Name: 用脱细胞支架龙ESC衍生鼠气道上皮细胞的生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: 了解利用脱细胞肺支架三维培养系统，将小鼠胚胎干细胞定向分化为成熟气道上皮细胞的方法。该技术在无血清条件下实现高效肺谱系分化，适用于干细胞生物学与肺发育研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 Rossant 博士和 Bilodeau 博士提供了用于图 1-3所示实验的 Nkx2-1mcherry 胚胎干细胞。流式细胞分选（FACS）在 SickKids-UHN 流式细胞术中心完成。本研究得到了加拿大卫生研究院的运营资助以及加拿大创新基金会的基础设施资助（CSCCD）的支持。

动物实验按照病童医院研究所动物护理委员会的指导原则进行。
1. 支架制备
<ol>
	<li>肺的脱细胞化
	<ol>
		<li>使用 CO2 舱对成年Wistar大鼠实施安乐死。将动物放入舱内，以每分钟10-30%舱体积的充气速率开始100% CO2暴露。
		<ol>
			<li>观察动物是否失去意识，通常在约2-3分钟后发生。若在此期间未出现意识丧失，请检查充气速率和舱体密封性。在动物失去意识后，观察其眼球颜色是否变浅以及是否停止呼吸。若两者均出现，则继续维持CO2充入1-2分钟，随后将动物从舱中取出进行后续操作。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将动物四肢固定于解剖台面，用70%乙醇喷洒胸部和腹部区域，并沿胸骨作纵向切口打开胸腔以暴露心脏和肺脏。</li>
		<li>首先在膈肌上做小切口，使肺组织回缩，以降低刺破肺脏的风险。用缝线结扎下腔静脉，并用小型解剖剪在左心房处做一小切口。</li>
		<li>使用预先准备好的10 ml注射器（配备25 G针头，内含含肝素的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）（HBSS中含10 U/ml肝素）），通过将针头插入右心室开始肺灌注，推动缓冲液流经肺循环（流速为2 ml/min）。持续此操作，直至肺组织变为白色，且从左心房流出的液体变得澄清。</li>
		<li>灌注完成后，暴露气管，并在靠近甲状软骨处插入塑料导管，用缝线固定导管位置。</li>
		<li>通过将10 ml注射器固定在铁架台和夹具上建立重力灌注系统。移除并丢弃注射器活塞。将注射器筒上的最大填充刻度位置固定在肺组织上方20 cm处。在注射器末端连接一个双向止流阀，并在止流阀另一端连接一段长塑料管，用于将脱细胞溶液输送至已插管的气管。将溶液倒入注射器，使溶液充满连接的塑料管和导管。
		<ol>
			<li>通过将肺充至总肺容量（约12 ml）并维持1分钟进行肺灌洗，随后将塑料导管从气管中取出，使液体流出肺部。灌洗时注射器内液体不得超过10 ml，以确保压力低于20 cm H2O。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用脱细胞溶液对肺进行8次重复灌洗，随后用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗10次。</li>
		<li>将气管和肺从颈部及胸腔中分离并取出。将组织保存在4 °C的冷PBS中，直至准备进行振动切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>厚切片制备
	<ol>
		<li>准备约15 ml的2%和4%（w/v）琼脂糖，以及足量的6%（w/v）琼脂糖用于将所有肺叶包埋成小矩形块。将低熔点琼脂糖粉末溶于PBS中，通过微波加热溶解。将琼脂糖转移至50 ml离心管中，置于加热块上，并保持温度高于40 °C以防止凝固。</li>
		<li>用小剪刀在每个肺叶支气管末端处对脱细胞肺进行解剖，分离各肺叶（右肺的前叶、中叶、副叶和后叶，以及左肺叶）。用吸水纸轻轻吸干每个肺叶以去除多余PBS，并将其置于加热块上的2%（w/v）琼脂糖中。</li>
		<li>每个肺叶在琼脂糖中包被5分钟后取出，放入培养皿中，并在冷板上静置1分钟使其表面凝固。</li>
		<li>将肺叶轻柔地重新放入4%（w/v）琼脂糖中，冷却5分钟后，再用6%（w/v）琼脂糖进行一次包被。</li>
		<li>完成各肺叶的逐层包被后，使用金属底模将每个肺叶单独包埋于6%（w/v）琼脂糖中，确保组织边缘周围至少有3 mm厚的琼脂糖。用镊子调整肺叶方向，使其最大的平坦边缘朝向实验者并位于金属模具表面。该边缘将是后续振动切片时固定于样品板的一侧。</li>
		<li>将包埋块在冷板上静置至少30分钟使其完全凝固，再进行振动切片。切片前可将包埋块置于4 °C的湿润环境中保存最多12小时。</li>
		<li>通过向切片区注入冷PBS12来设置振动切片机。在整个切片过程中，利用周围的冰浴维持低温环境。将包埋块从金属模具中取出，用刀片修剪掉肺叶周围的多余琼脂糖，保留组织边缘约3 mm的琼脂糖。</li>
		<li>使用粘合剂将组织固定在样品板中央，并将样品板浸入盛有PBS的切片区。在振动切片机上设定切片边界，依次选择以下参数：速度0.2 mm/sec，振幅1.85 mm，厚度350 µm。 
		注：肺叶方向的纵向和横向切片均可接受。</li>
		<li>将每个肺叶完全切片。若在切片序列结束时某一片段未被刀片完全分离，可用小剪刀手动剪断。小心收集支架切片，并保存在冰上的PBS中，直至下一步操作。 
		注：所获得的切片将包含近端和远端肺区域，两者均可用于再细胞化；但大部分表面积将来自远端肺组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>支架切片的去污染处理
	<ol>
		<li>将350微米厚的支架切片从PBS转移至微量离心管中（每管最多30片），在室温下于旋转仪上用核酸酶（PBS中90 U/ml）处理12-24小时（参见材料清单）。</li>
		<li>核酸酶处理后，用镊子将切片转移至新的微量离心管中，在无菌条件下于室温下用抗菌溶液（PBS中含200 U/ml青霉素-链霉素和25 µg/ml两性霉素B）处理6小时，同时置于旋转仪上。 
		注：支架可在4 °C的抗菌溶液中保存最多一周后再使用。</li>
		<li>完成抗菌溶液去污染步骤后，在无菌条件下用PBS冲洗支架两次，并在接种细胞前转移至无血清分化培养基（SFDM）中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 内胚层细胞制备
<ol>
	<li>定型内胚层诱导
	<ol>
		<li>在无饲养层、无血清的 2i 条件下维持小鼠胚胎干细胞系的培养13。通过胰酶消化从贴壁的多能性培养中分离细胞，开始内胚层诱导。</li>
		<li>将细胞重悬于 SFDM 培养基中，并以 20,000 个细胞/ml 的密度接种至低黏附培养板中，培养三天且期间不更换培养基，以促进拟胚体（EB）形成。</li>
		<li>三天后，使用 10 ml 移液管轻轻将拟胚体转移至 50 ml 圆锥形离心管中，在室温下静置 3 分钟，使拟胚体自然沉降至管底。</li>
		<li>小心吸除上清液，并加入新鲜的 SFDM 培养基，补充 50 ng/ml 激活素 A（activin A）。</li>
		<li>将细胞以 1:2 的密度重新接种至低黏附培养板中，继续培养额外三天，以实现定型内胚层的分化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定型内胚层富集
	<ol>
		<li>收集第 6 天的拟胚体，用胰酶消化解离，并使用偶联荧光抗体对 c-KIT 和 CXCR4 的表达进行标记14。</li>
		<li>利用荧光激活细胞分选（FACS）对两种标记物均表达的细胞进行分选，从而获得富集的定型内胚层细胞群体15。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 重新细胞化装置设置
<ol>
	<li>气液界面培养体系的建立
	<ol>
		<li>使用无菌镊子将每个脱细胞支架片段（步骤 1.2.9）从 SFDM 中转移至疏水性漂浮膜（孔径 8 µm）上。确保支架片段在膜上均匀铺展。</li>
		<li>准备 6 孔或 12 孔板，分别向孔中加入 1 ml 或 0.5 ml 的 SFDM。轻柔地将膜放入孔中，使其漂浮于培养基表面，形成气液界面培养体系。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三维支架的细胞接种
	<ol>
		<li>在完成 FACS 检测 definitive endoderm 标志物（步骤 2.2.2）后，使用血细胞计数板对分选的细胞进行计数，以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清，重悬于 SFDM 中。调整细胞浓度，使每 10 µl 悬液中约含 100,000 个细胞，用于接种每个支架。</li>
