Name: 利用计算机图像分析提高4T1乳腺癌模型中肺转移的定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学习使用Fiji-ImageJ计算机图像分析方法对4T1乳腺癌模型中的肺转移进行精确定量。该方案通过减少人工计数误差，为乳腺癌治疗研究提供更快速、更一致的结果。

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本研究由弗吉尼亚-马里兰兽医学院（IA）、弗吉尼亚理工大学关键技术和应用科学研究所健康工程中心（IA）以及美国国立卫生研究院R21EB028429项目（IA）资助。

本文所述所有方法均已获得弗吉尼亚理工学院动物护理与使用委员会（IACUC）的批准，并符合美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的要求。实施本方案需获得相关机构的许可，并严格遵守所有适用的指导原则。
1. 细胞培养
<ol>
	<li>配制完全培养基（RPMI + 10% 胎牛血清 + 1% 青霉素-链霉素）。根据 ATCC 方案10复苏 4T1 细胞，并在 T-25 培养瓶中于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养至细胞融合。复苏后次日更换培养基以去除死细胞；若传代前培养基已耗尽，则再次更换。</li>
	<li>当 T-25 培养瓶中细胞融合后，通过弃去培养基、用 5 mL 1× Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤培养瓶，并加入 500 μL 胰蛋白酶-EDTA 进行传代至 T-75 培养瓶。于 37 °C 孵育 5–10 分钟，直至细胞脱落。
	<ol>
		<li>细胞脱落后，向其中加入 5 mL 预热的完全培养基。吸出后转移至含有 15 mL 预热完全培养基的 T-75 培养瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 T-75 培养瓶中的细胞至少传代四次。每次在细胞融合后，用 8 mL 1× DPBS 洗涤培养瓶，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 使细胞脱落，再加入 10 mL 预热培养基，并按 1:6 至 1:8 比例传代至含有 20 mL 预热完全培养基的新 T-75 培养瓶中。</li>
	<li>将细胞传代至足够数量的 T-150 培养瓶中，每瓶含 40 mL 预热完全培养基，以满足待注射小鼠的数量需求。大多数研究需要多个 T-150 培养瓶，以确保有足够的细胞用于注射。</li>
	<li>当小鼠准备接受注射时（根据 IACUC 或机构方案，通常为 8 周龄或体重超过 20 g），弃去培养基，每瓶用 10 mL 1× DPBS 洗涤，并加入 2 mL 胰蛋白酶-EDTA。于 37 °C 孵育 5–10 分钟，直至细胞脱落。</li>
	<li>用 10 mL 完全培养基洗涤培养瓶，并将全部内容物（10 mL 培养基 + 2 mL 胰蛋白酶-EDTA 细胞混合液）转移至下一个培养瓶。继续使用同一份 10 mL 培养基依次洗涤并收集各瓶中的细胞，以避免使用过多培养基。
	<ol>
		<li>收集完所有培养瓶的细胞后，将全部内容物转移至一个 50 mL 离心管中。取 10 μL 细胞样品至微量离心管中用于计数，并将 50 mL 锥形管在 125 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞离心期间，向 10 μL 细胞样品中加入 10 μL 台盼蓝染液。使用血细胞计数板进行细胞计数。确定细胞总数后，计算每只小鼠注射所需细胞浓度，即每 100 μL 含 1.2 × 106 个细胞。</li>
	<li>离心结束后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于适量无菌 1× DPBS 中，使终浓度为每 100 μL 含 1.2 × 106 个细胞。将细胞/DPBS 混悬液分装至微量离心管中，以便注射时用注射器取液。细胞需置于冰上，并尽快完成注射，因细胞在冰上长时间放置后会开始死亡。</li>
</ol>
2. 注射
<ol>
