Name: 分离和富集人肺上皮祖细胞用于类器官培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 学习人肺上皮祖细胞分离与富集技术，通过组织解离和细胞分选方法建立三维类器官培养模型。该技术为研究肺部组织维持机制、疾病重塑及药物筛选提供了可靠平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢 Mizuno Takako 在 IFC 和 H&E 染色方面的支持，感谢 Vanessa Garcia 在组织切片方面的帮助&#160; 和&#160; Anika S Chandrasekaran 在手稿准备过程中提供的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（5RO1HL135163-04，PO1HL108793-08）和新基医药 IDEAL 联盟资助。

人肺组织来自已故组织捐献者，获取过程符合国际医学进步研究所（IIAM）制定的知情同意程序，并经西达斯-西奈医学中心机构审查委员会批准。
1. 从气管支气管或小气道/肺实质（小气道和肺泡）区域分离肺细胞的组织处理
<ol>
	<li>在细胞分离前一天，准备好所有解剖器械、玻璃器皿及相关溶液并进行高压灭菌。</li>
	<li>收到肺组织后，识别并分离近端和远端区域。气管和支气管被视为近端部分 &#34;近端&#34;本实验方案的目的在于&#160;气管及前2-3级支气管被分离出来，用于分离“近端”气道上皮。根据本方案，直径2 mm或更小的小气道及其周围实质组织被视为 &#34;远端肺上皮（图1A). 
	注意：所有涉及人肺组织处理的操作均应在生物安全柜中进行，并使用适当的个人防护装备。</li>
</ol>
2. 从远端肺组织中富集和分选小气道及肺泡上皮祖细胞
<ol>
	<li>远端组织制备
	<ol>
		<li>将远端肺组织置于无菌培养皿（150 × 15 mm）中，切成约1 cm大小的组织块3 将碎片放入干净的50 mL离心管中。</li>
		<li>用预冷的HBSS洗涤组织3次，每次弃去HBSS洗液，以去除血液和上皮衬液。</li>
		<li>将组织置于新的培养皿中，用无菌无绒布擦拭干燥。使用镊子和剪刀，尽可能去除大部分脏层胸膜（覆盖肺表面的一层 delicate 透明膜）。</li>
		<li>使用剪刀将组织剪切成直径约2 mm的碎片。将剪碎的组织转移至一个洁净的培养皿中，再用无菌单面剃须刀片进一步切碎，使其大小约为1 mm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶消化 
	注意：Liberase 储存液浓度为 5 mg/mL（100 倍），DNase 储存液浓度为 2.5 mg/mL（100 倍）材料表).
	<ol>
		<li>在50 mL锥形管中，向无菌HBSS中加入50 µg/mL Liberase和25 µg/mL DNase。</li>
		<li>将约2-3 g剪碎的组织转移至含有25 mL HBSS的新50 mL锥形管中，HBSS中含Liberase和DNase。在37 °C下以900 rpm持续振荡孵育40-60分钟。孵育30分钟后，使用30 mL无针头注射器吹打消化后的组织，以避免形成团块，随后继续孵育。 
		注意：酶孵育时间可能因组织类型或状态而异。例如，正常组织的酶消化约需45分钟，而特发性肺纤维化样本的纤维化组织可能需要长达60分钟的孵育时间。因此，此步骤中需密切观察组织，以防止表面标志物受损，这对FACS至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单细胞分离
	<ol>
		<li>用30 mL注射器连接16号针头，将组织反复吹打5次。将组织悬液吸入宽口移液管中，在负压条件下依次通过一系列细胞筛网（500 μm、300 μm、100 μm、70 μm、40 μm）。用20 mL HBSS+缓冲液冲洗滤网，以收集残留细胞。&#160;HBSS+ 缓冲液的配方可在 材料表</li>
		<li>加入等体积的HBSS+缓冲液至滤液中，孵育45分钟后以抑制Liberase活性，防止过度消化。</li>
		<li>离心滤液，500 × g x g 4 °C下离心5分钟。小心移除并弃去上清液。向沉淀中加入1 mL红细胞（RBC）裂解缓冲液，轻轻摇动离心管使沉淀重悬，冰上孵育1分钟。 
		注意：红细胞裂解液的使用量和作用时间取决于沉淀物的大小。保持细胞处于冰上，并严格控制红细胞裂解液中的处理时间，以防止目标细胞裂解，这一点至关重要。若红细胞裂解不充分，需重复该步骤。</li>
		<li>加入10–20 mL HBSS+缓冲液以中和红细胞裂解缓冲液。将滤液在500 × g离心 x g 4 °C 下离心 5 分钟。</li>
		<li>若裂解的红细胞（鬼影细胞）形成&#160;细胞沉淀上方出现浑浊层时，将沉淀重悬于10 mL HBSS+缓冲液中，经70 μm细胞滤网过滤以去除鬼影细胞。将滤液在500 × g离心 x g 4 °C下离心5分钟，然后进行后续步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫细胞和内皮细胞的耗竭（可选步骤）
	<ol>
		<li>耗尽 CD31+ 内皮细胞和CD45+ 使用CD31从总细胞群体中分离免疫细胞 &amp;#38; CD45 微珠（偶联单克隆抗人 CD31 和 CD45 抗体，同型为小鼠 IgG1）及 LS 柱，按照制造商说明书操作（材料表).</li>
		<li>收集流出液（主要含有上皮细胞和基质细胞）至新的无菌离心管中，在500 × g条件下离心 x g 4 °C下离心5分钟。进行细胞计数，以确定流穿液中的细胞总数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于荧光相关细胞分选（FACS）的细胞表面染色
	<ol>
		<li>重悬 1 x 107 每1 mL HBSS+缓冲液中加入相应数量的细胞。按所需浓度加入一抗，在4 °C避光孵育30分钟。本研究中，除非另有说明，均使用荧光染料标记的一抗。抗体来源及滴度详情见下文 材料表. 
		注意：HTII-280 目前是最佳的表面反应性抗体，可将远端肺细胞主要划分为气道细胞（HTII-280）-）和肺泡Ⅱ型（HTII-280+）细胞组分。该策略的一个局限性在于，AT1细胞无法通过此方法染色，且因其脆弱性而代表性不足。然而，在远端肺组织制备物中，AT1细胞同样代表性较低，推测是由于其脆弱性以及在通过FACS筛选活细胞过程中发生丢失所致，因此仅作为气道细胞组分中的罕见污染物存在。</li>
		<li>加入 3 mL HBSS+ 缓冲液洗涤细胞，于 500 × g 离心 x g 4 °C下离心5分钟。</li>
		<li>若使用未标记的一抗，加入适量浓度的荧光素标记二抗，冰上孵育30分钟。加入3 mL HBSS+缓冲液洗涤以去除未结合的二抗，500 × g离心 x g 4 °C下离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，按每 1 × 10⁶ 个细胞重悬于 HBSS+ 缓冲液中7 细胞/mL。通过带滤网的帽将细胞过滤至5 mL聚苯乙烯管中，以确保形成单细胞悬液。加入DAPI（1 μg/mL）对通透性（死亡）细胞进行染色。 
		注意：必须使用适当的单色荧光对照和荧光减一对照（FMO对照，即每管中分别缺失一种抗体的染色抗体混合物），以尽量减少流式细胞术（FACS）中的假阳性结果。在本研究中，使用了阳性与阴性筛选磁珠对荧光染料发射光谱间的重叠进行经验性补偿材料表). 通过FACS富集目标细胞类型。活的上皮细胞根据其CD45阴性、CD31阴性、CD236阳性细胞表面表型以及对DAPI染色呈阴性进行富集。该上皮细胞组分可进一步根据细胞类型特异性表面标志物的染色情况进行亚群分选，例如富集HTII-280阳性细胞，此类细胞富含AT2细胞。相反，通过HTII-280阴性筛选可富集小气道上皮细胞，如克拉拉细胞（club cells）和纤毛细胞。图2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从气管支气管气道中富集和分选上皮祖细胞
<ol>
	<li>组织准备
	<ol>
		<li>从肺组织中分离出近端气道（气管/支气管）。用剪刀沿其长度方向切开气道以暴露管腔，并加入50 µg/mL Liberase，确保完全覆盖组织。</li>
		<li>在37 °C下孵育20分钟，使用设定为900 rpm的恒温混匀仪持续振荡。</li>
		<li>将近端气道从离心管中取出，放入无菌培养皿（150 x 15 mm）中。用手术刀轻轻刮擦气道表面，彻底剥离管腔上皮细胞。</li>
