Name: 基于细胞基和细胞外矩阵的Murine睾丸器官生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学习利用原代新生小鼠睾丸细胞在ECM及无ECM环境中构建睾丸类器官的方法。该技术可在二维或三维培养条件下生成结构模拟且具有内分泌功能的类器官，为研究生殖生物学和体外精子发生提供可重复的新型工具。

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本工作由美国国立卫生研究院下属的国立儿童健康与人类发展研究所（NICHD）F31 HD089693项目、国立环境卫生科学研究所/国立转化科学促进中心（NIEHS/NCATS）UH3TR001207和4UH3ES029073-03项目，以及托马斯·J·沃金斯纪念教授职位资助。
作者感谢 Eric W. Roth 在透射电子显微镜方面的协助。本研究使用了西北大学 NUANCE 中心的 BioCryo 实验室，该中心获得了软材料与混合纳米技术实验资源（SHyNE Resource，NSF ECCS-1542205）；材料研究中心的 MRSEC 项目（NSF DMR-1720139）；国际纳米技术研究所（IIN）；以及通过 IIN 获得的伊利诺伊州政府的支持。本研究还使用了 CryoCluster 设备，该设备获得了 MRI 项目（NSF DMR-1229693）的支持。图 1 中的示意图使用 BioRender.com 设计。