	<li>通过轻敲或轻轻混匀微量离心管使细胞重悬，准备用于注射的细胞，然后将600 μL吸入1 mL注射器中。将注射器针头朝上，下拉活塞使细胞液远离针头开口处，并轻敲注射器以排除气泡。</li>
	<li>安装针头时使针尖斜面朝上，将细胞液回注至微量离心管中，直至注射器内剩余500 μL。将注射器平放在冰上。 
	注意：4T1细胞容易迅速沉降。因此，需频繁轻敲注射器，使细胞重新悬浮。</li>
	<li>使用异氟烷或其他经批准的麻醉剂对8周龄/&#62;20 g的雌性BALB/c小鼠进行麻醉。通过监测小鼠呼吸情况评估麻醉深度。</li>
	<li>当小鼠角膜反射消失，表明已达到适当麻醉状态时，将其仰卧放置。用拇指、食指和中指轻轻固定小鼠，其中食指和中指压住小鼠上半身，拇指固定其左后肢。操作时应轻柔但稳固。</li>
	<li>针头斜面朝上，将100 μL细胞悬液皮下注射至小鼠左侧腹部乳腺脂肪垫。观察是否形成良好的皮丘及有无渗漏，并确保小鼠注射后能正常苏醒并自由活动。
	<ol>
		<li>每只小鼠更换新针头。 
		注意：切勿使针头进入腹腔，否则会导致癌细胞快速扩散，无法代表该模型的典型特征。为确保皮下注射，当针头插入左侧腹部乳腺脂肪垫后，可轻轻向上提拉。若针头可轻松上提，则表明已正确位于皮下。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 监测
<ol>
	<li>每周至少监测小鼠三次，包括体重、体况评分、肿瘤大小、肿瘤状况、呼吸、活动水平、外观和运动情况。当肿瘤直径达到 0.7–0.8 cm 时，开始每日监测。
	<ol>
		<li>根据机构指南，当肿瘤大小达到 1.5 cm，或体重减轻达到 20%，或观察到体况评分、肿瘤状况、呼吸、活动水平、外观或运动出现严重临床恶化时，应考虑实施安乐死。 
		注：体况评分的监测至关重要，因为随着肿瘤增大，体重可能增加，从而掩盖因疾病负担导致的体况下降。具体的监测方案将取决于批准的 IACUC 或机构方案。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 尸检
<ol>
	<li>根据机构指南，使用 CO2 处死小鼠。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒小鼠体表以消毒。沿小鼠腹侧中线做切口，暴露体腔。</li>
	<li>取出肾脏。继续沿中线剪开，直至可见膈肌。用剪刀刺破膈肌以使肺部塌陷。修剪膈肌以更好地暴露体腔。</li>
	<li>使用钝头剪刀沿胸骨中线剪开肋骨。将肋骨向两侧固定，以暴露肺和心脏。</li>
	<li>将针头插入心脏心尖，注入 2 mL 非无菌 1× DPBS 进行心脏灌注，直至液体流入之前取出肾脏的腹腔区域。</li>
	<li>使用钝头剪刀在心脏上方直接剪断食管和气管。用镊子将心脏从体内轻轻拉出，同时剪除所有连接的结缔组织。肺将随心脏一同被取出。</li>
	<li>辨认多叶（右侧）和单叶（左侧）肺。暂时保留心脏以作定位参考，但在确认肺叶后，将其剪除。</li>
	<li>标记一个 12 孔板，每孔加入 1× Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）。每只小鼠需使用 2 孔。将多叶（右侧）肺放入 12 孔板中用于转移灶评估，并置于冰上。相邻孔暂时保持空置。 
	注意：为确保各样本大小相近，应始终使用同侧肺（多叶肺）。单叶肺可用于其他分析，如组织病理学检查。 
	注意：样本在冰上或 4 °C 条件下数小时内保持稳定。</li>
</ol>
5. 组织处理
注意：本节所有步骤均应使用无菌技术进行。
<ol>
	<li>为每只小鼠标记1个15 mL锥形管，并在每管中加入2.5 mL IV型胶原酶混合液和30单位弹性蛋白酶。配制IV型胶原酶混合液的方法：将2 mg IV型胶原酶溶解于1 mL 1×HBSS中，经无菌过滤。该溶液可在-20 °C保存最长12个月，使用时解冻即可。</li>
	<li>将肺组织转移至该样本对应的第二个洁净的1×HBSS孔中，用镊子轻轻搅动以去除残留血液。将清洗后的肺组织转移至一个空的3.5&#160;cm组织培养皿中，用剪刀剪碎肺组织。用2.5 mL 1×HBSS冲洗培养皿，然后将HBSS及肺组织碎片转移至已含有胶原酶/弹性蛋白酶混合液的15 mL锥形管中（总体积为5 mL）。</li>
	<li>在4 °C孵育75分钟。在此期间持续混合样品，因此需将离心管置于摇床或旋转仪上。孵育过程中，为每只小鼠标记相应的50 mL离心管和10 cm组织培养皿。若需进行稀释，应额外标记足够数量的10 cm组织培养皿用于稀释操作。 
