分离和富集人肺上皮祖细胞用于类器官培养

3D 类器官培养物位于使用该方案开发的远端肺上皮的近端。提供易于处理的模型来研究肺组织维持或疾病相关重塑的基本机制，并为药物发现和验证提供有效的平台。该方案与其他组织解离细胞分级分离方法兼容。

由于上皮祖细胞是从不同的解剖区室中分离出来的，因此在体外保持其位置同一性，因此可用于模拟肺对外源性或内源性刺激的反应的区域差异。该水平技术可用于分离上皮细胞的不同亚群，包括区域特异性祖细胞，这些细胞可以培养以产生代表原始区域的专业分化后代。接收肺组织后，将近端气管和支气管与远端肺上皮分开，远端肺上皮包含直径为 2 毫米或更小的小气道，以及周围的实质组织。

将样品放入单独的无菌 150 x 15 毫米培养皿中，并将远端组织样品切成大约 1 厘米的立方体。将碎片放入干净的 50 毫米管中，每次洗涤用新鲜的冷冻 HBSS 洗涤组织 3 次。最后一次洗涤后，将组织转移到新的培养皿中，并用无菌防绒湿巾将碎片吸干。

然后用镊子和剪刀尽可能多地去除内脏胸膜，然后将组织切成直径约为 2 毫米的碎片。对于组织片段消化，将每毫升 50 μg 的 liberase 和每毫升 25 μg 的 DNA 添加到 50 mL 锥形管中的 25 mL 无菌 HBSS 中。并在试管中加入大约 2 到 3 克切碎的组织。

然后将组织置于 37 摄氏度，以每分钟 900 转的速度连续摇晃 40 至 60 分钟。30 分钟后，使用 10 毫升注射器研磨消化的组织，以防止结块。孵育结束时，使用配备 16 号针头的 10 毫升注射器研磨组织 5 次。

然后如图所示，在真空压力下将悬浮液通过一系列细胞过滤器。用 20 毫升 HBSS plus 洗涤最后一个过滤器以收集任何剩余的细胞后，离心滤液以收集分离的细胞。弃去上清液后，用轻轻移液向沉淀中加入 1 毫升红细胞裂解缓冲液，然后将细胞孵育 1 分钟。

结束时，加入 10 至 20 mL HBSS 加缓冲液以中和裂解并通过离心收集剩余的细胞。根据制造商的方案，使用与单克隆抗人 CD31 和 CD45 抗体和 LS 柱偶联的 CD31 和 CD45 微珠，从总细胞池中去除 CD31 阳性内皮细胞和 CD45 阳性免疫细胞。对于 FACS 的细胞表面染色，添加所需浓度的适当目标一抗，并在 4 摄氏度下避光孵育细胞 30 分钟。

孵育结束时，用 3 mL HBSS plus 洗涤细胞，并酌情用适当浓度的荧光团偶联二抗标记细胞，在冰上孵育 30 分钟。在孵育结束时，用 3 毫升 HBSS plus 洗涤细胞，并以每毫升 HBSS plus 浓度的 10 倍至第七个细胞的速度重悬细胞，然后通过过滤器帽将细胞过滤到 5 毫升聚苯乙烯管中，以确保形成单细胞悬液。然后每毫升添加 1 微克 DAPI 对可渗透细胞进行染色。

对于近端组织上皮祖细胞富集，从肺部解剖出近端气道，并用剪刀沿其长度打开气道以暴露管腔。用每毫升 50 微克的 liberase 覆盖组织，在 37 摄氏度下孵育 20 分钟，同时在混合器上持续摇动。孵育结束时，将组织转移到 150 x 15 毫米的无菌培养皿中，用手术刀轻轻刮擦气道表面，将管腔上皮细胞从组织中完全剥离。

接下来，用 5 毫升无菌 HBSS 加缓冲液洗涤培养皿，以收集所有脱落的管腔上皮细胞，并将细胞转移到 50 毫升锥形离心管中。使用 10 毫升移液器连续研磨悬液 5 次，以获得单细胞悬液。然后通过离心收集悬浮液。

然后将沉淀重悬于冰上的新鲜 HBSS 加缓冲液中。用剪刀沿气管环剪下剩余的气管支气管组织，以产生小条状组织。在新培养皿中，使用单面剃须刀片将条带切成小块，然后将组织块转移到 C 管中，每管含有 2 毫升 liberase。

然后在 gentleMACS 自动解离器上使用人肺方案 2 进一步机械解离组织。在解离结束时，将大约 2 克切碎的近端组织转移到 50 毫升锥形管中，其中含有 50 μg/mL 的 liberase 和每毫升 25 μg 的 DNA 溶液。在 37 摄氏度振荡孵育 45 分钟结束时，通过一系列过滤器过滤组织浆液，如远端肺组织所示，并向滤液中加入等体积的 HBSS 加缓冲液以停止消化。

将分离的管腔近端气道细胞加入试管中，并通过离心收集细胞。然后可以通过微珠分离来富集细胞，并对感兴趣的细胞表面标志物进行染色，如远端肺组织细胞所示。由假复层上皮衬砌的近端气道包括丰富的基底祖细胞，这些细胞对膜蛋白 NGFR 具有免疫反应性。

相比之下，肺泡内衬的上皮细胞包括一个亚群，该亚群显示顶端膜与 HTII-280 单克隆抗体的免疫反应性，提示其肺泡 II 型细胞身份。污染红细胞、免疫细胞和内皮细胞的磁珠耗竭导致远端和近端组织样本中上皮细胞群的显着富集，FACS 效率相应增加。进一步的 FACS 耗竭导致高度富集的远端细胞群，这些细胞群可以根据其 NGFR 或 HTII-280 表面染色进行额外分级。

HTII-280 阳性远端肺上皮细胞培养产生快速扩增的类器官，平均集落形成效率为 10%第 30 天培养物的免疫荧光染色显示，含有类器官的管腔主要由 HTII-280 和 SPC 阳性远端肺上皮细胞组成。从 NGFR 阳性细胞培养的近端肺上皮类器官在培养第 30 天形成含有类器官的管腔，平均集落形成效率为 7.8%酶组织结合的经验优化对于保存表面表位至关重要，允许免疫荧光染色和富集活的上皮细胞亚群，用于后续生成区域特异性有组织的培养物。该方法适用于免疫、血管、基质和上皮细胞亚群的鉴定和富集，以及使用 3D 类器官芯片平台开发共培养模型。

我们最近描述了使用该技术生成的肺泡类器官作为研究人肺上皮 SARS-CoV-2 感染和 COVID-19 药物验证的平台。