基于光二极管的光学成像，用于记录非转基因无脊椎动物的单神经元分辨率的网络动态

该协议提出了一种利用吸收电压敏感染料和光二极管阵列在非转基因无脊椎动物物种中单细胞分辨率成像神经元种群活动的方法。这种方法能够快速工作流程，其中成像和分析可以在一天的过程中进行。

本文详细介绍了如何使用光电二极管阵列和电压敏感染料同时记录来自大量神经元的动作电位。与间接神经活动的钙成像相比，我们使用的电压敏感染料记录动作电位，直接类似于尖锐的电极记录，但同时跨越许多神经元。我们的光学成像工作流程可以适应在各种非转基因无脊椎动物甚至脊椎动物系统中以单神经元和单动作电位分辨率快速可视化网络活动。

此外，演示我们方案中的程序的是我实验室的 Evan Hill。首先麻醉 40 克重的 Aplysia californica 动物，并将其腹侧朝上固定在涂蜡衬里的解剖皿中。使用解剖剪刀，沿着脚的最前部做一个 2 到 3 厘米的中线切口，并固定切口两侧的脚瓣，露出部分中枢神经系统和颊部肿块。

用镊子和解剖剪刀小心地解剖掉颊侧肿块，露出大脑神经节，并切断支配动物身体的神经，切除中枢神经系统，留下很长的神经受到刺激。使用细小的销钉将中枢神经系统放置在填充盐水的弹性体内衬培养皿中，然后用通过 Peltier 冷却装置的生理盐水灌注培养皿，以将制备温度保持在 15 至 16 摄氏度。使用镊子和显微解剖剪刀从神经中去除多余的结缔组织，并解剖掉神经节或神经节上鞘的浅表部分以进行成像。

然后将清洁后的中枢神经系统浸入 0.5% 戊二醛的生理盐水中 20 秒，然后将中枢神经系统返回到衬有盐水的弹性体培养皿中，以冲洗掉多余的戊二醛。要制备电压敏感染料的工作溶液，请将 500 微升盐水添加到先前制备的 RH 155 固体等分试样中，以达到 0.3 毫克/毫升的最终染料浓度。并使用手持式微量分配器将 200 微升溶液加载到一根与待染色神经节直径相似的聚乙烯管中。

使用显微作器，小心地将管子的末端放在目标神经节上，降低管子，直到它在神经节上形成紧密的密封。每 5 分钟转动一次微量分配器涂抹器旋钮，持续 1 小时，以将更多染料压到神经节上，每 30 分钟检查一次样品，以确认染色是否充分。染色后，保持灯光调暗，在含盐水成像室中将放置制剂的左侧和右侧放置适当的缓冲材料，然后将中枢神经系统浸入腔室中。

将一块适当大小的盖玻片压在组织上，然后用力按压盖玻片以压平组织而不会损坏神经元。然后将成像室放在解剖显微镜下。如果刺激神经以引发虚构的运动程序，请小心地在火焰上熔化一段 PE100 聚乙烯管，同时轻轻拉动管段的两端并在所需点切割所得锥度。

接下来，将一段厚壁柔性聚合物管连接到聚乙烯抽吸电极的后端。然后使用嘴部产生负压，并通过抽吸电极的锥形端吸取少量盐水。在显微镜下将要刺激的神经末端画入电极中，并确认电极中的盐水没有可能中断导电的气泡。

对于神经节的成像，将腔室移至成像装置并通过记录室开始盐水灌注。在制备物附近放置一个温度探针，并根据被成像的物种设置温度。将一根氯化银丝顺着抽吸电极向下，确保它与电极中的盐水接触，然后将一根氯化银银丝放入抽吸电极附近的浴盐水中。

将浸水镜放入盐水中，然后关闭底部光阑。升高或降低下级聚光镜并调整焦距，直到光阑的边缘清晰聚焦，从而产生科勒照明。专注于要成像的制剂区域，并使用齐焦数码相机获取感兴趣的神经节图像。

将控制面板增益开关设置为 1X，然后单击 resting light intensity 按钮以检查二极管的平均静止光强度。调整从刺激器发送到 LED 灯电源的电压电平，并继续检查平均静息光强度水平，直到它处于所需范围内。然后将控制面板增益开关设置为 100X 以进行录音，并仔细检查弹簧或空气表是否浮动。

在指示灯仍然变暗的情况下，在成像软件中设置文件持续时间、路径和名称，然后单击获取数据以采集不超过计算机可用 RAM 容量的文件。在录制过程中要注意保持静止，因为微小的振动会给光学录制数据带来较大的伪影。要在采集后立即查看数据，请使用叠加功能将所有 464 个二极管收集的数据叠加在神经节图像上，然后单击软件中表示的任何二极管以在单独的迹线上扩展记录的数据。

为了实现二极管相对于制备的精确对准，请输入由针孔测试确定的 X、Y 和放大系数。为了最大限度地提高动作电位的可见性并提高神经元产量以进行后续的尖峰分选，请施加具有 5 赫兹和 100 赫兹截止频率的带通巴特沃斯滤波器，以消除低频和高频噪声。要将过滤后的光学数据保存为文本文件以供后续分析，请在页面屏幕上选择 TP filter 框。

然后在输出选项卡下，选择将页面保存为 ASCII。然后在出现的对话框中输入适当的文件名。与海星捕食者的皮肤接触会触发 Tritonia diomedia 的逃逸游泳，包括一系列有节奏的全身屈曲，将其推向安全的地方。

在此图中，显示了来自 20 个二极管的原始和过滤数据，记录了刺激踏板神经 3 之前、期间和之后的活动。采集后，记录阵列的所有 464 个二极管测量的信号可以立即在成像软件中的制备图像上以地形方式显示。在此分析中，使用独立成分分析 （ICA） 对滤波后的二极管迹线进行尖峰排序，产生了 53 条独特的神经元迹线，其中 30 条显示在此处。

对 Aplysia californica 的强烈厌恶尾巴刺激会引发两部分有节奏逃逸反应的重复波，包括几个周期的头部冲刺和尾巴拉动的奔腾期，使动物快速向前移动，以及随后的爬行期。在这个具有代表性的分析中，在连续 20 分钟的光学记录中 1 分钟，刺激踏板神经 9 以引发奔马爬行运动程序序列。来自所有 81 个记录神经元的信号的概率高斯空间分布被映射到神经节上。

应用于完整记录的降维显示，逃逸程序的奔跑和爬行阶段占据了不同的区域，并在主成分空间中形成了不同的轨迹。尝试此方案时，重要的考虑因素包括：优化染色、最大限度地减少振动、将足够的光通过制备路由到 PDA，同时最大限度地减少染料的光漂白。揭示群体水平网络洞察力的采集后分析示例包括通过无监督学习算法中的共识聚类进行功能集成检测和使用主成分分析进行降维。

我们基于光电二极管阵列的成像系统与我们使用的吸收性电压敏感染料相结合，能够监测长时间内的动态网络演变。