	注意：请在组织培养皿的盖子上做标记。若在培养皿本体上标记，书写痕迹将干扰Fiji-ImageJ分析。</li>
	<li>用1×HBSS将每管体积补至总体积10 mL。将管内液体倒入70 μm细胞滤筛，过滤至对应的50 mL锥形管中。使用1 mL注射器的推杆轻轻碾压样品，促使更多细胞通过滤筛。</li>
	<li>在室温（RT）下以350 × g离心5分钟。弃去上清液，用10 mL 1×HBSS重悬沉淀并洗涤。重复此步骤两次。</li>
	<li>将沉淀重悬于10 mL 60 μM 6TG完全培养基中（可选用RPMI或IMDM）。将样品接种至10 cm细胞培养皿中，可根据需要采用稀释方案。在37 °C、5% CO2条件下培养5天。 
	注意：1:2、1:10和1:100为常用稀释比例，具体应根据实验参数通过经验确定。 
	警告：6TG具有毒性，操作时应小心，并严格遵守环境健康与安全规范进行废弃物处理。</li>
</ol>
6. 染色平板
<ol>
	<li>将培养基从培养板中倒入适当的废液容器中。每块板加入5 mL未稀释的甲醇固定细胞，在室温下孵育5分钟，并确保轻摇甲醇使其覆盖整个板面。 
	注意：甲醇若被摄入、吸入或接触皮肤具有危害性。此步骤应在通风橱中操作。</li>
	<li>将甲醇从培养板中倒入适当的废液容器中。每块板用5 mL蒸馏水冲洗一次，随后将水倒入适当的废液容器中。每块板加入5 mL 0.03%的亚甲蓝溶液，在室温下孵育5分钟，并确保轻摇亚甲蓝溶液使其覆盖整个板面。</li>
	<li>将亚甲蓝溶液倒入适当的废液容器中。再次用每板5 mL蒸馏水冲洗培养板。将培养板倒置，用纸巾轻压以去除多余液体。将培养板置于其板盖上，于室温下静置过夜自然干燥。 
	备注：转移性克隆将呈现蓝色。培养板干燥后可于室温长期保存。</li>
</ol>
7. 图像分析
<ol>
	<li>从培养板上取下已标记的盖子，注意确保样品标识清晰。将所有染色后的肺组织培养板排列在干净、明亮的表面上，以便在同一张图像中拍摄所有培养板的照片。</li>
	<li>在光线充足的区域拍摄培养板集合的照片，注意尽量减少反光，因为培养板表面反光性很强。培养板中的反光会影响图像分析，因此必须避免。 
	注意：Fiji-ImageJ 支持的最大图像尺寸为 20 亿像素。大多数现代智能手机的摄像头已足够使用，但请勿使用低于 800 万像素的相机。本实验所用相机为 Google Pixel 2 上的 1220 万像素摄像头。</li>
	<li>裁剪图像，仅保留培养板部分，去除盖子或图像背景中的其他任何物体。将裁剪后的图像上传至 Fiji-ImageJ。</li>
	<li>使用以下命令将图像转换为黑白图像：图像 → 调整 → 颜色阈值 → 阈值方法：默认 → 阈值颜色：黑白（B&amp;#38;W）→ 阈值空间：Lab。取消勾选“暗背景”选项框。此时图像应为黑白显示，其中黑色代表明亮的背景，白色代表蓝色的转移性克隆灶。</li>
	<li>使用 Fiji-ImageJ 工具栏中的圆形工具选择待分析区域。绘制一个圆形，并在所有培养板上使用相同的圆形区域，以确保每块培养板分析的面积一致。选择一个尽可能覆盖培养板有效区域、同时尽量减少培养板边缘背景噪声的尺寸。在绘制过程中，工具栏会实时显示圆形的尺寸，因此可通过监控高度和宽度来绘制出完美的圆形。</li>
	<li>分析所选圆形区域，确定其中白色部分所占的百分比，该数值代表培养板上存在蓝色转移性克隆灶的区域比例。使用以下命令： 
	分析 → 分析颗粒 → 大小（像素2）：0 至无穷大 → 圆度：0.00–1.00 → 显示：无 → 勾选“汇总”框。点击“确定”。</li>
	<li>记录“% Area”结果。该数值表示所选区域内白色部分所占的百分比，因而代表转移负荷。 
	注意：建议将结果保存在 Fiji-ImageJ 中，或将整个结果页面复制粘贴至单独文档中。若“% Area”结果异常或可疑，则可检查其他测量值是否同样异常，或确认“% Area”是否记录错误。</li>
	<li>通过拖动圆心移动圆形区域（保持其大小不变），将其移至图像中的下一块培养板。对图像中的所有培养板重复步骤 7.6 和 7.7。</li>
	<li>对至少另外两张图像重复步骤 7.1 至 7.8。当所有培养板和图像均完成分析后，对每块培养板在不同图像中的“% Area”结果取平均值，以减少不同照片之间的不一致性。</li>
</ol>