所有小鼠实验均经西北大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，所有操作均按照IACUC批准的方案进行。
1. 酶解组织解离溶液的制备
<ol>
	<li>使用两种不同的酶溶液（溶液1和溶液2），均以基础培养基溶液（BM）配制。</li>
	<li>配制BM时，将血清和青霉素-链霉素加入最低必需培养基中，使其终浓度分别为10%和1%（具体试剂见材料表）。然后将BM经0.22 μm滤膜无菌过滤。在用于细胞前，需将无菌BM预先平衡至中性pH值：将其分装至培养皿中，置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱内至少1小时。 
	注意：BM可在4 °C保存最多1周，之后应重新配制新鲜BM。</li>
	<li>配制胶原酶I储备液时，先将100 mg胶原酶I溶于1 mL无菌胚胎级H2O中（终浓度为10% m/v），颠倒或轻轻旋转混匀，分装为20 μL每份，于-20 °C保存备用。每份储备液仅可解冻一次。</li>
	<li>配制脱氧核糖核酸酶I（DNase I）储备液时，将20 mg DNase I加入1 mL无菌胚胎级H2O中（终浓度为2% m/v），颠倒或轻轻旋转使其溶解（切勿涡旋震荡），分装为20 μL每份，于-20 °C保存备用。每份储备液仅可解冻一次。</li>
	<li>配制透明质酸酶储备液时，将30 mg透明质酸酶加入1 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS；含Ca++/Mg++）中（终浓度为3% m/v），颠倒或轻轻旋转使其溶解，分装为100 μL每份，于-20 °C保存备用。该酶储备液可多次冻融而不影响其酶活性。</li>
	<li>配制解离用溶液1时，向1 mL无菌且已预平衡的BM中加入10 μL胶原酶I和10 μL DNase I（终浓度：1 mg/mL胶原酶I和5 μg/mL DNase I）。用移液器轻轻吹打混匀，并在使用前预热至37 °C。 
	注意：溶液2的配制方法是在下文步骤2.5中，于睾丸组织酶解过程进行至中途时，向每1 mL溶液1中加入33 μL已预热至37 °C的透明质酸酶（终浓度为1 mg/mL）。</li>
</ol>
2. 睾丸组织解离
注意：所有小鼠均饲养于聚丙烯笼具中，并可自由获取食物和水。小鼠饲喂经辐照处理且不含植物雌激素的饲料。所有实验均使用出生后5天（dpp）的CD-1幼鼠，在实施安乐死和组织采集前，通过连接异氟烷挥发器（氧气流速2.5 L/min）的麻醉舱进行麻醉。2通过脚趾刺激无反应确认小鼠完全麻醉后，采用断头法处死小鼠。
<ol>
	<li>将小鼠置于异氟烷麻醉舱中进行麻醉，通过脚趾刺激确认麻醉效果后，使用锋利的剪刀断头处死小鼠。将已处死的小鼠仰卧放置于解剖垫上，并用70%乙醇消毒腹部。用镊子提起下腹部皮肤，剪开腹腔。</li>
	<li>在腹部左下和右下腹股沟区域找到睾丸，剪断其与输精管及任何固定结缔组织的连接，然后将整个睾丸（附带附睾）从动物体内取出。将睾丸放入盛有预平衡BM培养基的培养皿中。</li>
	<li>在解剖显微镜下并在无菌环境中，使用微型解剖剪或用两把精细镊子轻轻撕开，在每个睾丸一端的白膜上做一个小切口。
	<ol>
		<li>然后，用镊子夹住切口对侧的睾丸末端，用精细镊子轻轻挤压睾丸，并以轻柔的扫动方式向白膜上的切口推动，即可释放出完整的睾丸组织块。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将睾丸切成更小的组织块（≤ 2 mm3），并放入1 mL预热至37 °C的解离液1中。
	<ol>
		<li>在37 °C孵育10分钟。</li>
		<li>若使用超过10个睾丸，每增加10个睾丸需额外增加1 mL解离液体积，确保每10个睾丸至少使用1 mL解离液（例如，20个睾丸使用2 mL，30个睾丸使用3 mL，依此类推）。</li>
		<li>使用P1000移液器在解离液1中轻轻吹打50次（50x），确保曲细精管彼此分离，并与间质组织分离。若仍有团块存在，继续孵育5分钟，并再次吹打50次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每1 mL解离液1混合物（含部分解离的睾丸组织和曲细精管）中加入33 μL透明质酸酶储备液（于步骤1.5中预热至37 °C）。加入透明质酸酶后的混合液称为解离液2。
	<ol>
		<li>使用P1000移液器吹打50次（50x），并在37 °C孵育5分钟。</li>
		<li>使用P200移液器吹打50次（50x）。</li>
		<li>此时应确保无可见的曲细精管或细胞团块残留。若仍有团块，可继续孵育最多5分钟，并使用P200移液器进一步吹打50次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过加入胎牛血清（FBS）至解离液2总体积的10%，以终止解离酶活性。使用P200移液器多次吹打以确保无团块残留，随后通过40 μm细胞滤网过滤，获得单细胞悬液。</li>
	<li>在100 x g 条件下离心7分钟，弃去上清液，将细胞重悬于新鲜BM培养基中。</li>
	<li>使用台盼蓝染色法结合血细胞计数板测定总细胞数和活细胞浓度。取10 μL按1:1稀释的细胞悬液与台盼蓝混合液，加入血细胞计数板的计数室中（见材料表）。
	<ol>
		<li>再次在100 x g 条件下离心7分钟，弃去上清，将细胞重悬于新鲜BM培养基中。 
		注意：仅使用活细胞计算细胞浓度和总数；用于类器官生成的细胞悬液活率应≥ 80%。</li>
		<li>根据后续第3节中所述条件配制单细胞悬液浓度，以便分装含有280,000个细胞的样品：2D无ECM条件为0.56 × 106 cells/mL，2D含ECM条件为0.56 × 106 cells/mL，3D无ECM条件为4.66 × 106 cells/mL，3D含ECM条件为2.8 × 106 cells/mL。 
		注意：本研究中所有培养实验均以每孔接种280,000个细胞为起始。这些数值与图1、图2、图3和图4中的代表性数据相对应。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 类器官培养皿的准备与细胞接种
