Name: 从切除的肺组织中分离支气管上皮细胞用于生物样本库并建立分化的气液界面培养物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学习从切除的人肺组织中分离原代支气管上皮细胞，建立气液界面培养物用于生物样本库。该方法可生成具有纤毛活动和黏液分泌功能的细胞层，适用于研究呼吸道上皮细胞在健康和疾病中的功能及治疗反应。

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本研究中所使用的模型得到了多个资助机构的支持，包括荷兰肺病基金会、荷兰健康研究与发展组织（ZonMw，COVID-19 MKMD 项目资助）、荷兰动物实验替代促进会（Stichting Proefdiervrij，项目编号 #114025007），以及来自勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）和加拉帕戈斯公司（Galapagos）等企业的研究资助。图1 使用 BioRender.com 制作。

细胞取自荷兰莱顿大学医学中心接受肺癌切除手术的患者所获取的大体形态学正常肺组织。提供该肺组织的患者已纳入生物样本库 通过 用于此类组织的编码匿名二次使用，采用无异议制度（www.coreon.org）。然而，自2022年9月1日起，患者已根据莱顿大学医学中心（LUMC）生物样本库的当地规定，在机构医学伦理委员会批准（B20.042/Ab/ab 和 B20.042/Kb/kb）下，通过主动知情同意方式纳入生物样本库。
注意：除非另有说明，所有操作均须在生物安全柜中进行，并遵守当地的生物安全规定，在穿戴外科手套和实验服的前提下，于无菌工作条件下操作。本实验方案中使用的所有培养基、试剂及其他溶液，请参见材料表和补充表1。详细的实验步骤请参见图1
1. 从人肺组织中分离支气管上皮细胞
注意：为了获得支气管上皮细胞分离的最佳成功率，切除的支气管环应置于含有Primocin的磷酸盐缓冲液（PBS）中，4 °C下最多保存24小时，并始终保持浸没状态。
<ol>
	<li>操作开始前的准备工作
	<ol>
		<li>按照补充表1所述方法配制PBS中的包被液，并向适量的6孔板中每孔加入1.5 mL包被液进行包被。在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育2小时。 
		注：所需包被的孔数取决于切除组织的大小。粗略参考标准为：当切除的支气管环直径为10 mm、宽度为4 mm时，需包被四块6孔板。</li>
		<li>按照补充表1所述方法配制完全型无血清角质形成细胞培养基（c-KSFM）；每孔6孔板使用2 mL培养基。 
		注：该c-KSFM可在4 °C下保存7天。c-KSFM是一种低钙培养基，用于扩增气道上皮细胞，同时抑制污染性成纤维细胞的生长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在10 cm培养皿中用10 mL无菌PBS轻轻冲洗支气管环以清洁组织。使用镊子小心夹住支气管环（仅接触外侧），并用小剪刀去除多余的结缔组织和血渍残留物。为进一步处理，将支气管环切成两半。 
	注：操作过程中使用的所有器械在使用前均应灭菌。</li>
	<li>将支气管环的两半浸入含有Primocin的预热蛋白酶XIV（1.8 mg/mL）Hank's平衡盐溶液（HBSS）10 mL中，置于密闭无菌容器内，在细胞培养箱中37 °C精确孵育2小时。 
	注：HBSS作为蛋白酶XIV的稀释液，在2小时孵育期间用于从组织中解离细胞。HBSS是一种等渗平衡溶液，可在短期孵育过程中维持细胞活力。</li>
	<li>孵育结束后，将组织块转移至含10 mL温PBS的培养皿中，使用弯头镊子刮擦支气管环内壁，以获得细胞悬液。 
	注：此时组织外观变软且略有膨胀。</li>
	<li>弃去支气管环，将细胞悬液转移至50 mL离心管中，并加入温PBS使终体积达到50 mL。在室温（RT）下以230 × g离心7分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将沉淀物重悬于10 mL温PBS中，再用温PBS补至终体积50 mL。在室温（RT）下以230 × g离心7分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于适量含Primocin的温c-KSFM中。 
	注：Primocin需至少使用7天，以清除组织中可能存在的细菌、真菌或（尤其重要的）支原体污染；7天后，培养基中仅添加青霉素/链霉素即可。</li>
	<li>从6孔板中吸除包被液，每孔加入2 mL细胞悬液。</li>
	<li>让细胞生长至80%–90%汇合度，并每周更换培养基三次（例如每周一、周三、周五）。通常在7至14天内达到所需汇合度；若达到所需汇合度所需时间超过14天，则弃用该批细胞。 
	注：在最初几天仅有少量细胞开始增殖；数天后可观察到细胞集落的形成。</li>
</ol>
2. 人原代支气管上皮细胞（PBECs）的冷冻保存
注意：在操作 -80 °C 和 -196 °C 的低温环境时，应使用低温手套进行防护，并使用镊子转移冷冻小瓶。在操作液氮时，须佩戴低温手套和面罩以确保个人安全。
<ol>
	<li>吸去培养基，并用每孔 2 mL 温热的 PBS 洗涤一次。</li>
	<li>每孔加入 0.5 mL 软胰蛋白酶溶液进行消化（软胰蛋白酶溶液的组成见补充表 1）。在 37 °C 下孵育 5 至最多 10 分钟。轻轻摇晃培养板中的胰蛋白酶溶液，并通过轻敲培养板使细胞脱落。</li>
	<li>将脱落的细胞转移至含有 1.1 mg/mL 大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI；用于抑制胰蛋白酶活性，溶于含青霉素/链霉素的 KSFM 中）的 50 mL 离心管中。SBTI 的体积必须是软胰蛋白酶总体积的两倍（即每孔 1 mL）。 
	注意：请勿将 SBTI 直接加入孔中，因为细胞会在数分钟内重新贴壁。</li>
	<li>在室温下以 230 × g 离心 7 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 10 mL 室温 KSFM 中（含青霉素/链霉素，不含其他添加剂）。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。通过加入台盼蓝以 1:1 比例染色进行活/死细胞计数，或采用其他活/死细胞计数方法。</li>
	<li>将细胞以每毫升冻存液 400,000 个细胞的浓度进行冻存（冻存液组成见补充表 1），每支冻存管中加入 1 mL 此细胞悬液。将冻存管放入冷冻盒（coolcell 容器）中，并置于 -80 °C。24 小时后，将冻存管转移至 -196 °C 液氮中长期保存。 
	注意：将细胞转移至冻存液中有两种可行方法，均效果良好：1）再次通过离心收集细胞沉淀，然后以所需细胞浓度重悬于冷冻存液中；或 2）直接加入冷冻存液，并根据细胞所处 KSFM 的体积调整冷冻保护剂（二甲基亚砜 [DMSO]）的浓度。</li>
</ol>
3. 冻存的原代支气管上皮细胞解冻及在插入式培养器中培养
<ol>
	<li>用 10 mL PBS 配制的包被液在 37 °C 细胞培养箱中密闭孵育 T75 细胞培养瓶过夜。培养条件为 37 °C、5% CO2。</li>
	<li>在解冻冻存的 PBECs 之前，移除培养瓶中的包被液，并加入 10 mL c-KSFM 培养基。将培养瓶置于细胞培养箱中，盖子微开以允许培养箱内气体交换，使培养基预热至 37 °C。</li>
	<li>将细胞在 37 °C 水浴或金属珠浴中快速解冻。 
	注意：推荐使用金属珠浴而非水浴，因其污染风险更低且能耗更少。</li>
	<li>将冻存管中的全部内容物加入预热的含培养基 T75 培养瓶（步骤 3.2），并轻柔混匀使细胞均匀分布。 
	注意：此阶段切勿离心细胞，因细胞无法耐受离心过程。</li>
	<li>约 4 小时后，确认细胞已充分贴壁，更换为 10 mL 新鲜温热的 c-KSFM 培养基。 
	注意：此操作可去除冻存过程中使用的 DMSO。该换液步骤应在细胞接种后 4 至 24 小时内完成。</li>
	<li>继续培养细胞至 80%–90% 汇合度，每周一、三、五更换一次培养基。</li>
</ol>
4. 建立原代支气管上皮细胞的气液界面培养模型（ALI-PBEC）
注意：以下步骤适用于在内径为 11.9 mm 的插入式培养小室上培养原代支气管上皮细胞（PBECs）。
<ol>