<ol><li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Facts+%26+Figures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Cancer+Society%22%5BJournal%5D)">Cancer Facts & Figures.</a> American Cancer Society. , (2019).</li>
<li>Yousefi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastasis+of+breast+cancer%3A+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis.</a> Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).</li>
<li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+4T1+breast+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse 4T1 breast tumor model.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).</li>
<li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+established+spontaneous+mammary+carcinoma+metastases+following+immunotherapy+with+major+histocompatibility+complex+class+II+and+B7.1+cell-based+tumor+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines.</a> Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).</li>
<li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).</li>
<li>Sikpa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+and+quantification+of+breast+cancer+brain+metastases+in+an+animal+model+using+democratized+machine+learning+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17333(2019).</li>
<li>Valkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+detection+from+whole+slide+images+using+local+features+and+random+forests%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests.</a> Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).</li>
<li>Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+VNP20009+and+VNP20009+with+restored+chemotaxis+on+4T1+mouse+mammary+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression.</a> Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>ATCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.T.C.C.+4T1+%28ATCC+CRL2539%29+Product+Sheet%5BTitle%5D)+AND+%22ATCC%22%5BJournal%5D)">A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet.</a> ATCC. , (2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

如所示，手动计数每块肺组织平板上的转移性病灶可能是一种不准确且不精确的肺转移量化方法，这表明需要更优的量化手段（图2）。组织病理学分析结果与手动计数和Fiji-ImageJ分析均略有差异（图2B和4D），这可能是因为H&amp;E切片并不能代表整个器官的全貌。本方案采集的是完整的肺组织，因此更能代表总体肺转移情况，且比手动计数更具一致性。我们尝试了多种不同的Fiji-ImageJ分析方法，相关讨论如下，但上述方案似乎是更优的方法。
本研究采集了肺、血液和脑组织样本。然而，血液和脑组织样本中的转移性克隆数量极少，甚至可能完全不存在。我们确定，对于这些转移程度较低的组织，人工计数转移性克隆是最优方法，因此未纳入血液和脑组织的数据。当转移负荷较容易进行人工计数时（例如仅有十个或二十个转移性克隆，而非成千上万个），人为误差的原始问题便不再相关，因此无需使用本方案。此外，血液样本在固定后可能在培养板上留下深色斑点，干扰 Fiji-Image...