		<li>为实现支架再细胞化，用移液器将 10 µl 细胞悬液直接滴加至步骤 3.1.2 中已准备好的每个支架片段上。</li>
		<li>每 48 小时更换一次 SFDM 培养基。更换时将培养板倾斜轻微角度，吸除旧培养基，避免扰动培养物。沿孔壁缓慢加入新鲜 SFDM，以防止漂浮膜下沉。</li>
		<li>维持气液界面培养最长可达 21 天，以促进接种细胞向成熟气道上皮分化。 
		注意：再细胞化的支架片段可在细胞培养期间的任意时间点取材，用于组织染色及免疫荧光（IF）显微镜检测16。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+Factors%2C+Matrices%2C+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li>
<li>Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+dynamics+in+development+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine.</a> J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).</li>
<li>Ghaedi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+alveolar+epithelium+repopulates+lung+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix.</a> J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).</li>
<li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Jensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+lung+de-cellularization+protocol+supports+embryonic+stem+cell+differentiation+in+vitro+and+following+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation.</a> Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).</li>
<li>Longmire, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+purified+lung+and+thyroid+progenitors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).</li>
<li>Wong, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mature+airway+epithelia+expressing+functional+CFTR+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein.</a> Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).</li>
<li>Gilpin, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Lung+Epithelial+Specification+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+on+Decellularized+Lung+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Annal.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix.</a> Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Acellular+Natural+Lung+Matrix+on+Murine+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation+and+Tissue+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).</li>
<li>Princivalle, M., De Agostini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+roles+of+heparan+sulfate+proteoglycans%3A+a+comparative+review+in+Drosophila%2C+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human.</a> Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).</li>
<li>Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+in+lung+morphogenesis%3A+The+elephant+in+the+room%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+Part+C%2C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room.</a> Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).</li>
<li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li>
<li>Ying, Q. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Fox, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Culture+and+FGF+Signaling+Drive+Differentiation+of+Murine+Pluripotent+Cells+to+Distal+Lung+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells.</a> Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Shojaie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+lung+scaffolds+direct+differentiation+of+endoderm+to+functional+airway+epithelial+cells%3A+requirement+of+matrix-bound+HS+proteoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans.</a> Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).</li>
<li>Kubo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).</li>
<li>Longmire, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Derivation+of+Purified+Lung+and+Thyroid+Progenitors+from+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells.</a> Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).</li>
<li>Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3D+mouse+embryo+atlas+based+on+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT.</a> Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).</li>
</ol>