	<li>用适量的包被液对适当数量的细胞培养小室进行包被，每个小室加入0.4 mL包被液。置于4℃孵育过夜 37 °C 在细胞培养孵箱中。</li>
	<li>按照所述方法制备完全BD培养基（cBD培养基） 补充表1. 
	注意：cBD 培养基是一种复合培养基（参见 补充表1) 配制用于支持支气管上皮细胞长期生长，并在提高视黄酸（RA）浓度（或本方案中所用的RA类似物）及按步骤4.10所述在气液界面（ALI）培养后，允许其发生分化。</li>
	<li>用每瓶2 mL的温和胰蛋白酶对T75培养瓶中的原代支气管上皮细胞（PBECs）进行消化。将细胞孵育5至10分钟，以使细胞脱落（根据显微镜下观察判断）。孵育5分钟后，通过轻轻旋转培养瓶中的胰蛋白酶并轻敲培养瓶壁以促进细胞脱落（如有需要可重复操作）。</li>
	<li>向烧瓶中加入 4 mL SBTI，并将细胞悬液直接转移至 25 mL 离心管中。 
	注意：细胞在数分钟内会重新贴壁。因此，当处理多个培养瓶时，在向第二个培养瓶中加入SBTI之前，必须先将步骤4.4中获得的细胞悬液直接转移至离心管中。本操作中，同时处理的培养瓶数量最多不超过五个。</li>
	<li>将离心管在 230 x 条件下离心 7 分钟 g 在室温下</li>
	<li>将细胞重悬于6 mL cBD培养基中，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。通过加入台盼蓝以1:1比例染色，或采用其他活/死细胞计数方法，进行活细胞与死细胞的区分计数。</li>
	<li>从细胞培养小室中移除包被液。</li>
	<li>将第4.6步获得的细胞悬液用添加了1 nM EC 23的cBD培养基稀释至80,000个细胞/mL，取0.5 mL加入插入式培养小室的膜上层。在插入小室下方的孔中加入1.5 mL添加了1 nM EC 23的cBD培养基。</li>
	<li>每周更换三次培养基，使用添加了1 nM EC 23的cBD培养基，直至细胞培养物准备好进行空气暴露（即达到100%融合度后2天）。每次更换时，在插入物内（细胞上方）加入0.5 mL培养基，在底部 compartment（孔内）加入1.5 mL培养基。 
	注意：通常情况下，将原代支气管上皮细胞（PBECs）接种于插件上后约5天，细胞层可达到100%汇合度。根据对细胞汇合度的肉眼观察，决定在2天后将细胞转入气液界面（ALI）阶段。</li>
	<li>当细胞准备转移至气液界面（ALI）培养时（即达到100%融合度后2天），移除插入式培养小室内外的培养基，不要向插入式培养小室内添加新的培养基，仅向孔板外侧添加新培养基（1 mL含50 nM EC 23的cBD培养基）。每周更换三次孔板中的培养基。</li>
	<li>为了去除多余的黏液和细胞碎片，轻轻加入 200 µL 在插入物内细胞层的顶侧加入温热的PBS（首选 通过 插入物的侧边加入，而非直接滴加到细胞上），并在细胞培养箱中孵育10分钟 37 °C然后，吸除 PBS 以去除多余的黏液和细胞碎片。 
	注意：从此时起（开始ALI培养后），每次更换下室培养基前，均须用PBS清洗细胞的顶端表面。</li>
	<li>在气液界面培养细胞至少2周，以确保所有主要细胞类型均存在。</li>
</ol>
5. 建立来自混合供体群体的气液界面原代支气管上皮细胞培养体系
<ol>
	<li>使用最多来自五位不同供体的细胞，以建立混合人群的原代支气管上皮细胞（PBEC）培养体系。</li>
	<li>将步骤4.7中获得的细胞按每位供体相同数量混合，使每个插入式培养小室中的细胞总数达到150,000个（例如，若使用五位供体，则每位供体提供30,000个细胞）。此操作可确保插入小室中的细胞增殖程度最小化，并保证培养体系中含有来自各供体的等量细胞。</li>
	<li>继续按照步骤4.9–4.12所述方法进行气液界面原代支气管上皮细胞（ALI-PBEC）培养。</li>
</ol>
6. ALI-PBEC 培养的质量控制
<ol>
	<li>在细胞培养过程中监测跨上皮细胞电阻（TEER） 
	注意：使用伏欧表进行的电阻测量可在气液界面培养原代支气管上皮细胞（ALI-PBEC）的任何时间点进行，且每次均需在相同条件下按照相同方案操作，因为电阻测量结果受多种变量影响，包括电极位置、温度、培养基和操作方式。跨上皮电阻（TEER）可通过应用以下基于欧姆定律的公式，由测得的电阻值计算得出： <img alt="TEER 计算：跨内皮电阻公式，科学方程式。" src="/files/ftp_upload/65102/65102eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">，其中 Rm 是测得的电阻值，Rb 是未包被且无细胞的插入式培养小室的基线电阻力，SA 是插入式培养小室膜的表面积17.
	<ol>
		<li>轻柔地加入 200 µL 向细胞层的顶端加入温热的PBS，以去除细胞上的黏液和碎片。将小室置于细胞培养孵箱中孵育10分钟，温度为 37 °C 再次移除 PBS。</li>
		<li>轻柔地加入 700 µL 向细胞层的顶侧加入温热的PBS，将小室在室温下孵育10分钟，以使温度稳定，便于后续测量。</li>
		<li>使用1,000 Ω测试电阻对伏欧表进行校准，将伏欧表设置为欧姆测量模式，并使用螺丝刀调节“R ADJ”校准螺丝，直至读数为1,000 Ω。</li>
		<li>用无菌水（室温）上下移动电极数次进行冲洗，随后在无菌 PBS（室温）中重复相同操作。</li>
		<li>测量插入物中细胞层的电阻。为此，将电极垂直置于孔中，使电极的长臂接触板底，短臂位于插入物内细胞层上方。读取伏欧表上显示的数值。 
		注意：显示的数值不会完全稳定；应在数值闪烁时立即读取。</li>
		<li>每次测量之间，将电极在无菌 PBS（室温）中上下移动数次以清洁。</li>
		<li>测量结束后，将电极在无菌水（室温）、无菌 PBS（室温）和 70% 乙醇（室温）中上下移动数次以清洁。将电极干燥保存。</li>
		<li>对插入物（无涂层）和细胞进行基线测量，通过添加 700 µL 在插入物内加入温热的PBS，并在孔中加入1 mL温热的PBS，同时测量与其他插入物相同的电阻力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估ALI-PBEC培养物的细胞组成
	<ol>
		<li>在 ALI 阶段，通过肉眼观察纤毛搏动来检测分化情况。可观察到 通过 在细胞顶侧暴露于空气后的第9天，即可通过标准明场显微镜观察到。 
		注意：纤毛的搏动在清洗细胞层顶端表面后可最清晰地观察到。杯状细胞会分泌黏液，因此在清洗顶端表面时若观察到黏液的存在，表明已有杯状细胞形成。然而，杯状细胞的数量及黏液的分泌量具有高度供体依赖性。在清洗插入物中细胞层的顶端表面后吸取PBS时，若存在黏液，则可观察到吸出的PBS黏稠度增加，并可能在吸液过程中看到黏液丝状物。</li>
		<li>利用免疫染色结合荧光显微镜或荧光激活细胞分选（FACS），或通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）进行基因表达分析，以评估细胞组成，可提供有关培养物分化状态的重要信息，但其具体描述超出本文范围。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="肺组织培养工作流程图；细胞分离、离心、孵育、分化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：原代支气管上皮细胞分离、扩增与培养流程的示意图。（A）在癌症切除手术期间获取肺组织，病理学家切除宏观上正常且无肿瘤的支气管环组织。（B）支气管环经清洗后进行酶消化处理，以解离并分离细胞层。（C）收集所得的细胞悬液并进行洗涤，随后将细胞接种至6孔板中进行扩增。（D）在c-KSFM培养基中加入Primocin对分离的细胞进行充分扩增后，通过胰酶消化解离细胞层，并将细胞重悬于冻存液中进行冷冻保存；需要时，将冻存细胞解冻后再次使用含青霉素/链霉素的c-KSFM培养基在细胞培养瓶中进行扩增。扩增完成后，将细胞接种于细胞培养小室中的cBD培养基中；（Ea）ALI-PBEC培养分为两个主要阶段：首先在补充了1 nM EC 23的cBD培养基中进行浸没培养，直至细胞达到完全汇合，随后移除顶端培养基，转入气液界面（ALI）培养以诱导细胞分化；在ALI阶段，细胞在补充了50 nM EC 23的cBD培养基中培养。（Eb）浸没培养期间覆盖培养小室的基底细胞示意图。（Ec）在较高浓度EC 23存在下进行ALI培养后所获得的已分化上皮细胞层示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

