基于细胞基和细胞外矩阵的Murine睾丸器官生成
October 7th, 2020
在这里，介绍了从原发性新生儿穆林睾丸细胞生成睾丸器官的四种方法，即细胞外基质 （ECM） 和无 ECM 的 2D 和 3D 培养环境。这些技术具有多种研究应用，特别适用于研究睾丸发育和体外生理学。
这些协议使用户能够在 2D 或 3D 培养条件下的 ECM 和 DCM 无负载环境中产生大量的结构模仿和内分泌功能睾酮器官。这些技术具有高度可重复性，易于应用于标准生物实验室环境，并且仅使用通用工具和材料。睾丸器官是一种在体外模拟精子生成和生殖内分泌学的新工具，有一天可能有助于体外游戏发生的研究。
首先将安乐死小鼠在解剖垫上，用70%乙醇对腹部进行消毒。用钳子将下腹部的皮肤搭上帐篷，然后用剪刀打开。在腹部的左下、右下角区域定位睾丸，切断其与血管延迟和任何锚定结缔组织的连接。
然后从动物那里抬起整个睾丸。放在预平衡的 BM 的培养皿中。在解剖显微镜下，用小微解剖剪刀或用两个细钳轻轻撕裂，在每个睾丸的一端的图尼卡阿尔布吉纳做一个小切口。当从切口的另一端握住睾丸时，用细钳轻轻挤压它，然后向 tunica 上的孔推进一个清扫运动，这将释放睾丸组织作为一个内聚的一块。
将组织切成小块。将碎片放入一毫升预热分离溶液中，并在37摄氏度下孵育10分钟。孵育后，用P1000移液器轻轻三叶草30次。
确保管状分开彼此和从间状组织。如果团块仍然存在，再孵育五分钟，再三结。每毫升分离混合物中加入33微升的海卢罗尼达塞库存溶液。
然后用P1000移液器三重奏50次，在37摄氏度下孵育样品5分钟。孵育后，用P200移液器三联其50次。在确保不存在可见的团或细胞团后，通过将FBS加入样品总体积的10%并用P200移液器多次三联化，淬火分离酶。
用介质将 40 微米细胞滤株的中心弄湿并吸走，然后将样品添加到预湿滤片中，然后过滤以产生单细胞悬浮液。将悬浮液在 100 倍 g 下离心 7 分钟。丢弃上一液，在新鲜的BM中重新暂停细胞。使用 trypan 蓝色排除物计算血细胞仪上的可行细胞，然后重新离心，并在新鲜的 BM 中重新排水。对于 2D ECM 培养，板单单元悬架直接放在四井腔室的幻灯片上，然后将滑轨放入 35 摄氏度的培养箱中。
对于 2D ECM 培养，将 100 微升的冷一对一稀释的细胞外基质介质分配到四井腔室滑盘中，确保凝胶覆盖菜底。将幻灯片放在培养箱中至少 30 分钟，使 ECM 聚合到凝胶中，然后将电池悬浮液添加到顶部。对于 3D ECM 无培养，将阿加罗斯 3D Petri 菜肴放入 24 井培养皿中，并覆盖一毫升 BM。让盘子在35摄氏度的培养箱中平衡在BM中至少30分钟，然后丢弃BM，再用一毫升新鲜BM重复平衡。从井中拆下所有 BM，并分配 200 微升新鲜 BM 周围，但不是在 3D Petri 盘的中心凹槽内，然后从微井插入的中心细胞播种凹槽内收集任何剩余的 BM。
将单单元悬浮液分配到中心凹槽中，然后轻轻上下三角。将菜放入加湿的35摄氏度培养箱中，用于培养。第二天，缓慢而小心地从阿加罗斯 3D Petri 盘周围去除现有介质，代之以一毫升新鲜 BM。器官应该在一夜之间压实，让它们在底部休息。
对于 3D ECM 培养，通过将 BM 中电池悬架的相等部分与冷预解冻 ECM 相结合，准备单单元悬架。多次三次三次，以确保其混合良好。然后立即将混合物分配到四井室滑轨中，确保它覆盖整个板底。
孵育室在35摄氏度下滑动，并允许其内层聚合至少30分钟。聚合后，在培养基上加入500微升BM。培养所有有机模型类型在35摄氏度。
对于所有文化类型，每两天用新的 BM 交换一半的媒体。该协议用于使用幼年月脑睾丸细胞在24小时内实现器官生成。成功生成的组织最初被观测为3D细胞簇。
在 ECM 环境中，单元群集在群集与其周围环境之间具有清晰的边距。还观察到细胞簇在 ECM 之间迁移并熔断在一起。与所有其他培养方法相比，3D ECM 培养需要比所有其他培养方法更多的时间来组装新结构。
3D ECM 培养产生最大的集群，在 3D agarose Petri 盘的每个井内都有一个大型紧凑的聚类。为了评估器官模型是否与原生组织相似，对生物构造进行细胞特异性标记的探究，并用免疫荧光进行可视化。2D ECM 和 3D ECM 无 ECM 方法产生具有睾丸分块化内部形态高度模仿的器官。
对 3D 无 ECM 组装的有机体进行了长期分析。器官被培养14天，然后探究细胞和结构特异性标记。观察到了图勒状结构。
在具有腺激素刺激的12周培养物中，还研究了3D ECM无器官的内分泌功能。睾酮和因希宾B都是从器官条件介质中量化的。12周后，腺腺激素被移除48小时，导致睾酮和血红素B浓度下降。
当性腺激素返回时， 两种激素浓度显著增加， 表现出适当的内分泌反应.有机体组装利用可行的未成熟睾丸细胞的自主行为。通过使用定制细胞排序或混合细胞混合物，可以轻松设计创意实验。
在细胞播种之后，实时视频成像或延时成像可用于量化器官自组装。跨培养，器官和条件介质可以收集组织学和氨基测定分析。
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概述
本文描述了从新生鼠睾丸细胞中生成睾丸类器官的四种方法，使用ECM和无ECM培养环境。这些技术对于体外研究睾丸发育和生理特别有价值。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生殖生物学
- 体外技术
背景
- 睾丸类器官模拟精子发生和生殖内分泌学。
- 它们为研究睾丸发育提供了平台。
- 这些类器官可以在2D和3D培养条件下产生。
- 协议旨在标准实验室中易于重复和使用。
研究目的
- 开发创建睾丸类器官的方法。
- 促进睾丸生理学和配子发生的研究。
- 为体外生殖生物学研究提供新工具。
所用方法
- 新生鼠睾丸细胞的分离。
- 在ECM和无ECM环境中培养。
- 使用2D和3D培养技术。
- 应用常见实验室工具和材料。
主要结果
- 成功生成结构模拟的睾丸类器官。
- 展示了类器官的内分泌功能。
- 协议的高重复性。
- 未来体外配子发生研究的潜力。
结论
- 睾丸类器官是生殖研究的有前景工具。
- 这些方法可以推进对睾丸发育的理解。