		<li>用5 mL无菌HBSS+缓冲液冲洗培养皿，收集所有脱落的管腔上皮细胞，并将脱落细胞转移至50 mL锥形离心管中。使用装有16 G和18 G针头的10 mL注射器反复抽吸悬浮液5次，以获得单细胞悬液。&#160;</li>
		<li>在4 °C下以500 × g离心5分钟。将沉淀重悬于新鲜HBSS+缓冲液中，并将这些管腔气道细胞置于冰上保存，待与后续步骤中从剪碎的近端气道获得的单细胞悬液合并使用。</li>
		<li>用剪刀沿软骨环方向将剩余的气管-支气管组织剪成小条状，并将组织条转移至新的无菌培养皿中。使用单面剃须刀片将组织条切碎成更小的片段。 
		注：由于近端气道含有软骨，无法像远端肺组织那样被切得非常细碎。</li>
		<li>将剪碎的组织转移至C管中，加入2 mL Liberase，确保组织完全浸没。将C管装入自动组织解离仪，运行“人肺程序-2”以进一步机械解离组织。 
		注：本方案所用的组织解离仪为此特定应用提供了优化程序，称为“人肺程序-2”（见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶消化与单细胞分离
	<ol>
		<li>将约2 g剪碎的近端组织从C管转移至每个50 mL锥形离心管中，并向每管加入50 µg/mL Liberase和25 µg/mL DNase溶液。 
		注：为确保有效解离，离心管中的液体体积不应超过30 mL刻度线。</li>
		<li>在37 °C下孵育剪碎的组织45分钟，使用设定为900 rpm的混匀仪持续振荡。</li>
		<li>如上所述，在负压条件下将解离后的组织悬液依次通过一系列细胞筛网（500 μm、300 μm、100 μm、70 μm、40 μm），收集滤过液。用20 mL HBSS+缓冲液冲洗筛网，以回收残留细胞。 
		注：由于近端组织相比远端组织更具软骨性和体积较大，滤网堵塞的可能性更高。使用漏斗有助于防止液体在通过筛网时溢出。</li>
		<li>向滤液中加入等体积的HBSS+缓冲液以抑制Liberase活性，防止过度消化。在此步骤中，将3.1.5中分离得到的近端管腔气道细胞加入细胞悬液中。</li>
		<li>将合并后的细胞悬液在500 × g下离心10分钟。弃去上清液，并用HBSS+缓冲液重复洗涤细胞一次。按上述2.4节所述方法进行CD45+免疫细胞和CD31+内皮细胞的耗竭（可选步骤）。</li>
		<li>染色方法与远端肺组织相似，请遵循&#160;2.5节中的步骤。根据细胞表面表型CD45阴性、CD31阴性、CD236阳性以及DAPI染色阴性来富集活的上皮细胞。</li>
		<li>进一步根据细胞类型特异性表面标志物（如NGFR）的染色情况对上皮细胞组分进行亚群分选，从而富集基底细胞（NGFR阳性）和非基底细胞（NGFR阴性；包括分泌细胞、纤毛细胞和神经内分泌细胞）（图3）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 类器官培养
<ol>
	<li>将5,000个（此数目可根据所需上皮类器官密度进行调整）分选后的近端或远端上皮细胞与7.5 × 104个MRC-5细胞（人肺成纤维细胞系）加入无菌的1.5 mL离心管中。上皮-间充质相互作用对前体细胞的扩增至关重要。</li>
	<li>在4 °C下以500 x g离心5分钟。 
	注意：为确保类器官集落形成效率的准确性，必须手动确认分选仪获得的细胞计数结果。</li>
	<li>小心移除并弃去上清液，将细胞沉淀用50 μL冰上预冷并添加了抗生素的培养基重悬。将细胞悬液置于冰上保存。</li>
	<li>向离心管中加入50 μL冰上预冷的1×生长因子去除的基底膜基质培养基，并在冰上轻轻吹打混匀。 
	注意：使用冰上预冷的培养基并将细胞保持在冰上至关重要，以避免基底膜基质培养基过早聚合。</li>
	<li>将细胞悬液转移至24孔板中的0.4 µm&#160;孔径的细胞培养小室插件中（密度为1.4 × 104个细胞/cm2），注意避免引入气泡。</li>
	<li>在37 °C孵育30–45分钟，使基质凝固。</li>
	<li>向孔中加入600 μL预热的生长培养基。 
	注意：接种后前24小时，培养基中添加抗真菌剂（0.4%）和青霉素-链霉素（1%）；前72小时添加10 μM Rho激酶抑制剂。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2培养箱中培养30天，期间每48小时更换一次培养基。 
	注意：培养时间可根据实验目的进行调整。较长的培养时间用于研究分化过程，而若实验目的并非实现完全分化，则可采用较短的时间终点，如7天、14天等。</li>
	<li>在培养基中加入10 μM TGFβ抑制剂，持续培养15天，以维持细胞处于增殖阶段并抑制成纤维细胞过度生长。 
	注意：不同培养基用于实验时结果可能不同。例如，本研究中所示结果使用Pneumacult-ALI培养基获得，该培养基可使远端肺组织生成较大的类器官，并使近端肺组织生成分化良好且体积较大的类器官。</li>
</ol>
5. 类器官染色
<ol>
	<li>类器官的固定与包埋
	<ol>
		<li>吸除上下层跨膜插入室中的培养基，并用预热的 PBS 清洗一次。</li>
		<li>在插入室中加入 300 µL 多聚甲醛（PFA，2% w/v），在孔中加入 500 µL，于 37°C 固定 1 小时。去除固定液后，用预热的 PBS 清洗，注意避免移位基底膜基质塞。 
		注意：固定后的类器官可在 4 °C 的 PBS 中浸没保存 1 至 2 周，之后再进行后续步骤。</li>
		<li>吸除 PBS，将插入室倒置，小心沿其边缘剪开插入膜。使用镊子取出 transwell 膜，注意不要扰动基质塞。</li>
		<li>在培养皿中轻敲插入室，以回收基质塞。</li>
		<li>向基质塞中加入一滴标本处理胶（如保持在 37 °C 的 Histogel），并在 4 °C 下保持至胶体凝固。</li>
		<li>将组织块转移至包埋盒中，经梯度乙醇（70%、90% 和 100%）脱水，二甲苯透明，最后包埋于石蜡中。&#160;</li>
		<li>使用切片机切取 7 μm 厚的切片，并收集到带正电荷的载玻片上。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官的免疫荧光染色
	<ol>
		<li>将载玻片置于 65 °C 恒温 30 分钟以脱蜡。&#160;</li>
		<li>将切片浸入二甲苯中脱蜡，并通过梯度乙醇逐步复水。</li>
		<li>使用市售抗原修复仪，在抗原修复液（柠檬酸基）中高温修复抗原，将载玻片浸入溶液中 15 分钟（材料表）。</li>
		<li>使用疏水笔在组织周围绘制疏水屏障。</li>
		<li>在封闭缓冲液中孵育，以阻断一抗与组织之间的非特异性结合。</li>
		<li>将切片在湿润孵育盒中，于 4 °C 条件下与适当浓度的一抗稀释液共同孵育过夜。&#160;</li>
		<li>用洗涤缓冲液在室温下清洗切片 3 次。</li>
		<li>在室温下与适当浓度的荧光染料标记的二抗孵育 1 小时。</li>
		<li>用含 0.1% Tween 20 的 TBS 在室温下清洗切片 3 次。将切片在 DAPI（1 µg/mL）中孵育 5 分钟。再用含 0.1% Tween 20 的 TBS（Tris 缓冲盐水）清洗一次，干燥后用封片液封片（图 4 和 图 5）。 
		注意：用于免疫荧光染色的一抗和二抗的来源及最佳工作稀释度详见 材料表。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rackley, C. R., Stripp, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+and+maintaining+the+epithelium+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Building and maintaining the epithelium of the lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).</li>
<li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li>
<li>Plasschaert, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+the+airway+epithelium+reveals+the+CFTR-rich+pulmonary+ionocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte.</a> Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).</li>