作者声明不存在相关的利益冲突。

本文所述方案介绍了从切除的肺组织中分离人支气管上皮细胞的方法、在不丧失分化潜能的前提下实现细胞最佳扩增的技术、细胞冻存步骤，以及生成高度分化的气液界面原代支气管上皮细胞（ALI-PBEC）培养物的流程。此外，还提供了质量控制的说明，以及对已分化ALI-PBECs进行监测与评估的操作指南。
本方案始于接受肺癌相关手术患者的肺叶中切除的宏观上正常、无肿瘤的支气管环。因此需注意，这些支气管环严格意义上不能被视为健康组织，这可能会影响细胞培养的特性。获取支气管上皮细胞的其他来源包括支气管活检、支气管刷取样本，或来自肺移植供体或受体的肺组织。无论来源如何，在使用肺组织时均应考虑微生物污染的风险，因此在不同培养基中使用抗生素以降低细胞培养中微生物污染的可能性。尤其需要注意的是，支原体是细胞培养中常见且高风险的污染物，因其对细胞培养具有多种影响、对细胞培养中常用的抗生素具有耐药性，且支原体污染只能通过支原体检测实验加以确认。因此，在从肺组织分离细胞后的细胞培养初期，使用广谱抗微生物制剂Primocin，并在培养过程中随机选取样本检测支原体的存在。
从支气管环开始的分离程序可提供足够的起始材料，使这些原代细胞在不损害其分化能力的前提下扩增至适合在气液界面（ALI）建立培养所需的数量。然而，若从数量有限的分离上皮细胞开始扩增，可能难以获得足够数量且细胞密度达标的Transwell插入膜用于ALI培养。原代细胞的长期培养和反复传代可能导致复制性衰老。为克服这一限制，已有多种方案被提出。Horani等研究表明，Rho激酶抑制剂（ROCK抑制剂）Y-27632可促进基底细胞的增殖30；Mou等采用双Smad抑制法在扩增基底干细胞的同时维持了分化上皮细胞层的特性31；Sachs等则开发了一种气道类器官系统，可在多次传代过程中扩增气道上皮细胞并保持其分化潜能32。后一种方法还被用于扩增细胞数量极少来源的细胞，例如早产儿（胎龄<28周）的气管吸出物（TAs）和支气管肺泡灌洗液（BAL），再将其转移至本文所述的ALI培养系统33。研究发现，从BAL和TAs分离的细胞表现出与支气管组织来源细胞相似的分化能力，但在使用Notch信号通路抑制或Th2型细胞因子IL-13诱导偏向性分化为更多纤毛细胞或更多杯状细胞的培养体系时，仍可观察到差异33。因此，建议当使用类似方法从上皮细胞数量较少的起始材料培养ALI-PBECs时，应始终依据本方案第6节中讨论的基本质量标准对培养物进行评估。值得注意的是，使用饲养层细胞也有助于获得更多数量的细胞，这在可移植支架工程等对时间和细胞数量要求较高的场景中至关重要。这一点已在一项研究中得到证实：研究人员从一位患有气管疾病的患者活检组织中获取自体上皮细胞，并在小鼠胚胎饲养层（经有丝分裂失活的3T3-J2成纤维细胞）和上述Rho/ROCK通路抑制剂（Y-27632）存在的条件下快速扩增细胞34。所得细胞培养物被证实可用于气管支架的再细胞化，因此该方案可被视为适用于移植模型的合适流程。
采用本研究中所述方案或其他培养方案时，不可避免地会引入选择偏倚。必须认识到，方案细节的差异（例如用于启动培养的细胞来源、培养基成分及其他方案参数）可能导致培养物中细胞组成的改变，从而影响气液界面（ALI）培养体系的反应33,35。此外，在比较用于气道细胞分化的不同培养基时，也观察到细胞特性存在差异10,11。在比较PneumaCult与cBD培养基时，发现杯状细胞和克拉拉细胞的mRNA标志物、跨上皮电阻（TEER）值以及细胞层厚度均存在差异。基于这些观察结果，尽管由于供体数量较少而缺乏统计学支持，且PneumaCult培养基的组分对客户不透明、成本更高，本实验室仍决定采用cBD培养基。
如前所述，可先通过类器官培养对细胞进行初步扩增，随后将其转移至二维气液界面（ALI）培养系统中。这一过程至关重要，因为气道上皮类器官不适合暴露于气传物质中，而使用二维ALI系统则可评估气传物质（如香烟烟雾23,36）对培养的气道上皮细胞的影响。建立气道上皮细胞ALI培养的另一种方法是通过人多能干细胞（hiPSCs）分化产生气道上皮细胞37。在此类分化方案中，当细胞经诱导分化为近端气道前体细胞后，在最终阶段可通过与本文所述相似的培养方法，进一步在ALI条件下进行分化。
在本实验方案中，使用cBD培养基在气液界面（ALI）条件下进行培养。cBD培养基是一种无血清培养基，其配制方法参考了Fulcher等38及其他研究，通过添加多种补充成分的混合物制备而成。补充液包含52 µg/mL牛垂体提取物（BPE）、0.5 µg/mL氢化可的松、0.5 ng/mL人表皮生长因子（EGF）、0.5 µg/mL肾上腺素、10 µg/mL转铁蛋白、5 µg/mL胰岛素、6.5 ng/mL三碘甲腺原氨酸以及0.1 ng/mL视黄酸（RA）39。由于BPE为组织提取物，存在批次间差异，因此该培养基不能被视为完全成分明确的培养基，也不属于无动物源成分的培养基。为了最大限度减少批次间的差异，优选完全成分明确的细胞培养基。鉴于向无动物源研究转型的趋势，有必要努力开发不含动物源成分、成分明确且价格合理、适合科学界广泛使用的培养基。
根据研究问题的不同，可基于气液界面模型采用多种实验设计。例如，若需研究可能影响分化过程的化合物的作用，可在 submerged 培养的不同阶段、分化过程中或完全分化后，将化合物添加至培养体系中。ALI-PBEC 培养模型的细胞组成可通过添加特定化合物进行调控；例如，在 IL-13 存在下进行 ALI-PBEC 分化，可获得杯状细胞增多而纤毛细胞减少的培养体系，而在分化过程中使用 γ-分泌酶抑制剂 DAPT（用于阻断 Notch 信号通路）处理，则会导致纤毛细胞增多而杯状细胞减少23,40,41,42。
此外，用于刺激细胞或阻断特定过程的试剂可添加至培养物的基底室，或（以极小体积）添加至顶室。细胞也可从顶侧暴露于气传物质。此类暴露设计已被用于研究柴油机尾气或全支香烟烟雾对原代支气管上皮细胞（PBECs）的影响23,43,44。每次更换培养基时，可收集基底侧的培养基以监测分泌蛋白；在更新基底培养基的同时，用PBS清洗细胞的顶侧，顶侧清洗液也可被收集。这种所谓的顶侧清洗液可被收集，并可选择性地加入二硫赤藓醇（DTE），以更有效地解离杯状细胞产生的黏液。还可获取细胞裂解物，用于提取总蛋白、RNA以及染色体和线粒体DNA。通过将聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜从塑料插入物上切下，并进一步切割成小片，可对细胞进行特异性标志物的抗体检测及多重免疫荧光染色45。此外，也可在插入物中的细胞经胰蛋白酶消化后，使用流式细胞术或荧光激活细胞分选（FACS）进行分析。在气液界面（ALI）培养阶段，可通过测量电阻力并据此计算跨上皮电阻（TEER）来监测细胞屏障的形成，其中电阻力与插入膜的表面积成反比。该计算基于欧姆定律，使用以下公式：<img alt="TEER 计算：跨内皮电阻力公式，科学方程式。" src="/files/ftp_upload/65102/65102eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 1">，其中Rm为测得的电阻力，Rb为未包被且无细胞的插入物的基线电阻力，SA为插入物膜的表面积。使用EVOM2和STX/“筷子”电极测量电阻力操作简便，但测量过程对电极插入孔板时的操作步骤高度依赖。此外，电极的形状也被认为会影响相对较大表面积屏障功能的测量结果17。
为进一步改进气液界面（ALI）细胞培养系统以提高组织表征的准确性，可采用多种细胞类型的共培养，例如白细胞、成纤维细胞或内皮细胞46,47,48。已有研究发现，将ALI培养的原代支气管上皮细胞（ALI-PBEC）与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）或M-CSF诱导分化的巨噬细胞共培养，可显著影响上皮细胞的固有免疫应答及组织修复过程48。值得注意的是，在此类共培养模型中，培养基的兼容性可能成为问题。由于气道上皮细胞培养所用的培养基是专为原代支气管上皮细胞（PBECs）设计的，可能并不完全适用于其他细胞类型，因此需要进行优化。在气道生物学领域，另一种可利用分离PBECs实现的技术进步是器官芯片（Organs-on-Chips, OoC）技术的应用49,50。利用该技术，可研究呼吸和血流等生理过程中机械力（如牵张、气流和培养基流动）的影响29。
使用不同供体的原代支气管上皮细胞（PBECs）时，供体间的变异性可能显著，因此在上皮细胞培养研究中应考虑使用多个供体的细胞，以涵盖这种变异性。由于气液界面培养原代支气管上皮细胞（ALI-PBECs）耗时较长且成本较高，本文探讨了一种将不同供体来源的细胞混合后共同接种于同一培养小室中建立ALI-PBEC培养体系的方法。该方法可便于在分析来自各个单独供体的培养物反应之前，先利用原代细胞快速开展预实验。此外，可根据不同特征（如不同年龄组或性别）的供体进行分组，用于探索性研究。使用混合供体细胞时，必须确保不同供体的细胞数量相等，以避免因某一供体细胞增殖能力较强而导致其结果占主导地位。因此，各供体的细胞需先单独扩增，并在接种至培养小室时采用较单独供体培养更高的细胞密度，以尽量减少在转入气液界面培养前细胞在小室内的增殖。通过研究SARS-CoV-2的感染动力学，比较了混合供体培养物与其对应各单独供体的反应。采用RT-qPCR和免疫荧光染色检测发现，混合供体培养物在病毒颗粒产量和感染细胞数量方面均能良好地反映各个单独供体的结果28。
为了成为动物模型的可接受替代方案，对培养的支气管上皮细胞进行基因编辑应具备可行性51。已有研究在气液界面培养的原代支气管上皮细胞（ALI-PBECs）中应用小干扰RNA（siRNA）介导的RNA干扰技术，但由于细胞必须在培养的浸没阶段进行siRNA转染，且由于培养周期较长，除非在培养过程中反复进行siRNA转染，否则基因敲低效果在ALI培养期间无法充分维持52。然而，siRNA可成功用于在浸没培养的基底细胞中调控基因表达。其他研究者已成功利用CRISPR/Cas9技术，通过核糖核蛋白（RNP）递送方式，在原代气液界面气道上皮细胞培养物中实现基因编辑53。使用此类技术时，关键在于细胞必须保持完整的分化能力。由于原代气道细胞培养物无法无限传代，基因编辑细胞的克隆扩增较为困难，且添加筛选试剂以富集转染细胞的操作也较为繁琐。因此，难以在所有培养细胞中实现理想的基因敲低效果。生成基因敲除克隆的另一种替代策略是利用hiPSCs中的基因敲除技术54，并由此衍生出气道上皮细胞。另一种虽非最优但可行的替代方法是建立永生化的PBEC细胞系，以实现基因编辑细胞的克隆扩增55。
本文所述方案是构建高度分化、假复层气液界面原代支气管上皮细胞（ALI-PBEC）培养模型的一种方法，但已有其他方案也可成功建立此类培养体系，这些方案与本文所述方案相比存在较小或较大的差异。我们认为，为了使ALI-PBEC体系及类似的呼吸道上皮细胞培养体系能够成为动物实验的有效替代方法，跨实验室对培养方法进行验证以及实施严格的质控措施至关重要。