注意：为确保细胞外基质（ECM）均匀，实验前需将冻存的ECM分装样品在4 °C冰箱或冷室中置于冰桶内过夜预解冻，以保证温度缓慢、逐步上升。所有ECM在培养时均以1:1比例与基础培养基（BM）混合稀释。解冻后的ECM以及1:1稀释的ECM在使用前应始终置于冰上，否则ECM可能发生过早聚合。
<ol>
	<li>对于无 ECM 的二维培养，无需特殊准备，将单细胞悬液（500 μL，浓度为 0.56 x 106 个细胞/mL 的 BM）直接接种至 4 孔培养板中，并放入 35 °C 培养箱中进行培养。 
	注意：细胞应在培养的最初 24 小时内贴附于培养皿底部，且在此期间可能出现一些小型三维细胞簇。</li>
	<li>对于含 ECM 的二维培养，将 100 μL 冷的 1:1 稀释的细胞外基底膜基质介质&#160;加入 4 孔培养板中，确保凝胶完全覆盖培养皿底部。
	<ol>
		<li>将培养板置于 35 °C 培养箱中至少 30 分钟，使 ECM 聚合形成凝胶。</li>
		<li>待凝胶聚合完成后，将细胞悬液（500 μL，浓度为 0.56 x 106 个细胞/mL 的 BM）直接加至二维凝胶表面。 
		注意：细胞应在培养的最初 24 小时内聚集形成小型三维细胞簇。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于无 ECM 的三维培养，在开始细胞培养前需先制备琼脂糖三维培养皿插件。
	<ol>
		<li>首先，将 1.5 g 琼脂糖粉末放入 100 mL 烧杯中进行高压灭菌，然后加入 75 mL 无菌蒸馏水，并用微波炉加热以制备用于三维培养皿成型的熔融 2% 琼脂糖溶液。</li>
		<li>在无菌操作环境下，将熔融琼脂糖倒入三维培养皿模具中，直至弯月面与模具边缘齐平。</li>
		<li>让琼脂糖冷却并凝固。凝固后，将模具倒置并轻轻反复弯折，直至琼脂糖三维培养皿从模具中脱落。 
		注意：此时可制备多个琼脂糖三维培养皿，并将其保存在无菌 H2O 或 DPBS 中，于 4 °C 下保存一个月以上。</li>
		<li>在进行细胞培养前，将琼脂糖三维培养皿放入 24 孔培养板中，并加入 1 mL BM 覆盖其表面。将三维培养皿置于 37 °C 培养箱中，至少平衡 30 分钟。弃去 BM，再用 1 mL 新鲜 BM 重复平衡一次。经 BM 平衡后，三维培养皿的颜色将与 BM 一致（即呈粉红色）。</li>
		<li>为准备接种细胞，移除孔中所有 BM，并在三维培养皿中心凹槽周围加入 200 μL 新鲜 BM，但不要加入中心凹槽内部。同时，吸除微孔插件中心细胞接种凹槽内残留的任何 BM。</li>
		<li>将单细胞悬液（60 μL BM 中含 4.66 个细胞/mL）加入琼脂糖三维培养皿的中心凹槽中。轻轻反复吹打以混匀细胞，确保在培养开始时形成单细胞悬液。</li>
		<li>将培养板放入 35 °C 恒温湿化培养箱中进行培养。次日，移除微孔插件周围的 200 μL BM，并更换为 1 mL 新鲜 BM。此举将使液面高于插件平面，从而完全浸没整个培养体系。</li>
		<li>缓慢且小心地从琼脂糖三维培养皿外部添加或移除培养基。类器官应已在过夜培养后紧密聚集，使其稳定沉降于底部，从而在更换培养基时不会扰动类器官。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于含 ECM 的三维培养，通过将 BM 中的细胞悬液与冷的预解冻 ECM 等体积混合，制备单细胞悬液（最终浓度 = 2.8 x 106 个细胞/mL）。
	<ol>
		<li>立即将细胞-ECM 混合物加入 4 孔培养板中，确保混合物完全覆盖培养板底部。</li>
		<li>将培养板置于 35 °C 培养箱中，使其内容物聚合，此过程至少需要 30 分钟。聚合完成后，在培养物表面加入 500 μL BM。 
		注意：细胞应在培养的最初 24 小时内聚集形成小型三维聚集体。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 类器官的维持
<ol>
	<li>将所有类器官模型类型在 35 °C 下进行培养。对于所有培养类型，每 2 天更换一半培养基，补充新鲜的 BM。为确保在更换培养基时不会意外收集到类器官，始终从腔室载玻片的角落缓慢收集培养基，或从琼脂糖 3D 培养皿外部区域收集。所有收集的培养基可储存于 -20 °C，用于后续的免疫分析或其他检测（例如，分泌型生殖激素或细胞因子的定量分析）。</li>
	<li>培养 7 天后，使用含有卵泡刺激素（最终浓度 20 mIU/mL）和人绒毛膜促性腺激素（最终浓度 4.5 IU/mL）的 BM。此步骤适用于所有类器官培养类型。</li>
	<li>定期对所有类器官培养物进行成像（例如，延时成像），以表征类器官的形成过程，并随时间量化其自组装、发育和生长的相关指标。</li>
</ol>
5. 类器官收集
注意：所有类器官均可使用 PBS 中 4% 多聚甲醛固定，用于后续免疫标记和组织学分析。室温下旋转固定 2 小时，或 4 °C 过夜固定。
<ol>
	<li>对于无细胞外基质（ECM）的二维培养，首先用新鲜的PBS冲洗样本，然后直接在贴壁的结构上添加固定剂。</li>
	<li>对于含细胞外基质（ECM）的二维和三维培养方法，先用PBS冲洗一次，随后可直接在ECM-类器官样本上添加固定剂（以同时固定ECM凝胶和类器官）；或者 alternatively，轻轻吹打类器官使其从周围的ECM中释放，然后转移至另一管中进行固定。</li>
	<li>对于无细胞外基质的三维培养，轻轻在琼脂糖三维培养皿的中央凹槽内吹打类器官，即可将类器官冲出，便于用移液器轻松收集。随后将类器官转移至另一管中进行固定。</li>
	<li>在进行石蜡包埋前，将大量类器官（≥ 20个）包埋于少量（约 30 μL）组织处理凝胶中；这有助于将类器官定向并集中于石蜡块内的较小区域，便于切片时更容易观察，以及在石蜡切片中更容易识别。 
	注意：类器官在石蜡包埋并用切片机切片后可能难以识别。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

