用脱细胞支架龙ESC衍生鼠气道上皮细胞的生成

该程序的总体目标是使用带有脱细胞肺支架的 3D 培养物，将小鼠胚胎干细胞分化为成熟的气道上皮细胞。这种方法可以帮助回答肺发育领域的关键问题，例如细胞基质收缩和生长因子信号在肺谱系分化过程中的作用。该技术的主要优点是它在确定的无血清环境中使用 3D 培养系统，并实现强大的气道上皮分化，同时受到其他内胚层谱系的污染有限。对成年 wistar 大鼠实施安乐死后，根据文本协议，通过固定前爪和后腿将动物固定在解剖面上，并使用 70% 乙醇喷洒胸部和腹部。在肋骨正下方做一个切口。切开皮肤，露出隔膜。然后，通过横膈膜做小切口，使肺部回缩，减少刺穿肺部的机会。接下来，沿着胸骨做一个垂直切口，打开胸腔以进入心脏和肺。然后用缝合线结扎下腔静脉，并使用小解剖剪刀在左心房放置一个小切口。使用准备好的 10 毫升注射器和装满肝素化 Hank's Balance 盐溶液的 25 号针头，通过将针头插入右心室开始肺灌注，并将缓冲液推入肺循环。继续灌注，直到肺部变白，从左心房流出的液体流出。灌注后，暴露气管，并在甲状软骨附近做一个小切口进行管道通管。然后，用塑料导管插管气管并使用缝合线将其固定到位。现在，通过将 10 毫升注射器固定到蒸馏架和夹具上来设置重力灌注系统。然后，取出并丢弃注射器柱塞。将最大填充点固定在注射器针筒上，位于肺部上方 20 cm 处，然后将双向旋塞阀连接到注射器的末端，并将一根长塑料管连接到旋塞阀的另一端。轻轻地从气管中拉出导管，并连接到塑料管的末端。然后，将脱细胞溶液倒入注射器中，让溶液完全充满连接的塑料管和导管。将装满溶液的导管放回气管中，并通过填充至总肺活量 1 分钟来灌洗肺部。然后从气管中取出导管，让液体流出肺部。用脱细胞溶液重复肺灌洗 8 次，然后用 PBS 冲洗 10 次。洗澡步骤完成后，肺部会呈白色。然后从颈部和胸腔解剖气管和肺。从解剖的肺部中取出多余的组织，包括食道和心脏，然后将肺部转移到冷 PBS 中，直到准备振动切片机。为了制备厚切片，在 PBS 中制备大约 15 ml 的 2% 和 4% 低熔点琼脂糖，以及足够的 6% 琼脂糖，以便将所有裂片包埋到小矩形块中。将琼脂糖转移到 15 ml 试管中后，将试管放在加热块上并保持 40 摄氏度以上的温度以避免胶凝。使用小剪刀，解剖每个肺叶支气管末端的脱细胞肺，然后分离每个肺叶。然后使用吸收片去除多余的 PBS，并将裂片转移到加热块上的 2% 琼脂糖中 5 分钟以包被组织。将每个叶转移到培养皿中后，将培养皿放在冷板上，让表面凝胶一分钟。将裂片轻轻放入 4% 琼脂糖中，孵育 5 分钟并冷却后，用 6% 琼脂糖重复包被。包被后，使用金属基模将每个叶分别嵌入 6% 琼脂糖中，至少 3ml 琼脂糖从边缘围绕组织。接下来，用镊子将组织最大的平坦边缘定位在面向实验者的金属模具表面，确定每个叶的方向，并使用塑料盒完成包埋。在振动切片机切片前，让块在冷板上凝胶至少 30 分钟。或者，在振动切片机切片之前，将块存放在 4 摄氏度的加湿室中长达 12 小时。要准备切片，请用冷 PBS 填充切片室来设置振动切片机。设置一个周围的冰浴，以在整个切片过程中保持低温。现在，从金属模具中取出块，并使用剃须刀片修剪裂片周围多余的琼脂糖，同时保持距离组织边缘约 3 毫米。使用粘合剂，将组织固定在标本板的中心，然后将板浸入填充 PBS 的切片室中。将切片刀片装入振动切片机上。通过分别选择以下速度、振幅和厚度值，设置振动切片机上的切片边界。将每个叶子完全切开，如果切片没有完全分开，请使用小剪刀手动将切片剪开。然后，轻轻收集支架切片，并转移到冷 PBS 中。使用镊子轻轻地将每个切片从周围的琼脂糖中释放出来。为了对支架切片进行去污，将其从 PBS 转移到微量离心管后，每毫升添加 90 单位的 PBS 核酸酶，并在室温下在旋转器上孵育 12 至 24 小时。将切片转移到新的微量离心管后，根据文本方案，在无菌条件下加入抗菌溶液，并在室温下在旋转器上孵育 6 小时。然后在无菌条件下，使用 PBS 冲洗支架两次，并将其转移到无血清培养基或 SFDM 中，然后再接种细胞。要建立气液界面培养物，请使用无菌镊子将疏水膜放在培养皿上。然后，将每个脱细胞的支架切片从 SFDM 转移到膜上，确保切片均匀分布在膜上。分别用 1 ml 或 0.5 ml SFDM 填充孔，制备 6 或 12 孔板。然后，轻轻地将膜放入孔中，让膜漂浮在培养基顶部，形成气液培养装置。为了接种 3D 支架，在制备内胚层细胞和荧光激活细胞分选之后，为了富集最终的内胚层，使用血细胞计数器对分选的细胞进行计数。然后以 400 G 的离心速度离心细胞 5 分钟。使用 SFDM，将沉淀的细胞重悬至大约 100， 000 个细胞，分 10 个