每八名女性中就有一人在其一生中会被诊断出患有乳腺癌，尽管存在多种治疗方案，乳腺癌仍是美国女性癌症相关死亡的第二大原因1。这些女性并非死于乳腺中的原发性肿瘤，而是由于肿瘤常转移至肺、骨、脑、肝和淋巴结，转移负担导致了该疾病的死亡率2。因此，乳腺癌模型需要评估转移情况，以有助于降低该疾病的死亡率。4T1小鼠乳腺癌模型是实现这一目标的优秀方案。本文所述方法通过使用Fiji-ImageJ对肺转移进行定量分析，对4T1模型进行了改进，可获得一致且快速的结果。
4T1 模型已被广泛确立，大多数实验室采用的是 Pulaski 和 Ostrand-Rosenberg 于 2001 年描述的实验方案3。4T1 细胞系具有 6-硫鸟嘌呤（6TG）抗性，代表第四阶段的三阴性乳腺癌3,4,5。该模型具有临床相关性，属于原位移植模型，可自发转移至与人类乳腺癌相同的器官3,4。4T1 细胞的自发转移率可根据接种的细胞数量进行预测3,4。重要的是，本研究所用小鼠之间的遗传差异会导致转移负荷出现预期的个体间变异性。为评估转移情况，需采集组织，利用 6TG 筛选和亚甲蓝染色法收集并定量远端部位的癌细胞。结果表现为一系列组织培养板，其上的蓝色斑点代表转移性克隆。然而，Pulaski 和 Ostrand-Rosenberg 的方案依赖人工计数来量化转移克隆，因此该方法一直是此模型中评估转移的标准手段。尽管对于转移负荷较低的组织而言该方法较为简便，但肺等组织常含有大量转移灶。由于肺组织培养板常高度融合，通过人工计数准确且精确地量化转移克隆十分困难，且易受人为误差影响。为了更准确地量化转移负荷，我们介绍使用 Fiji-ImageJ 软件作为减少人为计数误差的计算机化解决方案。苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色的组织病理学分析是另一种量化肺转移的方法，有趣的是，该方法也已通过 Fiji-ImageJ 软件得到改进6,7。然而，由于组织病理学分析仅观察肺部的一个切片，可能不够准确且不具备代表性。这是因为 4T1 模型在器官内引发多个分布不均的转移病灶。尽管组织病理学分析与人工计数之间的总体趋势可能相似8，但个体数值可能存在差异，因此不应将组织病理学分析作为唯一的量化手段。我们展示了该方法相较于组织病理学分析的优势，以及不同操作者之间人工计数的不一致性，同时证明了使用 Fiji-ImageJ 的一致性。此外，我们还表明，该方法可将孵育时间从 10–14 天缩短至 5 天，意味着研究人员能够比依赖人工计数更早地分析研究数据。
本方法是对Pulaski和Ostrand-Rosenberg方案3的一系列简单优化。由于4T1模型被广泛使用，且肺转移是临床前模型中一个关键的评估指标，我们认为该方法具有广泛的适用性，对乳腺癌研究人员具有重要价值。所需额外器材仅为一台相机，以及可运行Fiji-ImageJ软件的计算机，后者是一款在图像分析中常用且免费的软件9。本方法特别针对肺转移进行优化，但也可用于其他具有显著转移负荷的组织。