完成本类器官生成方案后，研究者将掌握四种不同的培养技术，可用于在细胞外基质（ECM）或无ECM环境中构建睾丸类器官和组织结构。重要的是，这四种方法均允许研究者通过延时成像或视频记录，非侵入性地观察类器官的自组装过程，并可在不干扰组织培养状态的前提下，非侵入性地收集条件培养基，用于分析分泌的激素和细胞因子。在所有方法中，实验人员可在24小时内根据细胞数量生成多达数百个类器官/睾丸结构。这些方法可促进组织自组装形成具有不同大小和形态的结构；类器官的尺寸取决于培养中所用的细胞数量和浓度，这一点与其他类器官研究报道一致34。减小类器官的尺寸或直径可能有助于减少较大类器官中偶尔出现的中心区域坏死。二维ECM和三维无ECM方案的一个显著优势在于，能够生成在形态上模拟睾丸的类器官，其中包含管状结构与间质细胞类型的新生区室化分隔。此外，三维无ECM组装的类器官为生精小管样结构（TLS）的新生管状形成提供了模型，其中支持细胞（Sertoli cells）和管周细胞（peritubular cells）实现了适当的空间区室化和方向性排列。这是研究睾丸类器官的一个重要表型，但在目前已发表的不同睾丸类器官研究中，...

