾酮和抑制素B浓度下降。

当重新加入促性腺激素后，两种激素浓度均显著升高，表明具有正常的内分泌反应性。类器官组装利用了存活的未成熟睾丸细胞的自主行为。通过使用定制的分选细胞或杂合细胞混合物，可轻松设计出创新性实验。

细胞接种后，可采用活细胞视频成像或延时成像来定量分析类器官的自我组装过程。在培养过程中，可收集类器官及条件培养基，用于组织学和氨基酸检测分析。