<table><tbody><tr><td>麻醉室</td><td>参见备注</td><td>参见备注</td><td>使用贵机构政策批准的材料</td></tr><tr><td>麻醉剂</td><td>参见备注</td><td>参见备注</td><td>使用贵机构政策批准的材料</td></tr><tr><td>BALB/c 雌性小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000651</td><td></td></tr><tr><td>钝头剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-6700</td><td></td></tr><tr><td>计算器</td><td>任意</td><td>任意</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>任意</td><td>任意</td><td>最低 800 万像素</td></tr><tr><td>离心机</td><td>任意</td><td>任意</td><td>需能够达到 125 × g 和 300 × g</td></tr><tr><td>CO2 安乐死装置</td><td>参见备注</td><td>参见备注</td><td>使用贵机构政策批准的材料</td></tr><tr><td>冷室、冰箱、冷藏设备</td><td>任意</td><td>任意</td><td></td></tr><tr><td>配备 Fiji-ImageJ 的计算机</td><td>任意</td><td>任意</td><td>需能够运行 Fiji-ImageJ</td></tr><tr><td>计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>弯头剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5859</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>任意</td><td>任意</td><td></td></tr><tr><td>弹性蛋白酶</td><td>MP Biomedicals</td><td>100617</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>任意</td><td>任意</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>R&amp;D Systems</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>冰</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>参见备注</td><td>参见备注</td><td>需能够维持 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03978-250ML</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>ATCC</td><td>30-2300</td><td></td></tr><tr><td>大头针或针头</td><td>任意</td><td>任意</td><td>用于尸检时固定小鼠</td></tr><tr><td>塑料游标卡尺</td><td>VWR</td><td>25729-670</td><td></td></tr><tr><td>RMPI-1640 培养基</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>摇床或旋转轮</td><td>任意</td><td>任意</td><td></td></tr><tr><td>锐利剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>带 PES 膜的无菌一次性滤器</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>568-0010</td><td></td></tr><tr><td>T-150 培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-48</td><td></td></tr><tr><td>T-25 培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-10</td><td></td></tr><tr><td>T-75 培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>三角形塑料烧杯</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-111F</td><td>用于称量小鼠</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>IV 型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm 组织培养板</td><td>Nunclon</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 微量离心管</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 组织培养板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-22</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>1× 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30028FS</td><td></td></tr><tr><td>1× Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3026802</td><td></td></tr><tr><td>27 号 1/2 英寸针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>4T1（ATCC&amp;reg; CRL&amp;shy;2539&amp;trade;）</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>6-巯基嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4882</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>用去离子水稀释至 70%</td></tr></tbody></table>

利用计算机图像分析技术改进4t1乳腺癌模型中肺转移灶定量分析

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

乳腺癌是一种严重的恶性肿瘤，仅在2019年就导致美国约4万名女性死亡，占当年美国女性新发癌症病例的30%。乳腺癌相关死亡的主要原因是转移性病变负担。因此，为了具有临床相关性，乳腺癌的临床前模型必须能够分析转移性病变负担。4T1乳腺癌模型为Ⅳ期人类乳腺癌提供了一种可自发转移且可量化的鼠类模型。然而，目前大多数4T1实验方案通过在组织培养板上人工计数染色的克隆集落来量化转移负担。这种方法对于转移负担较低的组织尚可适用，但在培养板集落融合、难以计数的情况下，人工计数容易引入人为误差，导致结果不一致且变异较大。本方法提供了一种基于计算机的解决方案，以克服人工计数的误差。本文中，我们以肺组织为例对该方案进行评估，肺是4T1模型中转移程度较高的组织。将亚甲蓝染色后的培养板进行成像并上传至Fiji-ImageJ软件进行分析。Fiji-ImageJ随后计算图像选定区域内呈蓝色部分所占的百分比，该数值代表培养板上存在转移病变的区域比例。相较于人工计数或组织病理学评估，这种基于计算机的方法在高转移性组织的分析中具有更高的一致性和更快的分析速度。Fiji-ImageJ分析结果的一致性依赖于图像质量。不同图像之间可能出现轻微的结果差异，因此建议拍摄多张图像并取平均值作为最终结果。尽管该方法存在少量局限性，但在肺组织转移负担的量化方面，仍因其结果的一致性和高效性而优于传统方法。