气道上皮在多种急性和慢性肺部疾病中的作用已在各种综述中有所描述1,2,3,4,5,6,7气道上皮细胞的良好分化培养物是揭示气道上皮功能的重要工具。气液界面（ALI）气道上皮细胞培养技术被广泛应用，以促进气道基底上皮细胞的分化，从而可靠地研究气道上皮。 体外8,9近年来，由于与 COVID-19 大流行相关的新研究计划以及全球向无动物实验研究的转型，此类模型的使用进一步增加。因此，该模型细胞系的广泛应用凸显了共享实验流程与实践经验以获得可靠结果的重要性。这也将有助于不同研究团队之间的结果比较。实验流程的稳健性是关键特征，因此必须对其进行质量控制。多家实验室已投入资源开发在气液界面（ALI）培养原代气道上皮细胞的实验方案。若能详细共享这些方案，便可减少所需的时间、人力和经费投入。这些细节包括不同厂商提供的细胞培养塑料器皿和培养基的选择，因为这些因素已被发现会影响所获得培养物的特性。10,11,12这强调了分享经验及培养步骤细节的重要性，因为在缺乏此类信息的情况下，实验结果可能受到影响，且不同实验室间的验证工作可能受阻。
人类肺上皮由多种细胞类型组成，包括基底细胞、纤毛细胞、杯状细胞和克拉拉细胞等主要类型。为了可靠地模拟气道中的上皮细胞层 体外这些细胞类型需要在培养模型中得到体现，并维持其极化状态和功能13,14,15,16认识到供体特征（包括疾病状态）以及细胞解剖来源（即鼻部、气管、大支气管和小气道）可能影响细胞培养物的细胞组成和功能反应，这一点同样重要。成功培养原代气道上皮细胞并评估其培养质量，既需要直观判断（通过培养过程中的目视检查），也需要定量分析，而相关专业知识和实践经验是实现这一目标的前提条件。本研究旨在提供一种经济、高效的方法，用于分离和培养原代人支气管上皮细胞（PBECs），该方法亦可适用于气管和小气道上皮细胞的培养。本文不仅描述了从切除的肺组织中分离此类细胞的方法，还介绍了细胞扩增与生物样本库保存的技术，并进一步阐述和讨论了在合理的时间和成本范围内建立并鉴定高度分化的气液界面（ALI）培养模型的方法。