睾丸类器官是一种前沿技术，可用于在体外研究睾丸发育、精子发生及生理功能1,2,3,4。目前已有多种方法被用于类器官的构建，包括使用不同种类的细胞外基质（ECM）和无细胞外基质的培养系统，以及二维（2D）和三维（3D）培养模式。不同的构建方法可促进细胞以特定方式组装，从而导致已发表的睾丸类器官模型在形态和功能上表现出高度异质性。本文旨在综述当前体外睾丸模型的研究现状，并为未来研究人员设计睾丸类器官实验提供参考模板。在本研究中，定义并表征了四种不同的培养系统原型，涵盖其实验流程与生物学结果，分别为：2D无ECM培养、2D含ECM培养、3D无ECM培养和3D含ECM培养方法。本文所介绍的策略力求简洁、易于实施，并可在不同实验室和研究团队之间实现高度可重复性。
对于睾丸而言，“体外”（in vitro）这一术语历史上曾用于指代多种不同的睾丸组织和细胞培养方法。这些方法包括器官型组织/器官培养法（即组织块培养）5、分离的曲细精管培养6、睾丸细胞培养7，以及从头组织形态发生的方法（即生物构建体和类器官）1。最早关于体外精子发生的探索可追溯至大约100年前，1920年首次对兔睾丸组织块进行培养8，随后于1937年在小鼠组织块中开展类似实验9。在这些早期实验中，精原细胞在培养的第一周内大多发生退化，尽管也观察到一些进入减数分裂的分化细胞。与这些历史报道相似，睾丸组织块培养技术在2011年被重新启动并优化，成为研究睾丸功能的一种可行技术10。自2011年以来，已有多个研究报告通过组织块培养获得了具备生育能力的精子11,12,13。然而，由于组织块培养依赖于预先存在的天然睾丸曲细精管结构，这些近期进展更准确地应被描述为“离体”（ex vivo）睾丸功能和精子发生，即组织在从机体中取出后维持或恢复的功能。尽管该方法在文献中广泛使用，但在睾丸组织块中实现生殖细胞的长期维持和分化仍具有挑战性14,15,16,17,18，尤其是在足以完整观察体外精子发生的较长时间尺度上（小鼠约35天19，人类为74天20）。值得注意的是，百年前研究者所面临的许多相同挑战，至今仍在离体精子发生研究中持续存在。
与离体（ex vivo）方法不同，睾丸类器官是完全在体外由细胞来源（即原代睾丸细胞）从头组装而成的微组织。睾丸类器官提供了一种创新策略，可摆脱该领域长期以来对现有天然组织的依赖，实现在体外完全模拟睾丸生物学功能。大多数类器官组织模型具有若干共同要求，包括：（1）模拟体内组织形态或结构；（2）包含所代表组织的多种主要细胞类型；（3）在生成过程中具备自组装或自组织能力；（4）能够模拟所代表组织一定程度的功能和生理特性21,22,23,24。对于睾丸类器官而言，这些特征可归纳为四个主要标志：（1）包含睾丸的主要细胞类型，即生殖细胞、支持细胞（Sertoli）、间质细胞（Leydig）、管周细胞及其他间质细胞；（2）由细胞主导的组织组装过程；（3）细胞类型正确分区，分别形成管状结构区（生殖细胞和支持细胞）和间质区域（其他所有细胞类型）；（4）具备一定程度的组织功能（例如生殖激素分泌或组织应答，以及生殖细胞的维持与分化）。鉴于长期以来在体外和离体条件下维持生殖细胞分化的挑战，构建出模拟体内睾丸结构（即具有类似生精小管的结构）并具备提示睾丸生理功能（如内分泌功能）的额外标志物的类器官，是实现未来可能支持体外精子发生的关键里程碑。
目前大多数已发表的睾丸类器官方法利用了市售的细胞外基质（ECM）（例如胶原蛋白或专有的ECM配方）25,26,27，或定制来源的ECM（即脱细胞睾丸ECM衍生的水凝胶）28,29,30。外源性ECM通过为组织生成提供支持性支架，促进新生组织的形成。这些ECM方法已实现了较高水平的组织形成，包括一定程度的生殖细胞存在和模拟睾丸组织的形态结构25,28。然而，所使用的ECM并非总是普遍可得（例如脱细胞ECM衍生的水凝胶），且部分方法需要复杂的凝胶结构和细胞接种方式（例如三层ECM梯度结构或3D打印）25,31,32。无支架方法（例如悬滴法和非黏附培养板）33,34,35也已成功生成结构稳定且高度可重复的类器官，无需使用ECM凝胶或支架。然而，这些无支架类器官的组织形态通常与体内睾丸组织差异较大，且大多数此类研究仍需添加生化ECM成分以促进组织形成33,34,36，或依赖离心力强制细胞聚集和压缩34，因此在研究细胞自主迁移和自组织过程方面存在局限性。
本文介绍的四种类器官生成方法包括依赖细胞外基质（ECM）和非依赖ECM的策略，均采用简单的细胞接种方式，可实现对细胞驱动类器官自组装过程的观察。这四种技术均可使用相同的细胞悬液，也可利用定制的或特定细胞类型富集的细胞群体。这些方法的优势在于能够实时观察类器官的自组装过程，并直接比较不同培养微环境中睾丸结构的自组装方式。研究者应根据自身科研问题或研究主题，考虑这四种培养方法之间的表型差异。每种方法均能在24小时或更短时间内形成具有生物学功能的结构或类器官。总之，本文所述方法为体外研究睾丸类器官的组装、组织发育及睾丸生理功能提供了一套类器官构建技术工具箱。