<li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li>
<li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+organoids%3A+current+uses+and+future+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Lung organoids: current uses and future promise.</a> Development. 144 (6), 986-997 (2017).</li>
<li>Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Tissue+Homeostasis+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+in+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease.</a> Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).</li>
<li>Rawlins, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Scgb1a1%28%2B%29+Clara+Cells+in+the+Long-Term+Maintenance+and+Repair+of+Lung+Airway+but+Not+Alveolar%2C+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Chang, W. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp4+is+essential+for+the+formation+of+the+vestibular+apparatus+that+detects+angular+head+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements.</a> Plos Genetics. 4 (4), 1000050(2008).</li>
<li>McQualter, J. L., Bertoncello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Deconstructing+the+Lung+to+Reveal+Its+Regenerative+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential.</a> Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).</li>
<li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTII-280%2C+a+Biomarker+Specific+to+the+Apical+Plasma+Membrane+of+Human+Lung+Alveolar+Type+II+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-Dependent+Differentiation+of+Adult+Airway+Basal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).</li>
<li>Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+cultures%3A+current+trends+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond.</a> Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).</li>
<li>Hynds, R. E., Giangreco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+The+Relevance+of+Human+Stem+Cell-Derived+Organoid+Models+for+Epithelial+Translational+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine.</a> Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), (2014).</li>
<li>Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+test+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids test drug response.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 634(2018).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Organoids+and+Their+Use+To+Study+Cell-Cell+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pathobiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).</li>
<li>Teisanu, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+two+distinct+bronchiolar+progenitors+during+lung+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Cellular+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair.</a> American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+progenitors+are+region+specific+and+show+differential+responses+to+bleomycin-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury.</a> Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).</li>
<li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Human+Lung+Alveolus-on-a-chip+Model+of+Intravascular+Thrombosis+for+Assessment+of+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).</li>
<li>Mulay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+of+primary+human+lung+epithelium+for+COVID-19+modeling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们描述了一种可靠的方法，用于从人肺组织中分离出特定的肺细胞亚群，以进行分子或功能分析及疾病建模。该方法的关键要素包括能够实现组织解离的同时保留细胞表面表位，从而允许通过抗体介导富集新分离的细胞，并优化培养条件以高效生成具有区域特异性的上皮类器官。我们重点关注上皮前体细胞的回收与富集，这些细胞在三维培养中与间质支持细胞重组后能够形成类器官。尽管在本研究中未明确这些培养体系中类器官的克隆性，但类似研究利用携带不同荧光报告基因的混合小鼠肺上皮前体细胞培养体系已证实其具有克隆来源22,23。
本文所述方法包含若干改进措施，旨在提高从消化肺组织中回收细胞的效率。将消化后的样品通过16号针头，以进一步破坏任何残留的未消化组织团块，获得均一的细胞悬液。通过添加DNase I减轻了由释放的基因组DNA引起的细胞聚集，从而制备出均一的细胞样本，确保在FACS分离过程中流体系统的顺畅运行。这些简单的改进措施共同提高了目标细胞群体的回收率，并避免了FACS富集过程中因细胞聚集导致的延迟...