<table><tbody><tr><td>1,000 欧姆测试电阻器</td><td>World Precision Instruments</td><td>N/A</td><td>用于校准 EVOM2 上皮细胞伏特计</td></tr><tr><td>4-[2-(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)乙炔基]苯甲酸（EC 23）</td><td>Tocris</td><td>4011</td><td>用于 cBD 培养基</td></tr><tr><td>6 孔透明 TC 处理多孔板</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>用于第一步培养自支气管环分离的细胞&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>气道上皮细胞生长培养基试剂盒</td><td>PromoCell</td><td>C-21160</td><td>用于与 cBD 培养基进行比较</td></tr><tr><td>20 升珠浴</td><td>Lab Armor</td><td>74220-720</td><td>用于预热细胞培养溶液</td></tr><tr><td>BEGM 支气管上皮细胞生长培养基 BulletKit</td><td>LONZA</td><td>CC-3170</td><td>用于与 cBD 培养基进行比较</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白第五组分（BSA）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260037</td><td>用于包被溶液</td></tr><tr><td>牛垂体提取物（BPE）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>用于 c-KSFM</td></tr><tr><td>支气管上皮细胞生长补充剂（BEpiCGS）</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>3262</td><td>用于 cBD 培养基</td></tr><tr><td>支气管上皮细胞基础培养基（BEpiCM-b）</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC3211-b</td><td>用于 cBD 培养基</td></tr><tr><td>细胞培养小室；12 mm Transwell，带 0.4 &amp;micro;m 孔径聚酯膜插入物</td><td>Corning</td><td>3460</td><td>本方案中使用的细胞培养小室</td></tr><tr><td>细胞培养小室；12 孔小室，0.4 &amp;micro;m PET 透明膜</td><td>CellQART made by SABEU</td><td>9310412</td><td>用于与 Corning 细胞培养小室进行比较</td></tr><tr><td>细胞培养小室；12 孔 ThinCert 组织培养插入物</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-032</td><td>用于与 Corning 细胞培养小室进行比较</td></tr><tr><td>CELLSTAR 培养瓶，TC，PS，250 ml，75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td><td>用于扩增细胞数量</td></tr><tr><td>CFX Maestro 1.0</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td>用于分析 CFX384 系统生成的 qPCR 数据的软件程序</td></tr><tr><td>CFX384 Touch 实时 PCR 检测系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1855484</td><td>qPCR 检测系统</td></tr><tr><td>筷子式电极组</td><td>World Precision Instruments</td><td>STX2</td><td>用于测量 ALI-PBEC 的电阻力</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-培养箱</td><td>PHCbi</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td>用于无支原体污染的细胞培养的细胞培养箱</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-培养箱</td><td>Hereaus</td><td>Heracell 150</td><td>用于可能存在支原体感染的细胞培养的细胞培养箱</td></tr><tr><td>Coolcell 冷冻容器</td><td>Corning</td><td>432006</td><td>用于在转移至液氮前于 -80 &amp;deg;C 冷冻保存细胞</td></tr><tr><td>Countess 3 自动细胞计数仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td>用于计数细胞并确定细胞浓度</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Nalgene</td><td>479-3224</td><td>用于细胞冷冻保存</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Avantor VWR BDH CHEMICALS</td><td>101174Y</td><td>用于软胰酶溶液</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Avantor VWR</td><td>0231</td><td>用于细胞冻存培养基</td></tr><tr><td>dNTP（10 mM）</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>用于 cDNA 合成</td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）+ 4500 mg/l D-葡萄糖</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36250</td><td>用于 cBD 培养基</td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）4.5 g/l 葡萄糖，含 L-谷氨酰胺</td><td>LONZA</td><td>LOBE12-604F</td><td>用于 cBD 培养基，与来自其他厂家的 DMEM 进行比较&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），高糖，含丙酮酸</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966029</td><td>用于 cBD 培养基，与来自其他厂家的 DMEM 进行比较&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>表皮生长因子（EGF）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>用于 c-KSFM</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Avantor VWR BDH CHEMICALS</td><td>443885J</td><td>用于软胰酶溶液</td></tr><tr><td>EVOM2 上皮细胞伏特计</td><td>World Precision Instruments</td><td>91799</td><td>与筷子式电极组配合使用，用于测量 ALI-PBEC 的电阻力</td></tr><tr><td>人纤连蛋白溶液&amp;nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-43060</td><td>用于包被溶液</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>用于 cBD 培养基</td></tr><tr><td>汉克斯平衡盐溶液（HBSS）</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC0313</td><td>用于溶解蛋白酶 XIV&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>IQ SYBR Green Super mix</td><td>Bio-Rad</td><td>170887</td><td>qPCR 试剂</td></tr><tr><td>异丙肾上腺素盐酸盐，(-)-</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6504</td><td>用于 c-KSFM</td></tr><tr><td>角质形成细胞-SFM（KSFM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>用于 c-KSFM</td></tr><tr><td>Maxwell RSC 仪器</td><td>Promega</td><td>AS4500</td><td>自动化 RNA 提取系统</td></tr><tr><td>Maxwell RSC simplyRNA 组织试剂盒</td><td>Promega</td><td>AS1340</td><td>用于使用 Maxwell RSC 仪器提取总 RNA</td></tr><tr><td>M-MLV 逆转录酶</td><td>Promega</td><td>M5301</td><td>用于 cDNA 合成</td></tr><tr><td>M-MLV 逆转录酶 5X 反应缓冲液</td><td>Promega</td><td>M531A</td><td>用于 cDNA 合成</td></tr><tr><td>MycoStrip</td><td>InvivoGen</td><td>rep-mys-10</td><td>用于检测细胞培养样品中支原体的存在</td></tr><tr><td>N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630056</td><td>用于 cBD 培养基</td></tr><tr><td>寡核苷酸(dT)&lt;sub&gt;15&lt;/sub&gt;</td><td>Qiagen</td><td>79237</td><td>用于 cDNA 合成</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液（Pen/Strep）</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC0513</td><td>作为抗生素用于 c-KSFM 和 cBD 培养基</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>LUMC 药房</td><td>N/A</td><td>用于本方案的不同步骤</td></tr><tr><td>Pneumacult-ALI 培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05002</td><td>用于在分化阶段培养细胞，以与 cBD 培养基进行比较</td></tr><tr><td>Pneumacult-Ex Plus 培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05040</td><td>用于在浸没阶段培养细胞，以与 cBD 培养基进行比较</td></tr><tr><td>引物，ATP5B，正向</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>核苷酸序列：TCACCCAGGCTGGTTCAGA</td></tr><tr><td>引物，ATP5B，反向</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>核苷酸序列：AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT</td></tr><tr><td>引物，FOXJ1，正向</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>核苷酸序列：GGAGGGGACGTAAATCCCTA</td></tr><tr><td>引物，FOXJ1，反向</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>核苷酸序列：TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC</td></tr><tr><td>引物，MUC5AC，正向</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>核苷酸序列：CCTTCGACGGACAGAGCTAC</td></tr><tr><td>引物，MUC5AC，反向</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>核苷酸序列：TCTCGGTGACAACACGAAAG</td></tr><tr><td>引物，MUC5B，正向</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>核苷酸序列：GGGCTTTGACAAGAGAGT</td></tr><tr><td>引物，MUC5B，反向</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>核苷酸序列：AGGATGGTCGTGTTGATGCG</td></tr><tr><td>引物，RPL13A，正向</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>核苷酸序列：AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG</td></tr><tr><td>引物，RPL13A，反向</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>核苷酸序列：CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC</td></tr><tr><td>引物，SCGB1A1，正向</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>核苷酸序列：ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC</td></tr><tr><td>引物，SCGB1A1，反向</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>核苷酸序列：ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA</td></tr><tr><td>引物，TP63，正向</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>核苷酸序列：CCACCTGGACGTATTCCACTG</td></tr><tr><td>引物，TP63，反向</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>核苷酸序列：TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>作为抗菌剂用于 c-KSFM 培养基，对抗细菌、支原体和真菌</td></tr><tr><td>蛋白酶 XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>用于支气管环的酶处理</td></tr><tr><td>RNAsin 重组核糖核酸酶抑制剂</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td>用于 cDNA 合成</td></tr><tr><td>大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9128</td><td>用于抑制软胰酶的作用</td></tr><tr><td>T100 热循环仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>用于 cDNA 合成</td></tr><tr><td>TissueSAFE plus</td><td>MILESTONE MEDICAL</td><td>N/A</td><td>生物样本的真空转移系统</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>用于计数活细胞和死细胞&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胰蛋白酶 1:250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>27250-018</td><td>用于软胰酶溶液</td></tr><tr><td>I 型胶原溶液（PureCol）</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005-B</td><td>用于包被溶液</td></tr><tr><td>通用容器，聚丙烯材质，带聚乙烯螺旋盖</td><td>Avantor VWR</td><td>216-2053</td><td>用于本方案中支气管环的蛋白酶 XIV 处理</td></tr></tbody></table>

