基于细胞基和细胞外矩阵的Murine睾丸器官生成

这些协议使用户能够在 2D 或 3D 培养条件下的 ECM 和 DCM 无负载环境中产生大量的结构模仿和内分泌功能睾酮器官。这些技术具有高度可重复性，易于应用于标准生物实验室环境，并且仅使用通用工具和材料。睾丸器官是一种在体外模拟精子生成和生殖内分泌学的新工具，有一天可能有助于体外游戏发生的研究。

首先将安乐死小鼠在解剖垫上，用70%乙醇对腹部进行消毒。用钳子将下腹部的皮肤搭上帐篷，然后用剪刀打开。在腹部的左下、右下角区域定位睾丸，切断其与血管延迟和任何锚定结缔组织的连接。

然后从动物那里抬起整个睾丸。放在预平衡的 BM 的培养皿中。在解剖显微镜下，用小微解剖剪刀或用两个细钳轻轻撕裂，在每个睾丸的一端的图尼卡阿尔布吉纳做一个小切口。当从切口的另一端握住睾丸时，用细钳轻轻挤压它，然后向 tunica 上的孔推进一个清扫运动，这将释放睾丸组织作为一个内聚的一块。

将组织切成小块。将碎片放入一毫升预热分离溶液中，并在37摄氏度下孵育10分钟。孵育后，用P1000移液器轻轻三叶草30次。

确保管状分开彼此和从间状组织。如果团块仍然存在，再孵育五分钟，再三结。每毫升分离混合物中加入33微升的海卢罗尼达塞库存溶液。

然后用P1000移液器三重奏50次，在37摄氏度下孵育样品5分钟。孵育后，用P200移液器三联其50次。在确保不存在可见的团或细胞团后，通过将FBS加入样品总体积的10%并用P200移液器多次三联化，淬火分离酶。

用介质将 40 微米细胞滤株的中心弄湿并吸走，然后将样品添加到预湿滤片中，然后过滤以产生单细胞悬浮液。将悬浮液在 100 倍 g 下离心 7 分钟。丢弃上一液，在新鲜的BM中重新暂停细胞。使用 trypan 蓝色排除物计算血细胞仪上的可行细胞，然后重新离心，并在新鲜的 BM 中重新排水。对于 2D ECM 培养，板单单元悬架直接放在四井腔室的幻灯片上，然后将滑轨放入 35 摄氏度的培养箱中。

对于 2D ECM 培养，将 100 微升的冷一对一稀释的细胞外基质介质分配到四井腔室滑盘中，确保凝胶覆盖菜底。将幻灯片放在培养箱中至少 30 分钟，使 ECM 聚合到凝胶中，然后将电池悬浮液添加到顶部。对于 3D ECM 无培养，将阿加罗斯 3D Petri 菜肴放入 24 井培养皿中，并覆盖一毫升 BM。让盘子在35摄氏度的培养箱中平衡在BM中至少30分钟，然后丢弃BM，再用一毫升新鲜BM重复平衡。从井中拆下所有 BM，并分配 200 微升新鲜 BM 周围，但不是在 3D Petri 盘的中心凹槽内，然后从微井插入的中心细胞播种凹槽内收集任何剩余的 BM。

将单单元悬浮液分配到中心凹槽中，然后轻轻上下三角。将菜放入加湿的35摄氏度培养箱中，用于培养。第二天，缓慢而小心地从阿加罗斯 3D Petri 盘周围去除现有介质，代之以一毫升新鲜 BM。器官应该在一夜之间压实，让它们在底部休息。

对于 3D ECM 培养，通过将 BM 中电池悬架的相等部分与冷预解冻 ECM 相结合，准备单单元悬架。多次三次三次，以确保其混合良好。然后立即将混合物分配到四井室滑轨中，确保它覆盖整个板底。

孵育室在35摄氏度下滑动，并允许其内层聚合至少30分钟。聚合后，在培养基上加入500微升BM。培养所有有机模型类型在35摄氏度。

对于所有文化类型，每两天用新的 BM 交换一半的媒体。该协议用于使用幼年月脑睾丸细胞在24小时内实现器官生成。成功生成的组织最初被观测为3D细胞簇。

在 ECM 环境中，单元群集在群集与其周围环境之间具有清晰的边距。还观察到细胞簇在 ECM 之间迁移并熔断在一起。与所有其他培养方法相比，3D ECM 培养需要比所有其他培养方法更多的时间来组装新结构。

3D ECM 培养产生最大的集群，在 3D agarose Petri 盘的每个井内都有一个大型紧凑的聚类。为了评估器官模型是否与原生组织相似，对生物构造进行细胞特异性标记的探究，并用免疫荧光进行可视化。2D ECM 和 3D ECM 无 ECM 方法产生具有睾丸分块化内部形态高度模仿的器官。

对 3D 无 ECM 组装的有机体进行了长期分析。器官被培养14天，然后探究细胞和结构特异性标记。观察到了图勒状结构。

在具有腺激素刺激的12周培养物中，还研究了3D ECM无器官的内分泌功能。睾酮和因希宾B都是从器官条件介质中量化的。12周后，腺腺激素被移除48小时，导致睾酮和血红素B浓度下降。

当性腺激素返回时， 两种激素浓度显著增加， 表现出适当的内分泌反应.有机体组装利用可行的未成熟睾丸细胞的自主行为。通过使用定制细胞排序或混合细胞混合物，可以轻松设计创意实验。

在细胞播种之后，实时视频成像或延时成像可用于量化器官自组装。跨培养，器官和条件介质可以收集组织学和氨基测定分析。