<table><tbody><tr><td>0.22 µm 培养基无菌滤器</td><td>Millipore Sigma</td><td>scgpu05re</td><td>用于培养基的无菌过滤</td></tr><tr><td>3&amp;beta;HSD 一抗</td><td>Cosmo Bio Co</td><td>K0607</td><td>间质细胞标记物，1:500 稀释</td></tr><tr><td>AlexaFluor 568 &amp;alpha;-小鼠二抗</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>荧光标记的二抗</td></tr><tr><td>AlexaFluor 568 &amp;alpha;-兔二抗</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10042</td><td>荧光标记的二抗</td></tr><tr><td>α-最低必需培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-095-080</td><td>培养基基础成分</td></tr><tr><td>胶原酶 I</td><td>Worthington Bio</td><td>LS004197</td><td>用于解离液 1</td></tr><tr><td>Corning Matrigel 基底膜基质，无 LDEV</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>用于制备二维和三维 ECM 培养凝胶的细胞外基质</td></tr><tr><td>Countess 细胞计数仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10227</td><td>自动细胞计数仪（血球计数板仪器）</td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td>与 Countess 自动计数仪配套使用的血球计数板载玻片</td></tr><tr><td>DDX4 一抗</td><td>Abcam</td><td>138540</td><td>精原细胞标记物，1:500 稀释</td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I（2,280 u/mgDW）</td><td>Worthington Bio</td><td>LS002140</td><td>用于解离液 1</td></tr><tr><td>DPBS 1×，含 CaCl 和 MgCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040182</td><td>用于重组透明质酸酶</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液 +Ca/+Mg</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040117</td><td>PBS</td></tr><tr><td>胚胎级 H₂O</td><td>Millipore Sigma</td><td>W1503</td><td>用于重组胶原酶 I 和 DNase I</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>用于终止酶解解离溶液</td></tr><tr><td>卵泡刺激素</td><td>Abcam</td><td>ab51888</td><td>用于长期类器官培养</td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1063</td><td>用于长期类器官培养</td></tr><tr><td>透明质酸酶（来源于牛睾丸）</td><td>Millipore Sigma</td><td>H4272</td><td>用于解离液 2</td></tr><tr><td>抑制素 B 酶联免疫吸附测定试剂盒</td><td>Ansh Labs</td><td>AL-107</td><td>抑制素 B ELISA 试剂盒</td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828-028</td><td>基础培养基中的血清来源</td></tr><tr><td>MicroTissues 3D 培养皿微模具球体（24-35，5×7 阵列）</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z764051</td><td>用于无 ECM 的三维类器官制备</td></tr><tr><td>Nunc Lab Tek II 多孔腔室载玻片系统，4 孔</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-565-7</td><td>用于无 ECM 的二维、二维及三维 ECM 培养</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td>培养基用抗生素</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Histogel 样本处理凝胶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>辅助石蜡包埋</td></tr><tr><td>SOX9 一抗</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB5535</td><td>支持细胞标记物，1:500 稀释</td></tr><tr><td>Teklad Global 小鼠饲料（繁殖用）</td><td>Teklad Global</td><td>2920</td><td>不含植物雌激素的小鼠饲料</td></tr><tr><td>Teklad Global 小鼠饲料（维持用）</td><td>Teklad Global</td><td>2916</td><td>不含植物雌激素的小鼠饲料</td></tr><tr><td>睾酮酶联免疫吸附测定试剂盒</td><td>Calbiotech</td><td>TE373S</td><td>睾酮 ELISA 试剂盒</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>&amp;alpha;SMA 一抗</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2547</td><td>管周细胞标记物，1:500 稀释</td></tr><tr><td>&amp;beta;连环蛋白一抗</td><td>BD Biosciences</td><td>610154</td><td>支持细胞胞质标记物，1:100 稀释</td></tr></tbody></table>

