从切除的肺组织中分离支气管上皮细胞用于生物样本库建设及建立高度分化的气液界面培养模型

本方案介绍了一种可靠且经济高效的方法，可用于研究气道上皮细胞在健康与疾病状态下的功能及其作用。该技术的主要优势在于所形成的细胞层能够良好地模拟人体上皮细胞层，包括黏液分泌和纤毛运动。该技术具有良好的通用性，可用于研究与疾病相关的损伤或治疗方法。

首先，在10厘米的培养皿中，用10毫升无菌PBS冲洗从人肺组织分离的支气管环。用镊子夹住支气管环的同时，使用小剪刀去除多余的结缔组织和血迹残留物。将支气管环切成两半，并将两半浸入含有Primocin的HBSS中10毫升预热的Protease 14溶液中，置于密闭的无菌容器内。

将支气管环片段在37摄氏度下孵育两小时。孵育结束后，将片段转移至含有10毫升温热PBS的培养皿中，用弯头镊子刮取环内壁以获得细胞悬液。弃去支气管环。

将细胞悬液转移至50毫升离心管中，加入预热的PBS，使终体积达到50毫升。离心细胞悬液，吸除上清液，再用10毫升预热的PBS重悬沉淀。用PBS补足体积至50毫升，重复离心步骤。

将沉淀重悬于含Primocin的预热完全KSFM培养基中。随后，用每孔2毫升细胞悬液替换六孔板中的包被液。继续培养细胞至融合度达到80%至90%。如需冻存PBECs，吸除孔内培养基，并用每孔2毫升预热的PBS洗涤细胞一次。

每孔加入500微升温和胰蛋白酶，37摄氏度孵育5至10分钟以消化细胞。轻轻摇晃胰蛋白酶溶液，并轻敲培养板使细胞脱落。将解离的细胞转移至含有大豆胰蛋白酶抑制剂的50毫升离心管中。

离心该悬液，弃去上清液，然后将沉淀重悬于10毫升含有青霉素和链霉素的KSFM培养基中。使用自动细胞计数仪计数细胞后，将细胞重悬于冻存液中，调整细胞浓度至每毫升400,000个细胞，并将1毫升该悬液加入一支冻存管中。将冻存管转移至低温细胞冻存盒中，置于-80摄氏度环境中。

24小时后，将小瓶转移至零下196摄氏度的液氮中进行长期保存。为包被T75细胞培养瓶，加入10毫升PBS中的包被溶液，并拧紧瓶盖，然后将培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。次日，用10毫升完全KSFM培养基替换培养瓶中的包被溶液。

将培养基放入培养箱中，瓶盖稍打开以使培养箱内空气进入，待其升温至 37 摄氏度。在 37 摄氏度的珠浴中快速解冻冻存的 PBECs。将冻存管中的全部内容物加入预热的 T75 培养瓶中，并轻轻晃动使细胞均匀分布。

在确保细胞牢固贴壁后，更换为10毫升新鲜且预热的完全KSFM培养基，继续培养至细胞融合度达到80%至90%。通过每孔加入400微升包被液对细胞培养小室进行包被，并在37摄氏度下孵育过夜。向培养瓶中的PBECs加入2毫升温和胰蛋白酶进行消化，在37摄氏度下孵育5至10分钟。

通过轻轻晃动并轻敲培养瓶促进细胞脱落。接着，向培养瓶中加入 4 mL 大豆胰蛋白酶抑制剂，并将细胞悬液转移至 25 mL 离心管中。离心细胞悬液，然后将沉淀重悬于 6 mL 完全 BD 培养基中。

使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。包被后，从插入式培养小室中移除包被液。用添加了1纳摩尔EC 23的完全BD培养基稀释细胞悬液，并将500微升加入插入式培养小室膜的上层。

向插入物下方的孔中加入 1.5 毫升完全 BD 培养基。当细胞准备转移至气液界面（ALI）时，移除插入物及孔中的培养基，并仅向孔中加入含有 50 纳摩尔 EC 23 的新鲜完全 BD 培养基。每周更换三次孔中的培养基。

为去除多余的黏液和细胞碎片，在插入物内细胞层的顶侧轻轻加入 200 微升预热的 PBS，并在 37 摄氏度孵育 10 分钟。孵育后，吸除含有过量黏液和细胞碎片的 PBS。通过测量经上皮电阻（TEER）来评估气液界面原代支气管上皮细胞（ALI PBEC）培养物的质量。

培养7天后，细胞层的电阻高于300欧姆被视为培养成功。此外，在气液界面培养的第7天至第14天期间，不同供体之间的电阻差异随时间减小，并显著受到所用DMEM培养基来源的影响。在气液界面培养14天后，可观察到所有主要的细胞类型，如基底细胞、纤毛细胞、杯状细胞和克拉拉细胞，其表达水平具有供体依赖性。

在测试的不同浓度EC 23中，50 纳摩尔时观察到最大的TEER值。视黄酸与其合成类似物EC 23的比较证实，在50 纳摩尔EC 23与视黄酸之间，纤毛细胞和杯状细胞标志物的基因表达相似。使用不同供应商的培养基导致细胞组成存在显著差异，而TEER的差异则较不明显。

另一方面，使用不同供应商的插入物并未导致细胞降解出现显著差异。此外，还观察到ALI培养的原代支气管上皮细胞（PBEC）在TEER值以及细胞组成方面，PneumaCult培养基与完全BD培养基之间存在差异。当细胞准备转移至气液界面（ALI）培养时，应提高EC 23的浓度。

此外，在解冻后不要离心细胞，并在加入SBTI后尽快将细胞从细胞培养塑料器皿中移除。按照本方案提供的气道上皮细胞培养方法，可进一步采用多种分析手段，例如检测气道上皮细胞的功能、基因表达、介质产生等，从而深入了解细胞暴露于香烟烟雾等刺激物后的生物学效应。该细胞培养方案的下一步是整合其他细胞类型，例如免疫细胞或血管细胞，这将有助于提升组织模型的代表性。