- 未来应用可能包括配子发生和生育研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Murine testicular organoid generation using ECM-based and ECM-free protocols provides a reproducible in vitro platform for modeling testicular development, spermatogenesis, and endocrine function. This toolkit enables early-stage discovery teams to interrogate reproductive biology mechanisms and supports predictive confidence in translational research. The accessibility and scalability of these methods position them as valuable assets for portfolio triage and mechanistic de-risking in reproductive and endocrine R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of testicular cell self-assembly and compartmentalization relevant to reproductive biology.
- Supports functional validation of Sertoli, Leydig, germ, and peritubular cell inclusion in organoid models.
- Facilitates mechanistic de-risking by recapitulating native tissue architecture and endocrine responsiveness.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible organoid systems for downstream functional assays.
- Delivers quantitative outputs such as hormone secretion (testosterone, inhibin B) for assay development.
- Enables reliable evaluation of compound effects on testicular structure and function in vitro.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant testicular physiology for translational biomarker studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by modeling long-term endocrine function.
- Reduces biological risk by enabling risk-adjusted advancement decisions based on functional readouts.
Pipeline & Workflow Integration
These organoid generation protocols integrate into the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing, assay readiness, and translational research in reproductive biology.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven studies of testicular cell interactions and tissue assembly.
- Screening: Provides reproducible, quantitative hormone measurements for comparative analysis.
- Analytics: Supports immunofluorescence and hormone quantification to benchmark organoid fidelity.
- Translational Research: Models long-term endocrine function and tissue compartmentalization relevant to preclinical endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, accessible platform adaptable to diverse reproductive research initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in reproductive biology and endocrine function studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible protocols using common laboratory resources.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust in vitro models for early-stage evaluation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of reproductive and endocrine research programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and organoid culture techniques.
- Needs access to standard cell culture instrumentation and immunofluorescence analysis tools.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable across 2D and 3D model systems with ECM or ECM-free conditions.
- Limited to murine models and in vitro endpoints as supported by current protocols.