不存在需要声明的相互竞争的财务利益。

本方案仅使用天然肺支架引导胚胎干细胞（ESC）分化为成熟的气道上皮，无需其他补充成分。该培养体系成分明确、无血清、成本低廉且可重复。基础分化培养基中无需添加任何生长因子。此前发表的干细胞来源肺上皮细胞生成方法多采用二维培养策略，并依赖生长因子补充以促进谱系限定3,4,8,18,19。本方案在多个方面优于上述方法，包括：培养条件明确、向功能性气道细胞的分化效率高、其他内胚层谱系（如甲状腺、肝脏、胰腺）污染极少，以及提供三维分化微环境。该技术使用小鼠来源的细胞外基质（ECM）亦可获得类似结果，因此可修改为利用小鼠肺组织制备脱细胞支架。采用本方案将大鼠来源的胚胎干细胞分化为定型内胚层后接种至支架上，同样可分化为气道上皮。
脱细胞支架可在4 °C的去污染溶液中保存长达7天，之后再进行重新细胞化。保存时间更长的支架可能仍具有功能，但我们尚未进行测试以确认这一点。为了实现有效的组织形成和分化，需要在使用激活素A诱导后，通过FACS对定型内胚层细胞进行富集。第6天的胚胎体（EB）中若存在非内胚层细胞，常会表达多能性标志物Oct4，若将其接种到支架上，这些细胞将继续增殖，但无...