从切除的肺组织中分离支气管上皮细胞用于生物样本库建设及建立高度分化的气液界面培养模型

Isolating Bronchial Epithelial Cells from Resected Lung Tissue for Biobanking and Establishing Well-Differentiated Air-Liquid Interface Cultures

气道上皮细胞层构成了肺组织与外界环境之间的第一道屏障，因此持续暴露于吸入物质中，包括病原微生物和空气污染物。气道上皮层在多种急性和慢性肺部疾病中发挥核心作用，目前已有多种针对该上皮层的治疗手段通过吸入方式给药。要理解上皮在疾病发生中的作用及其作为治疗靶点的潜力，需要建立可靠且具有代表性的模型。体外上皮细胞培养模型的应用日益广泛，其优势在于可在受控环境中进行实验，使细胞暴露于不同类型的刺激物、毒性物质或病原体。相较于永生化细胞系或肿瘤细胞系，使用原代细胞的优势在于这些细胞在培养中可分化形成具有极性的假复层上皮细胞层，更能真实地模拟体内上皮的结构与功能特征。
本文介绍了一种经过数十年优化的稳定方案，用于从肺组织中分离和培养气道上皮细胞。该方法能够成功分离、扩增、培养原代支气管上皮细胞（PBECs），并通过气液界面（ALI）培养实现其黏液纤毛分化，同时包含生物样本库保存方案。此外，还描述了利用细胞特异性标志基因对这些培养细胞进行表征的方法。这些ALI-PBEC培养模型可用于多种应用，包括暴露于全香烟烟雾或炎症介质，以及与病毒或细菌共培养/感染实验。
本文提供的实验方案以逐步说明的方式展示了操作流程，旨在为那些希望在其实验室中建立或改进此类培养系统的研究人员提供基础和/或参考。