人体呼吸系统的气道大致可分为传导区和呼吸区，分别负责气体的输送以及通过上皮-微血管屏障进行气体交换。传导性气道包括气管、支气管、细支气管和终末细支气管，而呼吸区气道则包括呼吸性细支气管、肺泡管和肺泡。这些气道的上皮衬层沿近远轴方向在组成上发生变化，以适应各个功能不同区域的独特需求。气管-支气管气道的假复层上皮主要由基底细胞、分泌细胞和纤毛细胞三种细胞类型构成，此外还含有较少的其他细胞类型，包括刷细胞、神经内分泌细胞和离子细胞1,2,3。细支气管气道也含有形态上相似的上皮细胞类型，但在其丰度和功能特性上存在差异。例如，基底细胞在细支气管气道中含量较少，而分泌细胞则以克拉拉细胞（club cells）为主，相比之下，在气管-支气管气道中则以浆液细胞和杯状细胞占主导。&#160; 呼吸区的上皮细胞包括呼吸性细支气管中一种尚未明确界定的立方样细胞类型，以及肺泡管和肺泡中的I型肺泡细胞（ATI）和II型肺泡细胞（ATII）1,4。&#160;
目前对参与各区域上皮组织维持与更新的上皮干细胞及祖细胞类型的鉴定尚不完整，主要基于动物模型研究推断而来5,6,7,8。小鼠研究表明，假复层气道中的基底细胞&#160;、细支气管中的克拉拉细胞或肺泡上皮中的ATII细胞，因其具备无限自我更新能力和多向分化潜能，可作为上皮干细胞7,9,10,11,12。尽管尚无法在人类肺上皮细胞类型中开展遗传谱系示踪研究以评估其干性，但基于类器官的培养模型可用于评估上皮干细胞和祖细胞的功能潜能，为小鼠与人类之间的比较研究提供了&#160;有力工具13,14,15,16,17。
我们描述了从人肺不同区域分离上皮细胞类型并利用三维类器官系统进行培养的方法，以重现各区域的细胞类型。&#160;类似的方法已用于其他器官系统上皮细胞的功能分析与疾病建模18,19,20,21这些方法为鉴定区域性上皮祖细胞、开展机制研究以探索其调控机制和微环境，以及实现疾病建模和药物发现提供了平台。尽管在动物模型中进行的肺上皮祖细胞研究可从该分析中获益，但无论是 体内 或 体外人类肺上皮祖细胞身份的研究在很大程度上依赖于对模式生物的推断。因此，这些方法为关联人类肺上皮细胞类型的特性与行为，以及研究干细胞/祖细胞调控的相关工作提供了桥梁。&#160;