多能细胞向肺系定向分化的进程依赖于微环境中精确的信号事件 1,2由于该过程具有动态性，准确模拟肺器官发生的具体事件一直具有挑战性 体外近期有研究报告采用逐步谱系限制策略，通过在二维培养中添加可溶性生长因子，实现肺部分化3-8在逐步分化方案中，无论胚胎干细胞（ESC）还是诱导性多能干细胞，均首先被分化为定型内胚层。随后，这些内胚层细胞进一步被诱导为前内胚层命运，并最终分化为肺前体细胞，后者可通过表达含同源结构域的转录因子NKX2-1进行鉴定。这些肺前体细胞在持续添加生长因子的条件下，可进一步分化为近端（气道）或远端（肺泡）肺上皮细胞。此类二维培养策略在生成肺上皮细胞方面已取得一定成效，但仍存在若干局限性，包括分化效率不明确、可能受到其他内胚层谱系污染、缺乏三维（3D）结构，以及在某些情况下使用含血清的未明确定义培养体系。将多能干细胞或已分化细胞培养于去细胞化肺支架上，正日益被用作评估接种细胞形成肺上皮结构再生潜能的一种实验方法。3,5,6,8,9此类报道将细胞接种于支架上，并持续添加生长因子或血清。
肺的发育涉及单个细胞在环境信号作用下的分裂、迁移、基因表达及分化。细胞外基质（ECM）是由糖蛋白构成的网状结构，除提供结构支持外，还通过整合和调控上述过程来引导组织形态发生。10,11利用肺ECM支架作为内胚层培养的天然平台，以更真实地模拟 体内 肺发育微环境，我们在明确的三维培养条件下高效且可重复地生成了干细胞来源的气道上皮细胞。
大鼠肺细胞外基质支架通过脱细胞化方法制备，同时生成小鼠胚胎干细胞来源的内胚层细胞，并将其接种至这些支架上。CXCR4的双表达 &amp;#38; c-KIT 蛋白表达提示定型内胚层细胞身份，且 SOX2 双阳性细胞 &amp;#38; NKX2-1 表达的细胞被鉴定为气道（近端肺）前体细胞。将定型内胚层细胞在气液界面（ALI）培养长达三周，以生成功能性气道上皮细胞 体外.
该方案可在培养第7天即诱导定型内胚层向肺谱系分化，表现为出现NKX2-1+/SOX2+早期近端肺祖细胞。在培养第14天和第21天，逐渐出现成熟的气道上皮细胞群体，包括纤毛细胞（TUBB4A+）、克拉拉细胞（SCGB1A1+）以及基底细胞（TRP63+、KRT5+），其形态和功能与小鼠天然气道具有相似性。该方案证实了三维基质微环境在实现高效气道上皮细胞分化中的关键作用。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>灌注液</td><td>Sigma</td><td>H0777</td><td>10 U/ml 肝素</td></tr><tr><td>灌注液</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td>溶于汉克平衡盐溶液（HBSS-）</td></tr><tr><td>脱细胞溶液</td><td>BioShop</td><td>CHA003</td><td>8&amp;nbsp;mM CHAPS</td></tr><tr><td>脱细胞溶液</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td>25&amp;nbsp;mM EDTA</td></tr><tr><td>脱细胞溶液</td><td>BioShop</td><td>SOD002</td><td>1&amp;nbsp;M NaCl</td></tr><tr><td>脱细胞溶液</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>溶于PBS</td></tr><tr><td>苯并核酸酶</td><td>Novagen</td><td>70664-3</td><td>90&amp;nbsp;U/ml 苯并核酸酶&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>苯并核酸酶</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>用PBS稀释</td></tr><tr><td>抗菌溶液&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>200&amp;nbsp;U/ml 青霉素-链霉素</td></tr><tr><td>抗菌溶液&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15290</td><td>25&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml 两性霉素B</td></tr><tr><td>抗菌溶液&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>用PBS稀释</td></tr><tr><td>胰蛋白酶消化&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>TrypLE</td></tr><tr><td>无血清分化培养基（SFDM）</td><td>Gibco</td><td>IMDM 2440-053, F12 11765-054</td><td>IMDM与Ham&amp;rsquo;s改良F12培养基按3:1比例混合</td></tr><tr><td>无血清分化培养基（SFDM）</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td>B27补充剂（50倍稀释）</td></tr><tr><td>无血清分化培养基（SFDM）</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>N2补充剂（100倍稀释）</td></tr><tr><td>无血清分化培养基（SFDM）</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>0.05%（V组分）牛血清白蛋白</td></tr><tr><td>无血清分化培养基（SFDM）</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>200&amp;nbsp;mM Glutamax</td></tr><tr><td>无血清分化培养基（SFDM）</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td>4&amp;nbsp;&amp;mu;M 巯基甘油</td></tr><tr><td>无血清分化培养基（SFDM）</td><td>Sigma</td><td>A4403&amp;nbsp;</td><td>0.05&amp;nbsp;mg/ml 抗坏血酸</td></tr><tr><td>内胚层诱导</td><td>R&amp;amp;D</td><td>338-AC/CF</td><td>Activin A</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>小鼠源，未偶联，1:100</td></tr><tr><td>C-KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>558163</td><td>大鼠源，PE-Cy7标记，1:100</td></tr><tr><td>CXCR4</td><td>BD Biosciences</td><td>558644</td><td>大鼠源，APC标记，1:100</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab24647</td><td>兔源，未偶联，1:1,000</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>兔源，未偶联，1:200</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-144</td><td>兔源，未偶联，1:200</td></tr><tr><td>SCGB1A1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9772&amp;nbsp;</td><td>山羊源，未偶联，1:1,000</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF2018&amp;nbsp;</td><td>山羊源，未偶联，1:400</td></tr><tr><td>TRP63</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8431</td><td>小鼠源，未偶联，1:200</td></tr><tr><td>TUBB4A</td><td>BioGenex</td><td>MU178-UC</td><td>小鼠源，未偶联，1:500</td></tr><tr><td>山羊IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td>驴源，Alexa Fluor 488标记，1:200</td></tr><tr><td>小鼠IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>驴源，Alexa Fluor 488标记，1:200</td></tr><tr><td>小鼠IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>驴源，Alexa Fluor 647标记，1:200</td></tr><tr><td>兔IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>驴源，Alexa Fluor 488标记，1:200</td></tr><tr><td>兔IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31573</td><td>驴源，Alexa Fluor 647标记，1:200</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>低吸附培养板</td><td>Nunc</td><td>Z721050&amp;nbsp;</td><td>低细胞结合板，&amp;nbsp;6孔&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>气液界面膜&amp;nbsp;</td><td>Whatman</td><td>110614</td><td>疏水性Nucleopore膜，孔径8&amp;nbsp;&amp;mu;m</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1200S&amp;nbsp;</td><td>Leica振动切片机</td></tr><tr><td>组织粘合剂</td><td>Ted Pella</td><td>10033</td><td>Pelco组织粘合剂</td></tr></tbody></table>