采用淹没培养法进行扩增 
采用本方法，从一块6孔板可平均获得8个冻存管，每管含400,000个细胞，可用于液氮长期保存图2A）。为实现此目的，将分离的PBECs在6孔板中培养，培养时间至少7天，最多14天（图2B在存在Primocin的情况下培养，以排除微生物（尤其是支原体）污染。 图 2A，B 提供了不同供体来源的细胞分离过程中所获得的细胞数量及所需培养时间的参考信息。在使用胰蛋白酶消化收获细胞并置于液氮中保存之前, 细胞融合度必须超过80%。若在14天内未达到此标准，则不应进行细胞冻存。重要的是，在收获用于储存或传代时，细胞层的融合度不应超过约95%（图 2C）。在液氮中保存后，细胞可解冻并进行扩增培养，直至获得足够数量的细胞用于气液界面（ALI）培养。此阶段细胞扩增所用培养基为c-KSFM，与支气管环收获后初始培养阶段所用培养基相同。18然而，此阶段无需使用Primocin，因为肺组织来源的额外微生物污染风险不存在，因此可将Primocin替换为青霉素/链霉素。该培养基有利于上皮细胞而非成纤维细胞的生长，从而防止增殖较快的成纤维细胞过度生长而影响培养效果19,20,21使用c-KSFM培养基时，细胞在培养瓶中呈分散生长且彼此不连接，这与在cBD培养基中此阶段浸没培养的细胞形态有显著差异图 2D，E）。在T75培养瓶中培养复苏后的细胞5至6天后，细胞层应达到80%–95%汇合度，相当于约3 x 106 总共的细胞（图2F）。由此可制备约75个（12孔板规格）插入式培养插件用于气液界面（ALI）培养。
本研究中所述的分离与培养方法也可适用于以支气管活检组织或支气管刷取物作为起始材料。
<img alt="细胞计数与供体散点图（A，F）、细胞培养显微图像（C，D，E）、研究数据" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：冻存前后基底细胞的扩增情况。 细胞按照所述方案分离，并使用 c-KSFM 培养基进行培养。监测每位供体产生的细胞数量，在从6孔板收获第0代（P0）细胞时（方案步骤2），使用自动细胞计数仪进行活细胞计数（A），n = 123位供体；细胞计数以每孔收获的细胞数表示，每个点代表一位供体，中位数由水平线表示。（B）作为质量控制的一部分，监测P0细胞在6孔板中达到80%至90%汇合度所需的时间，并以在c-KSFM中开始贴壁培养后的天数表示（n = 127位不同供体）。每位供体由一个点表示，所有属于同一天的数据点合并为一条线；线越宽，代表的供体数量越多；细胞培养的中位天数由较细的水平线表示。（C）P0细胞在c-KSFM中贴壁培养至收获进行长期冻存时的代表性明场图像。（D）P1细胞在c-KSFM中贴壁培养至收获并转移至插入式培养小室时的代表性明场图像，以及（E）在cBD培养基中贴壁培养的P1细胞图像。（F）在从T75培养瓶收获P1细胞时（方案第4节），使用自动细胞计数仪监测每位供体产生的活细胞数量，n = 63位不同供体；细胞计数以每T75培养瓶的细胞数表示，每位供体由一个点表示，中位细胞数由水平线表示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
气液界面（ALI）培养 
在开始 ALI 培养后的第 7 天，测量细胞层的电阻值，应大于 300 Ω（图 3A）；若未达到该值，则认为培养失败，可能由于紧密连接未正常形成。建议排除因个别培养插件中上皮层受损而导致跨上皮电阻（TEER）值偏低的可能性，例如在洗涤和吸液过程中对细胞层造成的损伤。可通过显微镜目视检查培养插件来确认。根据我们的经验，不同供体之间的电阻值存在显著差异（图 3B），这一现象在文献中已有报道14，同时我们观察到该差异还明显受到所使用的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）来源的影响（图 3C）。
<img alt="TEER 测量曲线图；气液界面培养天数 vs. TEER；不同细胞培养条件的分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：跨上皮电阻作为 ALI-PBEC 培养物的质量控制指标。 分离并扩增原代支气管上皮细胞（PBECs），建立高度分化的气液界面培养模型（ALI-PBEC）。在培养过程中多个时间点测量电阻值，并据此计算跨上皮电阻（TEER，单位为 Ω·cm2）。(A) 在气液界面培养后的14天内连续测量电阻值。n = 4 名不同供体。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。(B) 作为 ALI-PBEC 培养质量控制的一部分，在气液界面培养第7天（n = 50）和第14天（n = 25）测量电阻值；每个点代表一名供体，中位数 TEER 值（Ω·cm2）由水平线表示。采用非参数 Mann-Whitney 检验对数据进行显著性分析，未发现显著差异。(C) 测试了三家不同供应商的 DMEM 培养基，以评估其对 TEER 形成的影响。n = 4 名不同供体；数据以均值 ± SD 表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在建立良好分化的气液界面原代支气管上皮细胞（ALI-PBEC）培养体系时，自开始气液暴露起，视黄酸（RA）的浓度会升高22。通过这一过程，细胞从增殖状态转变为黏液纤毛分化状态，在气液暴露后约9天（依供体而定）即可通过明场显微镜观察到该变化。此时可观察到纤毛的初步运动，若依据已分化管腔细胞标志物的基因表达水平判断，则分化发生时间略早于此23（图4）。
如实验方案所述，在换液过程中冲洗细胞顶面时也可观察到黏液的产生。视黄酸（RA）对光极为敏感，导致相同储备浓度下的活性差异较大。因此，使用合成的RA类似物EC 23替代RA，并以相同浓度使用，实验结果表明其效果相似。基于此并为了避免改变实验流程，所选用的EC 23浓度保持与先前使用的RA浓度一致（即50 nM）24,25（图5）。图5A展示了使用不同浓度EC 23时获得的跨上皮电阻（TEER）值，结果显示在所测试的浓度范围内，50 nM时TEER达到最大值。如图5B所示的结果证实，使用50 nM EC 23或RA时，纤毛细胞和杯状细胞标志物的基因表达水平相似。在浸没培养阶段也需要添加EC 23（尽管所需浓度低得多），因为在浸没阶段省略EC 23而仅在气液界面（ALI）阶段添加，会导致培养物无法达到完全汇合。生成具有明显纤毛摆动活性和黏液分泌的充分分化ALI-PBEC培养模型所需时间约为14天，因此大多数实验通常在培养14至21天的ALI模型上开始（图4）。在ALI培养14天后，可观察到所有主要的细胞类型（基底细胞、纤毛细胞、杯状细胞和簇细胞），但其表达水平高度依赖于供体。这一点可通过RT-qPCR检测TP63、FOXJ1、MUC5AC和SCGB1A1的基因表达，或通过免疫荧光（IF）染色检测针对p63、α-微管蛋白、Muc5AC和CC-16的抗体所标记的相应蛋白表达，分别鉴定基底细胞、纤毛细胞、杯状细胞和簇细胞的标志物来验证25,26。然而，尽管14至21天可作为大多数实验的经验参考，但对于某些特定实验，可能需要更长的分化时间，例如在异源物质代谢、SARS-CoV-2感染以及黏液纤毛清除功能评估中已有报道27,28,29。
<img alt="基底细胞、纤毛细胞、杯状细胞和簇状细胞的基因表达图谱；气液界面培养后的天数；比较分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：气液界面（ALI）培养。 分离并扩增原代支气管上皮细胞（PBECs），建立高度分化的ALI-PBEC培养体系。在气液界面形成后14天内对ALI-PBEC培养物进行监测。于气液界面形成后第0、7和14天裂解细胞，提取RNA。展示两个不同供体的数据，每个点代表一个随时间监测的独立供体，水平线表示中位值。通过qPCR检测基底细胞、纤毛细胞、杯状细胞和簇状细胞标志物（分别为TP63、FOXJ1、MUC5B和SCGB1A1）的基因表达，并以RPL13A和ATP5B的基因表达作为归一化参照（详见参考文献23）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="跨上皮电阻和细胞分化、TEER 测量、条形图、细胞研究结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：视黄酸（RA）与其合成类似物 EC 23 的比较。 分离并扩增原代支气管上皮细胞（PBECs），建立高度分化的气液界面培养 PBEC 模型（ALI-PBEC）。在 PBEC 培养物开始暴露于空气时，将 RA（50 nM）替换为不同浓度的 EC 23。（A） 在气液界面培养后第 14 天测定电阻值，并据此计算跨上皮电阻（TEER，单位为 Ω·cm2），n = 2 名供者，柱状图表示均值 ± 标准差（SD）。（B） 在气液界面培养后第 14 天，裂解细胞培养物以提取 RNA，随后通过 qPCR 检测纤毛细胞和杯状细胞标志基因（FOXJ1, MUC5AC）的表达水平，并以 RPL13A 作为归一化对照（n = 3 名供者）。数据以 50 nM RA 培养的 ALI-PBEC 为参照，显示相对表达倍数变化，柱状图表示均值 ± 标准差（SD）。（详见参考文献 23）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
近年来，已对培养系统中替代产品的性能进行了评估，例如培养基和培养用塑料器皿。进行此类评估的原因多种多样，包括制造商对培养基成分的调整、新型培养基的推出，以及在 COVID-19 大流行期间（2020–2022 年）出现的产品短缺。观察发现，尽管最终的细胞组成可能存在显著差异（图 6A），但来自不同供应商的相似产品所培养出的上皮细胞在上皮细胞类型标志物的评估中表现出差异；而跨上皮电阻（TEER）的差异则相对较小（图 6B）。另一方面，使用不同供应商的培养基会导致细胞组成出现显著差异；而使用不同品牌的插入式培养小室时，此类差异则较为有限（图 6C）。特别是使用 STEMCELL Technologies 公司的气道上皮细胞培养基 PneumaCult 时，可观察到不同的细胞形态以及更快速出现的纤毛运动。除上述现象外，与 cBD 培养基相比，使用 PneumaCult 培养基时 ALI-PBEC 模型的 TEER 值和细胞组成也存在差异（图 6D）。
<img alt="比较不同细胞类型中 TP63、FOXJ1、MUC5AC、SCGB1A1 的标准化表达的柱状图和折线图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 6"> 
图 6：比较不同供应商的上皮细胞培养基和细胞培养小室。 原代支气管上皮细胞（PBEC）被分离、扩增，并建立了良好分化的气液界面培养的 PBEC 模型。（A）ALI-PBEC 培养 14 天后，裂解细胞层以提取 RNA。通过 qPCR 检测基底细胞、纤毛细胞、杯状细胞和俱乐部细胞标志物（分别为 TP63、FOXJ1、MUC5AC 和 SCGB1A1）的基因表达，并以 RPL13A 和 ATP5B 作为内参进行标准化。n = 2 名供体；柱状图表示均值 ± 标准差（SD）。（B）在气液界面建立后的 9 天内，定期测量电阻力并计算跨上皮电阻（TEER，单位为 Ω·cm2）。n = 3 名不同供体；数据以均值 ± SD 表示。（C）使用来自三家不同供应商的细胞培养小室培养 ALI-PBEC 14 天后，裂解细胞层用于 RNA 提取。通过 qPCR 检测纤毛细胞、杯状细胞和俱乐部细胞标志物（分别为 FOXJ1、MUC5AC 和 SCGB1A1）的基因表达，并以 RPL13A 作为内参进行标准化。n = 18 名不同供体；柱状图表示均值 ± SD。采用单因素方差分析的非参数 Kruskal-Wallis 检验对数据进行显著性检验，未发现显著差异。（D）ALI-PBEC 在气液界面建立后，分别使用 cBD 培养基或 PneumaCult 培养基（STEMMCELL Technologies）培养 14 天，随后裂解细胞层用于 RNA 提取。通过 qPCR 检测基底细胞、纤毛细胞、杯状细胞和俱乐部细胞标志物（分别为 TP63、FOXJ1、MUC5B 和 SCGB1A1）的基因表达，并以 RPL13A 作为内参进行标准化（柱状图表示均值 ± SD）；同时在气液界面建立后的第 5 天和第 12 天测量电阻力，并用于计算 TEER（Ω·cm2）。n = 2；数据以均值 ± SD 表示（详见参考文献 23）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充表 1：本实验方案中所用溶液和培养基的组成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍一种可重复、经济且稳健的方法，用于分离和扩增原代支气管上皮细胞，以实现长期生物样本库保存，并通过气液界面培养生成分化成熟的上皮细胞。