<table><tbody><tr><td>细胞分离</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL 无菌注射器，鲁尔锁扣式针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>BD 309646</td><td></td></tr><tr><td>30 mL 无菌注射器，鲁尔锁扣式针头</td><td>VWR</td><td>BD302832</td><td></td></tr><tr><td>生物危害废物袋</td><td>VWR</td><td>89495-440</td><td></td></tr><tr><td>生物危害废物袋</td><td>VWR</td><td>89495-440</td><td></td></tr><tr><td>连接环</td><td>Pluriselect</td><td>41-50000-03</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶（货号：SLBF7798V）</td><td>sigma Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>一次性培养皿</td><td>Corning/Falcon</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>漏斗</td><td>Pluriselect</td><td>42-50000</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>康宁</td><td>21-023</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM 研究级</td><td>sigma Aldrich</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>16G 针头</td><td>VWR</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>18G 针头</td><td>VWR</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 100 &amp;micro;m（细胞筛）</td><td>Pluriselect</td><td>43-50100-51</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 300 &amp;micro;m（细胞筛）</td><td>Pluriselect</td><td>43-50300-03</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 40 &amp;micro;m（细胞筛）</td><td>Pluriselect</td><td>43-50040-51</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 500 &amp;micro;m（细胞筛）</td><td>Pluriselect</td><td>43-50500-03</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 70 &amp;micro;m（细胞筛）</td><td>Pluriselect</td><td>43-50070-51</td><td></td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>仪器设备&amp;rsquo;s</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C 管</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Octo 组织解离仪</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>Leica ASP 300s 组织处理仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand**</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-503</td><td></td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-503</td><td></td></tr><tr><td>HBSS+ 缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15290018</td><td>2ml</td></tr><tr><td>EDTA（0.5 M），pH 8.0，无RN酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9260G</td><td>500&amp;micro;l</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>HBSS Hank's 平衡盐溶液 1X 500 ml</td><td>VWR</td><td>45000-456</td><td>500 ml 瓶</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15630080</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-新霉素（PSN）抗生素混合液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15640055</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>FACS 用抗体列表</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 抗人 CD326（EpCAM）抗体</td><td>BioLegend</td><td>369820</td><td>1:50</td></tr><tr><td>BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/阴性对照微粒套装</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB552843</td><td></td></tr><tr><td>CD31 MicroBead 试剂盒，人</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-935</td><td>20&amp;micro;升/10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; 总细胞数</td></tr><tr><td>CD45 微珠，人</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-801</td><td>20&amp;micro;升/10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; 总细胞数</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>FITC 抗人 CD235a</td><td>BioLegend</td><td>349104</td><td>1:100</td></tr><tr><td>FITC 抗人 CD31</td><td>BioLegend</td><td>303104</td><td>1:100</td></tr><tr><td>FITC 抗人 CD45</td><td>BioLegend</td><td>304054</td><td>1:100</td></tr><tr><td>FITC 标记的抗小鼠 IgM 抗体</td><td>BioLegend</td><td>406506</td><td>1:500</td></tr><tr><td>小鼠IgM抗人HT2-280</td><td>Terrace Biotech</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>1:300</td></tr><tr><td>PE 抗人 CD271（NGFR）</td><td>BioLegend</td><td>345106</td><td>1:50</td></tr><tr><td>类器官培养基的组成</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC-5</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 培养基</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>小气道上皮细胞生长培养基</td><td>PromoCell</td><td>C-21170</td><td></td></tr><tr><td>ThinCert 细胞培养小室，无菌</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662641</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632（ROCK抑制剂）100 mM 储存液（1000倍）</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr><tr><td>小鼠基础培养基：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15290018</td><td>50 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>DMEM/F-12，HEPES</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11330032</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS-G）（100倍浓缩）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>41400045</td><td>500 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-新霉素（PSN）抗生素混合液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15640055</td><td>500 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>SB431542 TGF-β&amp;beta; 通路抑制剂（储存液 100 mM）</td><td>干细胞</td><td>72234</td><td>5 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>免疫组织化学抗体列表</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>基于柠檬酸的抗原修复液</td><td>载体</td><td>H-3300</td><td>937 &amp;micro;100毫升水中1升</td></tr><tr><td>Histogel</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>一抗</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗 HT2-280</td><td>Terracebiotech</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>1:500</td></tr><tr><td>FOXJ1 单克隆抗体（2A5）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14-9965-82</td><td>1:300</td></tr><tr><td>人泌尿球蛋白/SCGB1A1 抗体</td><td>R 和 D 系统</td><td>MAB4218</td><td>1:300</td></tr><tr><td>角蛋白5多克隆鸡抗体，纯化 [Poly9059]</td><td>Biolegend</td><td>905901</td><td>1:500</td></tr><tr><td>MUC5AC 单克隆抗体（45M1）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MA5-12178</td><td>1:300</td></tr><tr><td>PDPN / Podoplanin 抗体（克隆 8.1.1）</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-C143022-100</td><td>1:300</td></tr><tr><td>纯化小鼠抗E-钙黏蛋白</td><td>BD生物科学</td><td>610182</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Sox-2 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-365964</td><td>1:300</td></tr><tr><td>二抗</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔IgG，488</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr><tr><td>FITC标记的抗小鼠IgM抗体</td><td>BioLegend</td><td>406506</td><td>1:500</td></tr><tr><td>山羊抗仓鼠IgG（H+L），Alexa Fluor 594</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-21113</td><td>1:500</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG1 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-21121</td><td>1:500</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG2a交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-21131</td><td>1:500</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG2a 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-21134</td><td>1:500</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG2b交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-21144</td><td>1:500</td></tr><tr><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>免疫组织化学封闭液</td><td></td><td></td><td>TBS（Tris 盐水）中含 3% BSA 和 0.4% Triton-X100</td></tr><tr><td>免疫组织化学孵育液</td><td></td><td></td><td>3% BSA，.1% Triton-X100 的 TBS 溶液</td></tr><tr><td>免疫组织化学洗涤液</td><td></td><td></td><td>含0.1%吐温20的TBS缓冲液</td></tr></tbody></table>