利用脱细胞肺支架生成胚胎干细胞来源的小鼠气道上皮细胞

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

肺系分化需要整合复杂的环境信号，包括生长因子信号传导、细胞间相互作用以及细胞-基质相互作用。in vitro条件下模拟肺发育以促进干细胞向肺上皮细胞分化一直具有挑战性。在本方案中，采用脱细胞肺支架模拟肺的三维微环境，从而生成干细胞来源的气道上皮细胞。首先通过拟胚体（EB）培养法联合激活素A将小鼠胚胎干细胞定向分化为内胚层细胞，随后将内胚层细胞接种至脱细胞支架上，并在气液界面培养长达21天。该技术无需额外添加生长因子，即可促进接种细胞分化为功能性气道上皮细胞（包括纤毛细胞、克拉拉细胞和基底细胞）。该培养体系成分明确、无血清、成本低廉且可重复。尽管培养过程中可能存在少量非肺源性内胚层谱系的污染，但本方案仅能生成气道上皮细胞群体，无法产生肺泡上皮细胞。利用该方案生成的气道上皮可用于研究肺器官发生过程中的细胞-基质相互作用，也可作为囊性纤维化等气道相关疾病的疾病建模或药物筛选平台。

如本方案所述，通过将接种的细胞在脱细胞肺支架切片上进行长期培养，可实现从定型内胚层向成熟气道上皮细胞的高效分化。建议在将脱细胞支架用于分化前，对其进行表征分析，以确保（1）宿主细胞被完全去除，以及（2）细胞外基质蛋白得以保留。脱细胞效果可通过苏木精-伊红（H&amp;E）染色和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色进行组织学评估，如图1A所示。对支架进行高倍扫描电子显微镜（SEM）分析可确认宿主细胞的缺失以及基质结构的完整性，如图1B所示。此外，还可通过拉伸力学测试和基质蛋白免疫染色等方法对残留支架进行进一步表征，以确认脱细胞后细胞外基质（ECM）的完整性16。
在SFDM培养基中对ESC进行为期六天的非黏附培养，可形成细胞聚集体（类胚体，EBs），如图2A所示。经三天Activin A处理后，可诱导定型内胚层的生成。ES...