基于细胞外基质与无细胞外基质的小鼠睾丸类器官生成方法

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

睾丸类器官为在体外研究睾丸发育、精子发生及内分泌功能提供了工具。目前已开发出多种构建睾丸类器官的方法。其中许多方法依赖于细胞外基质（ECM）以促进组织的从头组装，但在组织的仿生形态和功能方面，不同方法之间存在差异。此外，已发表的方法之间很少有直接比较。本文通过比较类器官生成方案及其结果，进行了直接对比研究。文中描述了四种典型的生成方法：（1）二维无ECM培养、（2）二维含ECM培养、（3）三维无ECM培养、（4）三维含ECM培养。评估睾丸类器官生成效果采用了三个主要基准：细胞自组装能力、是否包含主要细胞类型（支持细胞、间质细胞、生殖细胞和管周细胞），以及组织结构是否具有适当的区室化特征。在测试的四种培养环境之中，二维含ECM培养和三维无ECM培养所生成的类器官其内部形态最接近天然睾丸，包括管状结构与间质细胞类型的区室化分隔、管样结构的形成，以及稳定的长期内分泌功能。所有研究的方法均使用未经分选的原代小鼠睾丸细胞悬液，并采用常规可获取的培养资源。这些睾丸类器官生成技术为体外研究睾丸器官发生和生理功能提供了高度可及且可重复的实验工具包。