人肺上皮前体细胞的分离与富集用于类器官培养

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

上皮类器官模型是研究器官系统基本生物学特性及疾病建模的重要工具。当培养为类器官时，上皮前体细胞能够自我更新，并产生具有与其来源组织相似细胞功能的分化后代 体内 对应细胞。本文中，我们描述了一种逐步分离人肺组织中区域特异性前体细胞并建立三维类器官培养体系的实验与验证工具。我们定义了肺的近端和远端区域，旨在分离具有区域特异性的前体细胞。通过联合使用酶消化与机械解离方法，从肺和气管组织中分离获得总细胞。随后，利用基于细胞类型特异性表面标志物（如NGFR）的荧光激活细胞分选技术（FACS），从近端或远端来源的细胞中分选出特定的前体细胞亚群。&#160;用于分离基底细胞和HTII-280用于分离肺泡II型细胞。分离得到的基底细胞或肺泡II型前体细胞被用于生成三维类器官培养物。当在第30天以5000个细胞/孔接种时，远端和近端前体细胞均能形成类器官，其克隆形成效率分别为远端区域9–13%和近端区域7–10%。远端类器官维持HTII-280+ 培养中的肺泡II型细胞，而远端类器官在第30天分化为纤毛细胞和分泌细胞。这些三维类器官培养体系可作为研究肺上皮细胞生物学及上皮-间充质相互作用的实验工具，也可用于针对疾病中上皮功能障碍的治疗策略的开发与验证。

肺组织来源 
气管和肺外支气管（图1A）用作分离近端气道上皮细胞及后续生成近端类器官的组织来源。包含直径小于2 mm的肺实质和小气道的远端肺组织（图1A) 用于分离小气道和肺泡上皮细胞（远端肺上皮）并生成小气道类器官或肺泡类器官。由假复层上皮衬里的近端气道含有丰富的基底前体细胞，该细胞对膜蛋白NGFR呈免疫反应阳性。图1B，C）。相比之下，肺泡内衬上皮细胞中有一部分细胞在顶膜处显示对HTII-280单克隆抗体呈免疫反应阳性，提示其为肺泡Ⅱ型细胞（AT2）身份（图1B，D）。这些表面标志物用于对从近端或远端区域分离的上皮细胞单细胞悬液进行亚群分选。
组织解离与细胞分选 
从人肺组织的近端或远端区域分离出...