该方案可高效地将小鼠胚胎干细胞来源的定型内胚层诱导为成熟的气道上皮细胞。该分化技术在明确的无血清培养条件下，利用三维去细胞肺支架引导肺谱系特化。

肺谱系分化需要整合复杂的环境信号，这些信号包括生长因子信号传导、细胞间相互作用以及……

本实验的总体目标是利用脱细胞肺支架构建的三维培养体系，引导小鼠胚胎干细胞分化为成熟的气道上皮细胞。该方法可用于解答肺发育领域中的关键科学问题，例如细胞外基质收缩以及生长因子信号在肺系分化过程中的作用。该技术的主要优势在于采用明确的无血清三维培养系统，能够实现高效且特异的气道上皮细胞分化，同时最大限度减少其他内胚层谱系的污染。按照文本方案实施安乐死后，将成年Wistar大鼠固定于解剖板上，前肢与后肢分别固定，使用70%乙醇喷洒胸部与腹部区域。在肋骨下方做一小切口，切开皮肤并暴露膈肌。随后在膈肌上做数个小切口，使肺组织回缩，降低穿刺风险。接着沿胸骨做纵向切口，打开胸腔以暴露心脏与肺组织。使用缝线结扎下腔静脉，并用小型解剖剪在左心房处做一小切口。使用预先准备的10 ml注射器（内含25号针头及肝素化Hank's平衡盐溶液），将针头插入右心室，开始肺灌注，推动缓冲液通过肺循环。持续灌注直至肺组织变白，且从左心房流出的液体澄清透明。灌注完成后，暴露气管，并在甲状软骨附近做一小切口以进行插管。使用塑料导管插入气管，并用缝线固定。接下来，通过将10 ml注射器固定于铁架台和夹具上，建立重力灌注系统。移除并丢弃注射器活塞。将注射器筒上最大刻度线位置固定在高于肺组织20 cm处，将二通旋塞连接至注射器末端，再将一段长塑料管连接至旋塞另一端。轻轻将导管从气管中拉出，并连接至塑料管末端。将脱细胞溶液倒入注射器，使溶液完全充满连接的塑料管与导管。将充满溶液的导管重新插入气管，通过充盈至总肺容量进行肺灌洗，持续一分钟。随后将导管从气管中移除，使液体流出肺组织。使用脱细胞溶液重复肺灌洗八次，随后用PBS冲洗十次。灌洗完成后，肺组织呈白色。随后从颈部与胸腔中分离气管与肺组织。去除解剖所得肺组织上的多余组织，包括食管与心脏，然后将肺组织转移至冷PBS中，待后续进行振动切片制备。为制备厚切片，分别配制约15 ml含2%与4%低熔点琼脂糖的PBS溶液，以及足量6%琼脂糖用于将所有肺叶包埋成小型矩形块。将琼脂糖转移至15 ml离心管后，置于加热金属块上，保持温度高于40°C，防止凝固。使用小型剪刀在各肺叶支气管末端处解剖，分离各肺叶。使用吸水纸去除多余PBS，将肺叶转移至加热金属块上的2%琼脂糖中，孵育五分钟以包被组织。将每个肺叶转移至培养皿中，将培养皿置于冷板上，使表面凝胶化约一分钟。轻轻将肺叶置于4%琼脂糖中，孵育五分钟并冷却后，再重复包被一层6%琼脂糖。包被完成后，使用金属底模将每个肺叶单独包埋于6%琼脂糖中，确保组织边缘周围至少有3 ml琼脂糖包裹。使用镊子调整每个肺叶的方向，使组织最大平坦面朝上并面向实验操作者，然后使用塑料包埋盒完成包埋。将包埋块置于冷板上至少30分钟，使其充分凝胶化，再进行振动切片。或者，可在4°C的湿润环境中将包埋块保存最多12小时，再进行振动切片。为制备切片，先设置振动切片机，向切片室中加入冷PBS，并设置周围冰浴以维持低温环境。从金属模具中取出包埋块，使用刀片修剪肺叶周围多余的琼脂糖，保留组织边缘约三毫米的琼脂糖。使用粘合剂将组织固定于样品板中央，并将样品板浸入PBS填充的切片室中。安装切片刀至振动切片机上。在振动切片机上设定切片边界，并分别选择适当的切片速度、振幅与厚度参数。对每个肺叶进行完整切片，若切片未完全分离，可使用小型剪刀手动剪开。轻柔收集支架切片，并转移至冷PBS中。使用镊子将每个切片从周围琼脂糖中轻轻分离。为去污染支架切片，将切片从PBS转移至微量离心管后，加入含90单位/毫升核酸酶的PBS溶液，在室温下旋转孵育12至24小时。按照文本方案，将切片转移至新的微量离心管中，在无菌条件下加入抗菌溶液，室温下旋转孵育六小时。随后在无菌条件下，使用PBS清洗支架两次，并转移至无血清培养基（SFDM）中，待接种细胞前使用。为建立气液界面培养体系，使用无菌镊子将疏水性膜置于培养皿中。将每个脱细胞支架切片从SFDM中转移至膜上，确保切片在膜上均匀铺展。准备6孔或12孔板，分别向孔中加入1 ml或0.5 ml SFDM。轻柔地将膜放入孔中，使膜漂浮于培养基表面，形成气液界面培养体系。为接种三维支架，在完成内胚层细胞制备与荧光激活细胞分选以富集定型内胚层后，使用血细胞计数板对分选后的细胞进行计数。在400 G下离心五分钟使细胞沉淀。使用SFDM将细胞沉淀重悬，调整至约100,000个细胞在10