气道上皮细胞层构成了肺组织与外界环境之间的第一道屏障，因此持续暴露于吸入的……

本方案介绍了一种可靠且经济高效的方法，可用于研究气道上皮细胞在健康与疾病状态下的功能及其作用。该技术的主要优势在于所形成的细胞层能够良好地模拟人体上皮细胞层，包括黏液分泌和纤毛运动。该技术具有良好的通用性，可用于研究与疾病相关的损伤或治疗方法。首先，在10厘米的培养皿中，用10毫升无菌PBS冲洗从人肺组织分离的支气管环。用镊子夹住支气管环的同时，使用小剪刀去除多余的结缔组织和血迹残留物。将支气管环切成两半，并将两半浸入含有Primocin的HBSS中10毫升预热的Protease 14溶液中，置于密闭的无菌容器内。将支气管环片段在37摄氏度下孵育两小时。孵育结束后，将片段转移至含有10毫升温热PBS的培养皿中，用弯头镊子刮取环内壁以获得细胞悬液。弃去支气管环。将细胞悬液转移至50毫升离心管中，加入预热的PBS，使终体积达到50毫升。离心细胞悬液，吸除上清液，再用10毫升预热的PBS重悬沉淀。用PBS补足体积至50毫升，重复离心步骤。将沉淀重悬于含Primocin的预热完全KSFM培养基中。随后，用每孔2毫升细胞悬液替换六孔板中的包被液。继续培养细胞至融合度达到80%至90%。如需冻存PBECs，吸除孔内培养基，并用每孔2毫升预热的PBS洗涤细胞一次。每孔加入500微升温和胰蛋白酶，37摄氏度孵育5至10分钟以消化细胞。轻轻摇晃胰蛋白酶溶液，并轻敲培养板使细胞脱落。将解离的细胞转移至含有大豆胰蛋白酶抑制剂的50毫升离心管中。离心该悬液，弃去上清液，然后将沉淀重悬于10毫升含有青霉素和链霉素的KSFM培养基中。使用自动细胞计数仪计数细胞后，将细胞重悬于冻存液中，调整细胞浓度至每毫升400,000个细胞，并将1毫升该悬液加入一支冻存管中。将冻存管转移至低温细胞冻存盒中，置于-80摄氏度环境中。24小时后，将小瓶转移至零下196摄氏度的液氮中进行长期保存。为包被T75细胞培养瓶，加入10毫升PBS中的包被溶液，并拧紧瓶盖，然后将培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。次日，用10毫升完全KSFM培养基替换培养瓶中的包被溶液。将培养基放入培养箱中，瓶盖稍打开以使培养箱内空气进入，待其升温至 37 摄氏度。在 37 摄氏度的珠浴中快速解冻冻存的 PBECs。将冻存管中的全部内容物加入预热的 T75 培养瓶中，并轻轻晃动使细胞均匀分布。在确保细胞牢固贴壁后，更换为10毫升新鲜且预热的完全KSFM培养基，继续培养至细胞融合度达到80%至90%。通过每孔加入400微升包被液对细胞培养小室进行包被，并在37摄氏度下孵育过夜。向培养瓶中的PBECs加入2毫升温和胰蛋白酶进行消化，在37摄氏度下孵育5至10分钟。通过轻轻晃动并轻敲培养瓶促进细胞脱落。接着，向培养瓶中加入 4 mL 大豆胰蛋白酶抑制剂，并将细胞悬液转移至 25 mL 离心管中。离心细胞悬液，然后将沉淀重悬于 6 mL 完全 BD 培养基中。使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。包被后，从插入式培养小室中移除包被液。用添加了1纳摩尔EC 23的完全BD培养基稀释细胞悬液，并将500微升加入插入式培养小室膜的上层。向插入物下方的孔中加入 1.5 毫升完全 BD 培养基。当细胞准备转移至气液界面（ALI）时，移除插入物及孔中的培养基，并仅向孔中加入含有 50 纳摩尔 EC 23 的新鲜完全 BD 培养基。每周更换三次孔中的培养基。为去除多余的黏液和细胞碎片，在插入物内细胞层的顶侧轻轻加入 200 微升预热的 PBS，并在 37 摄氏度孵育 10 分钟。孵育后，吸除含有过量黏液和细胞碎片的 PBS。通过测量经上皮电阻（TEER）来评估气液界面原代支气管上皮细胞（ALI PBEC）培养物的质量。培养7天后，细胞层的电阻高于300欧姆被视为培养成功。此外，在气液界面培养的第7天至第14天期间，不同供体之间的电阻差异随时间减小，并显著受到所用DMEM培养基来源的影响。在气液界面培养14天后，可观察到所有主要的细胞类型，如基底细胞、纤毛细胞、杯状细胞和克拉拉细胞，其表达水平具有供体依赖性。在测试的不同浓度EC 23中，50 纳摩尔时观察到最大的TEER值。视黄酸与其合成类似物EC 23的比较证实，在50 纳摩尔EC 23与视黄酸之间，纤毛细胞和杯状细胞标志物的基因表达相似。使用不同供应商的培养基导致细胞组成存在显著差异，而TEER的差异则较不明显。另一方面，使用不同供应商的插入物并未导致细胞降解出现显著差异。此外，还观察到ALI培养的原代支气管上皮细胞（PBEC）在TEER值以及细胞组成方面，PneumaCult培养基与完全BD培养基之间存在差异。当细胞准备转移至气液界面（ALI）培养时，应提高EC 23的浓度。此外，在解冻后不要离心细胞，并在加入SBTI后尽快将细胞从细胞培养塑料器皿中移除。按照本方案提供的气道上皮细胞培养方法，可进一步采用多种分析手段，例如检测气道上皮细胞的功能、基因表达、介质产生等，从而深入了解细胞暴露于香烟烟雾等刺激物后的生物学效应。该细胞培养方案的下一步是整合其他细胞类型，例如免疫细胞或血管细胞，这将有助于提升组织模型的代表性。

isolating-bronchial-epithelial-cells-from-resected-lung-tissue-for

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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本文介绍了一种从人支气管气道组织外植体中培养原代人支气管上皮细胞的详细方法，包括在气液界面条件下进行分化生长。该方法可提供充足的原代细胞来源，用于研究气道上皮在人类肺部健康与疾病中的作用。...

从组织外植体培养的人原代支气管上皮细胞

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离体猪肺生物膜模型：一种用于研究猪细支气管组织上细菌生物膜的肺部模型构建技术

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用于疾病建模的人源三维肺组织培养物（3D-LTCs）的构建

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一种用于毒性测试中真实、重复吸入空气颗粒物暴露的气液界面支气管上皮模型

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由人多能干细胞生成气道上皮细胞气液界面培养模型

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测定假复层肺气道上皮的纤毛功能与膜不通透性

本文介绍了一种在气液界面培养系统中构建包含诱导性多能干细胞（iPSC）来源的肺上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和巨噬细胞的复杂多细胞气道屏障模型的方法。...

利用iPSC衍生的上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和免疫细胞共培养模拟肺部健康与疾病状态下的气道屏障完整性

学习从切除的人肺组织中分离原代支气管上皮细胞，建立气液界面培养物用于生物样本库。该方法可生成具有纤毛活动和黏液分泌功能的细胞层，适用于研究呼吸道上皮细胞在健康和疾病中的功能及治疗反应。

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