本文提供了一种详细的组织解离和细胞分馏方法，可用于富集来自人肺近端和远端区域的活体上皮细胞。本文中，这些方法被应用于通过三维类器官培养模型对肺上皮祖细胞进行功能分析。

上皮类器官模型是研究器官系统基本生物学特性及疾病建模的重要工具。当以类器官形式培养时，……

采用本方案可建立远端肺上皮组织的三维类器官培养体系。该模型为研究肺组织稳态维持或疾病相关重塑的基本机制提供了可操作的体系，并可作为药物发现与验证的有效平台。本方案可与其他组织解离及细胞分选方法兼容。由于来自不同解剖区域的上皮祖细胞在体外培养时能够维持其位置特性，因此可用于模拟肺部对内源性或外源性刺激所产生的区域性反应差异。该技术可用于分离不同亚群的上皮细胞，包括具有区域特异性的祖细胞，这些细胞可被培养以产生代表其来源区域的特化分化后代。收到肺组织后，应将近端的气管和支气管与远端肺上皮组织分离，后者包含直径小于或等于2毫米的小气道及周围的实质组织。将样品分别放入无菌的 150 × 15 毫米培养皿中，并将远端组织样品切成约 1 立方厘米大小的组织块。将组织块放入一个洁净的 50 毫米离心管中，每次用新鲜的预冷 HBSS 洗涤一次，共洗涤三次。最后一次洗涤后，将组织转移至新的培养皿中，并用无菌无絮擦拭巾吸干组织块表面液体。然后使用镊子和剪刀尽可能去除大部分脏层胸膜，再将组织切成直径约两毫米的碎片。对于组织碎片的消化，取50微克/毫升的liberase和25微克/毫升的DNase加入25毫升无菌HBSS中，置于50毫升锥形管内，并向管中加入约2至3克剪碎的组织。然后将组织置于37摄氏度条件下，以每分钟900转持续振荡消化40至60分钟。消化30分钟后，使用10毫升注射器吹打消化后的组织，以防止团块形成。消化结束后，使用配备16号针头的10毫升注射器吹打组织5次。然后使用宽口移液管在负压条件下将悬液依次通过一系列细胞筛网。用20毫升含钙镁的Hanks平衡盐溶液（HBSS plus）冲洗最后一个筛网，以收集残留的细胞，随后将滤液离心以收集分离的细胞。弃去上清液后，向细胞沉淀中加入1毫升红细胞裂解缓冲液，轻轻吹打混匀，并将细胞置于冰上孵育1分钟。孵育结束后，加入10至20毫升含缓冲液的HBSS以中和裂解反应，并通过离心收集剩余细胞。使用与单克隆抗人CD31和CD45抗体偶联的CD31和CD45磁珠及LS柱，按照生产商的说明书从总细胞群中去除CD31阳性内皮细胞和CD45阳性免疫细胞。进行FACS细胞表面染色时，加入所需浓度的相应一抗，于4°C避光孵育30分钟。孵育结束后，用三毫升 HBSS plus 洗涤细胞，并根据需要在冰上加入适当浓度的荧光染料标记的二抗，孵育 30 分钟。孵育结束后，再次用三毫升 HBSS plus 洗涤细胞，然后将细胞重悬于 HBSS plus 中，浓度为每毫升 1 × 10⁷ 个细胞，随后通过滤帽过滤至五毫升聚苯乙烯管中，以确保形成单细胞悬液。然后加入一微克每毫升的 DAPI 以染色可渗透的细胞。为了富集近端组织上皮祖细胞，从肺中分离出近端气道，并用剪刀沿其长度方向切开气道以暴露管腔。用每毫升50微克的Liberase覆盖组织，在37摄氏度下孵育20分钟，同时在摇床上持续振荡。孵育结束后，将组织转移至无菌的150毫米×15毫米培养皿中，用手术刀轻轻刮取气道表面，以彻底去除管腔内的上皮细胞。接着，用5毫升无菌HBSS加缓冲液洗涤培养皿，以收集所有脱落的腔面细胞，并将细胞转移至50毫升锥形离心管中。使用10毫升移液器将悬液连续吹打5次，以获得单细胞悬液。然后通过离心收集细胞悬液。然后将沉淀物重悬于冰上预冷的新鲜HBSS加缓冲液中。使用剪刀沿气管支气管组织的软骨环切开，制成小条状组织。在新的培养皿中，用单面剃须刀片将组织条切碎成更小的片段，并将组织碎片转移至C管中，每管含有2 mL liberase。然后使用 gentleMACS 自动解离仪上的人肺组织解离方案二，对组织进行进一步的机械解离。解离结束后，将约两克剪碎的近端组织转移至含有 50 微克/毫升 liberase 和 25 微克/毫升 DNA 酶溶液的 50 毫升锥形管中。在 37 摄氏度、振荡条件下孵育 45 分钟后，将组织悬液按远端肺组织所示方法依次通过一系列滤网过滤，并向滤液中加入等体积的含 HBSS 加样缓冲液，以终止消化反应。将分离的管腔近端气道细胞加入离心管中，通过离心收集细胞。随后可通过磁珠分离法富集细胞，并针对感兴趣的细胞表面标志物进行染色，方法与远端肺组织细胞的处理相同。由假复层上皮衬里的近端气道含有丰富的基底祖细胞，这些细胞对膜蛋白NGFR呈免疫反应阳性。相比之下，肺泡衬里的上皮细胞中有一部分细胞表现出对HTII-280单克隆抗体的顶膜免疫反应性，提示其为肺泡Ⅱ型细胞。通过磁珠耗竭法去除污染的红细胞、免疫细胞和内皮细胞，可显著富集远端和近端组织样本中的上皮细胞群体，同时提高流式细胞术（FACS）的分选效率。进一步采用FACS耗竭法可获得高度富集的远端细胞群体，并可根据其NGFR或HTII-280表面染色情况进行额外分选。HTII-280阳性的远端肺上皮细胞培养可快速形成类器官，平均克隆形成效率为10%。培养至第30天时的免疫荧光染色结果显示，含有管腔的类器官主要由HTII-280和SPC阳性的远端肺上皮细胞组成。由NGFR阳性细胞培养的近端肺上皮类器官在培养第30天时亦可形成含管腔的类器官，平均克隆形成效率为7.8%。经验性优化酶解组织解离条件对于保护细胞表面表位至关重要，可实现免疫荧光染色以及活体上皮细胞亚群的有效富集，进而用于生成区域特异性的有序培养体系。该方法可进一步拓展应用于免疫细胞、血管细胞、间质细胞及上皮细胞亚群的鉴定与富集，并可用于构建基于三维类器官芯片平台的共培养模型。我们最近报道了利用该技术生成的肺泡类器官作为研究SARS-CoV-2感染人肺上皮细胞以及进行COVID-19药物验证的平台。