generation-esc-derived-mouse-airway-epithelial-cells-using

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用脱细胞支架龙ESC衍生鼠气道上皮细胞的生成

我们开发了一种去细胞化肺细胞外基质以及新型仿生生物反应器，可用于生成具有功能的肺组织。通过将细胞接种至基质中并在生物反应器中进行培养，所生成的组织在体内移植后短期内即表现出有效的气体交换功能。...

肺组织工程操作步骤

在本视频中，我们演示了制备一种脱细胞猪食管支架的方法，该支架保留了其生化结构和组成，可用于组织工程应用。...

脱细胞猪食管支架制备：一种由猪食管生成无细胞支架的技术

全器官脱细胞技术可制备天然生物支架，用于再生医学。本文介绍了一种非人灵长类动物肺再生模型，其中完整肺脏在生物反应器中进行全器官脱细胞处理，随后接种成体干细胞和内皮细胞，该生物反应器可支持血管循环和液体培养基通气。...

非人灵长类动物肺脏脱细胞与再细胞化：基于专用大型器官生物反应器的方法

本方案旨在对小鼠的心脏和肺进行脱细胞处理。所获得的细胞外基质（ECM）支架可通过免疫染色和成像，以绘制其组分的位置与拓扑结构图谱。...

小鼠心肺复合体的脱细胞化

本文描述了将诱导多能干细胞逐步定向分化为包含近端和远端肺上皮细胞以及间充质的三维全肺类器官的方法。...

利用诱导多能干细胞构建三维全肺类器官以模拟肺发育生物学及疾病

本方案描述了一种通过使用肺泡上皮II型细胞、成纤维细胞和内皮细胞重新接种脱细胞化精密切割肺组织切片，以生成可重复且小规模工程化肺组织的方法。...

由脱细胞肺切片制备的工程化肺组织

该方案描述了一种可进行成像的生物反应器，可用于选择性去除大鼠气管的内源性上皮，并在外源细胞接种后使其在管腔表面均匀分布，随后实现长期培养 体外...

成像引导式生物反应器用于生成生物工程化气道组织

近年来，人类诱导性多能干细胞分化技术的进步使得能够逐步获得特定器官的细胞类型。本文详细介绍了由诱导性多能干细胞衍生的气道基底细胞的维持与扩增步骤，以及在气液界面培养条件下将其分化为黏液纤毛上皮细胞的具体方法。...

由人多能干细胞生成气道上皮细胞气液界面培养模型

本文介绍了一种在气液界面培养系统中构建包含诱导性多能干细胞（iPSC）来源的肺上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和巨噬细胞的复杂多细胞气道屏障模型的方法。...

利用iPSC衍生的上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和免疫细胞共培养模拟肺部健康与疾病状态下的气道屏障完整性

本文介绍了利用脱细胞和再细胞化方法构建生物工程小鼠肺脏的技术，同时详细描述了后续的原位肺移植过程。...

利用脱细胞小鼠肺和原代人内皮细胞移植生物工程化肺

了解利用脱细胞肺支架三维培养系统，将小鼠胚胎干细胞定向分化为成熟气道上皮细胞的方法。该技术在无血清条件下实现高效肺谱系分化，适用于干细胞生物学与肺发育研究。

利用脱细胞肺支架生成胚胎干细胞来源的小鼠气道上皮细胞

探索更多视频