如果睾丸细胞在培养72小时内未能发生自组装，则认为类器官生成失败；然而，当使用幼年（5日龄）小鼠细胞时，本文所述所有方法均能在24小时内完成组装。生物结构生成失败的表现为细胞持续呈游离悬浮状态（图1中0小时列），即使延长培养时间（72小时）仍无改变。在缺乏组织自组装的情况下，任何看似形成的细胞团在轻微操作（如移液）下均极易分散为单个细胞。成功生成的组织最初表现为三维细胞“团块”（图1中6小时列的黄色箭头所示）。在无细胞外基质（ECM）环境（二维和三维）中，这些结构在培养最初24小时内明显出现“压缩”现象，尤其是在三维琼脂糖培养皿中（图1A,C）。在含ECM环境（二维和三维）中，细胞团块与其周围环境之间具有清晰的边界（图1B,D）。此外，观察到细胞团块可在ECM上迁移并相互融合，形成更大的团块（...

本文描述了四种利用新生小鼠睾丸原代细胞生成睾丸类器官的方法，即细胞外基质（ECM）依赖性和非依赖性的二维（2D）及三维（3D）培养环境。这些技术具有多种研究应用价值，尤其适用于体外研究睾丸的发育过程和生理功能。

睾丸类器官为在体外研究睾丸发育、精子发生及内分泌学提供了工具。目前已开发出多种方法……

这些方案使用户能够在二维或三维培养条件下，于含细胞外基质（ECM）或无脱细胞基质（DCM）的环境中，大量生成结构模拟且具有内分泌功能的睾丸类器官。这些技术具有高度可重复性，易于应用于常规生物学实验室环境，且仅需使用常见的工具和材料。睾丸类器官是一种用于体外模拟精子发生过程及生殖内分泌学的新型工具，未来可能实现对体外配子发生的深入研究。将已处死的小鼠仰卧置于解剖板上，并用70%乙醇消毒腹部。用镊子提起下腹部皮肤，用剪刀剪开。在腹部左下和右下腹股沟区域找到睾丸，切断其与输精管及任何锚定结缔组织的连接。然后将整个睾丸从动物体内取出，放入含有预平衡BM的培养皿中。在解剖显微镜下，用小型显微解剖剪或用两把精细镊子轻轻撕开，于每侧睾丸一端的白膜上做一个小切口。在切口对侧固定睾丸的同时，用精细镊子轻轻挤压，并以扫动的方式向白膜上的切口处推进，即可将睾丸组织作为一个完整的整体挤出。将组织切成更小的片段。将组织片段放入1毫升预热的解离溶液一中，在37摄氏度下孵育10分钟。孵育结束后，用P1000移液器轻轻吹打睾丸组织片段50次。确保小管彼此之间以及与间质组织完全分离。如果仍有团块存在，则额外孵育5分钟，并再次进行吹打。每1毫升消化混合液中加入33微升透明质酸酶储存液。然后用 P1000 移液器吹打 50 次，并将样品在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。孵育结束后，用 P200 移液器吹打 50 次。在确认无可见的管状结构或细胞团块后，加入 FBS 至样品总体积的 10% 以终止消化酶反应，并用 P200 移液器吹打数次。用培养基润湿40微米细胞筛的中心区域，吸去液体，然后将样品加入预先润湿的细胞筛中，过滤以获得单细胞悬液。将悬液在100 × g条件下离心7分钟。弃去上清液，用新鲜骨髓培养基（BM）重悬细胞。使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上计数活细胞，然后再次离心并用新鲜BM重悬细胞。对于二维无细胞外基质（ECM-free）培养，直接将单细胞悬液接种到四孔腔室载玻片上，并将载玻片放入35°C培养箱中。对于二维细胞外基质（ECM）培养，将100微升冰冷的、按1:1比例稀释的细胞外基质培养基加入四孔腔室载玻片中，确保凝胶覆盖培养皿底部。将载玻片置于培养箱中至少30分钟，使ECM聚合形成凝胶，随后将细胞悬液加于其上。对于三维无ECM培养，将琼脂糖三维培养皿放入24孔板中，并加入1毫升基础培养基（BM）。在35°C培养箱中用BM平衡至少30分钟，弃去BM后，再用1毫升新鲜BM重复平衡一次。移除孔中所有BM，在三维培养皿中央凹陷区域之外但不进入其中的位置加入200微升新鲜BM，然后吸除微孔插入物中央细胞接种凹陷区域内残留的BM。将单细胞悬液加入中心凹槽中，轻轻吹打混匀。将培养皿置于35摄氏度、湿润的培养箱中进行培养。次日，缓慢而小心地移除琼脂糖三维培养皿周围的原有培养基，并更换为1毫升新鲜BM培养基。类器官应已在过夜培养后聚集成团，沉降至底部。进行三维细胞外基质（ECM）培养时，通过将BM中的细胞悬液与冷的预解冻ECM等比例混合，制备单细胞悬液。反复吹打数次以确保充分混匀。然后立即将混合液分配至四孔板中，确保液体覆盖板底的整个表面。将腔室载玻片在 35 摄氏度下孵育，并使其内容物聚合至少 30 分钟。聚合完成后，在培养物上方加入 500 微升 BM。所有类器官模型均在 35 摄氏度下进行培养。对于所有培养类型，每隔两天更换一半的培养基，补充新鲜的BM培养基。本方案用于在24小时内利用幼年小鼠睾丸细胞实现类器官的生成。成功生成的组织最初表现为三维细胞簇。在ECM环境中，细胞簇与其周围环境之间具有清晰的边界。还观察到细胞簇在ECM上迁移并相互融合。与所有其他培养方法相比，3D ECM培养需要显著更长的时间来从头组装新结构。3D无细胞外基质培养在每个3D琼脂糖培养皿孔中形成了最大的细胞簇，每个孔内均包含一个大而致密的单一细胞簇。为了评估类器官模型是否与天然组织相似，对这些生物结构进行了细胞特异性标志物检测，并通过免疫荧光进行可视化观察。2D细胞外基质和3D无细胞外基质方法所生成的类器官均表现出高度模拟睾丸区室化结构的内部形态。对3D细胞外基质非依赖性组装的类器官进行了长期分析。类器官培养14天后，检测了细胞和结构特异性标志物，观察到类似小管的结构。在为期12周的培养中，通过促性腺激素刺激，对3D无细胞外基质类器官的内分泌功能进行了研究。从类器官条件培养基中定量检测了睾酮和抑制素B。12周后，去除促性腺激素48小时，导致睾酮和抑制素B浓度下降。当重新加入促性腺激素后，两种激素浓度均显著升高，表明具有正常的内分泌反应性。类器官组装利用了存活的未成熟睾丸细胞的自主行为。通过使用定制的分选细胞或杂合细胞混合物，可轻松设计出创新性实验。细胞接种后，可采用活细胞视频成像或延时成像来定量分析类器官的自我组装过程。在培养过程中，可收集类器官及条件培养基，用于组织学和氨基酸检测分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

基于细胞基和细胞外矩阵的Murine睾丸器官生成

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前列腺类器官培养作为将基因型和突变谱转化为药理学反应的工具

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利用成人人类成纤维细胞制备心脏细胞外基质用于培养皿包被

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本文介绍了一种将脾脏细胞在半固体基底膜基质中进行聚集和包封的实验方案。基底膜基质构建物可用于三维培养，以研究类器官的发育，或用于 体内...

基底膜基质包埋细胞聚集体用于研究小鼠脾脏组织形成

该方案详细描述了高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）小鼠模型的建立方法 体外 和 体内从小鼠输卵管类器官的建立，到通过基因改造模拟人类高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的遗传特征，再到将其移植至同系小鼠卵巢囊腔中 体内...

由小鼠输卵管上皮细胞建立类器官系用于高级别浆液性卵巢癌建模

本方案描述了一种基于明确成分水凝胶的方法，可在可控的三维培养系统中生成模拟乳腺形态发生关键特征的人类乳腺类器官。...

一种基于明确水凝胶的三维人乳腺类器官生成方法，可重现乳腺形态发生过程

学习利用原代新生小鼠睾丸细胞在ECM及无ECM环境中构建睾丸类器官的方法。该技术可在二维或三维培养条件下生成结构模拟且具有内分泌功能的类器官，为研究生殖生物学和体外精子发生提供可重复的新型工具。

基于细胞外基质与无细胞外基质的小鼠睾丸类器官生成方法

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