isolation-enrichment-human-lung-epithelial-progenitor-cells-for

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

分离和富集人肺上皮祖细胞用于类器官培养

该方案可高效地将小鼠胚胎干细胞来源的定型内胚层诱导为成熟的气道上皮细胞。该分化技术在明确的无血清培养条件下，利用三维去细胞肺支架引导肺谱系特化。...

利用脱细胞肺支架生成胚胎干细胞来源的小鼠气道上皮细胞

本文描述了将诱导多能干细胞逐步定向分化为包含近端和远端肺上皮细胞以及间充质的三维全肺类器官的方法。...

利用诱导多能干细胞构建三维全肺类器官以模拟肺发育生物学及疾病

本方案介绍了一种从原代肺组织中获取人肺类器官、扩增肺类器官并诱导其向近端分化，从而生成能够真实模拟人类气道上皮的三维和二维气道类器官的方法。...

建立人类肺类器官及近端分化以生成成熟气道类器官

近年来，人类诱导性多能干细胞分化技术的进步使得能够逐步获得特定器官的细胞类型。本文详细介绍了由诱导性多能干细胞衍生的气道基底细胞的维持与扩增步骤，以及在气液界面培养条件下将其分化为黏液纤毛上皮细胞的具体方法。...

由人多能干细胞生成气道上皮细胞气液界面培养模型

本文介绍一种可重复、经济且稳健的方法，用于分离和扩增原代支气管上皮细胞，以实现长期生物样本库保存，并通过气液界面培养生成分化成熟的上皮细胞。...

从切除的肺组织中分离支气管上皮细胞用于生物样本库建设及建立高度分化的气液界面培养模型

我们描述了一种分离小鼠小肠隐窝并从隐窝培养肠道三维类器官的方案。此外，我们还介绍了一种在无上皮下细胞微环境的条件下，由单个肠干细胞生成类器官的方法。...

从小鼠肠隐窝及单个干细胞进行类器官的三维培养用于类器官研究

本文介绍了一种在气液界面培养系统中构建包含诱导性多能干细胞（iPSC）来源的肺上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和巨噬细胞的复杂多细胞气道屏障模型的方法。...

利用iPSC衍生的上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和免疫细胞共培养模拟肺部健康与疾病状态下的气道屏障完整性

本文介绍了一种从出生后小鼠中分离并培养小脑颗粒神经元前体细胞及小脑颗粒神经元的方法。...

出生后小鼠小脑颗粒神经元前体细胞及神经元的分离与培养

内皮集落形成祖细胞（ECFCs）是研究血管稳态与修复的有力工具1,2。本文介绍一种新型无动物血清的方法，利用混合人血小板裂解物（pHPL）从肝素抗凝的成人外周血中分离并扩增ECFC，从而降低抗牛血清免疫反应的风险。...

成人人类内皮集落形成祖细胞的分离与大规模扩增

本文将提供一种分离和培养鹌鹑或鸡HH14-期心脏瓣膜内皮细胞以及HH25期瓣膜垫间充质细胞的方法。...

禽类胚胎瓣膜前体细胞的分离与培养

学习人肺上皮祖细胞分离与富集技术，通过组织解离和细胞分选方法建立三维类器官培养模型。该技术为研究肺部组织维持机制、疾病重塑及药物筛选提供了可靠平台。

人肺上皮前体细胞的分离与富集用于类器官培养

探索更多视频