本方法对Pulaski和Ostrand-Rosenberg的4T1方案进行了简单调整3，具体流程可参见图1。当3名独立研究人员对12块肺组织平板（1:10稀释）上的转移灶进行手动计数时，不同计数者之间的结果存在显著差异（图2A）。尽管所有研究人员均被明确指示“计数呈现为蓝色斑点的转移灶”，但结果的不一致性仍反映出在高度转移性平板上进行人工计数所存在的问题。这些研究人员在使用4T1模型方面的经验水平各不相同。为与Fiji-ImageJ肺组织平板分析结果进行对比，另由一名经委员会认证的兽医病理学家对H&amp;E染色的肺组织切片进行转移灶分析（图2B）。
使用 Fiji-ImageJ 分析，3 名不同的研究人员分别对 12 块平板（1:2 稀释）的集合进行了 3 次独立图像分析。图像在两个不同的实验室内拍摄，光照条件略有差异。各图像之间平板的排列方式或拍摄角度均...

我们介绍一种使用 Fiji-ImageJ 对 4T1 乳腺癌模型中的肺转移进行更一致且更快速定量的方法。

利用计算机图像分析技术改进4T1乳腺癌模型中肺转移灶定量分析

乳腺癌是一种严重的恶性肿瘤，仅在2019年就导致美国约4万名女性死亡，占当年美国女性新发癌症病例的30%。

本方案通过临床前乳腺癌模型，以更高的精确度和效率定量肺转移灶，肺转移是导致乳腺癌相关死亡的侵袭性且常见原因。与原始技术相比，本方案使研究人员能够更快地获得更一致的结果，并通过易于使用的计算机技术减少人工计数误差。该技术可完全拓展应用于临床前研究，以评估乳腺癌治疗对肺转移的影响，使研究人员能够在成功治疗后证明转移负荷的减少。首先，标记一个15毫升的锥形管用于组织样本。然后向管中加入2.5毫升IV型胶原酶混合液和30单位的弹性蛋白酶。将肺组织转移至一个干净的1X HBSS孔中，用镊子搅动以去除残留血液，然后将其转移至一个空的3.5厘米组织培养皿中。用剪刀将肺组织剪碎，再用2.5毫升HBSS冲洗培养皿，并将含有肺组织碎片的HBSS转移至预先准备好的含有胶原酶和弹性蛋白酶混合液的15毫升锥形管中。将锥形管置于摇床或旋转轮上，在4°C条件下孵育75分钟。同时，为每只小鼠标记一个50毫升离心管和一个10厘米组织培养皿。如果需要进行稀释，应标记足够数量的组织培养皿用于不同稀释梯度。用1×HBSS将离心管中的液体体积补至10毫升，然后将内容物倒入置于50毫升锥形管上的70微米细胞滤筛中。使用1毫升注射器的推杆通过滤筛轻轻研磨样品。将离心管以350 × g离心5分钟，弃去上清液，然后用10毫升1× HBSS洗涤沉淀物两次。将沉淀物重悬于10毫升60 µM 6-巯基鸟嘌呤完全培养基中，并根据需要采用梯度稀释法将样品接种至10厘米细胞培养皿中。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育五天。将培养基从培养板中倾倒至适当的废液容器中。固定细胞时，向每块培养板加入5毫升未稀释的甲醇，室温孵育五分钟，并确保轻柔摇晃甲醇，使其覆盖整个培养板表面。将甲醇从培养板倒入适当的废液容器中，然后用 5 毫升蒸馏水冲洗每块培养板。每块培养板加入 5 毫升 0.03% 亚甲蓝溶液，在室温下孵育 5 分钟，确保轻柔摇动亚甲蓝溶液使其覆盖整个培养板表面。将亚甲蓝溶液倒入适当的废液容器中，再用 5 毫升蒸馏水冲洗每块培养板一次。将培养皿倒置，轻压在纸巾上以吸去多余液体。将培养皿放在其皿盖上，室温晾干过夜。转移性克隆将呈现蓝色。平板干燥后，可于室温下长期保存。从平板上取下带标签的盖子时，需注意确保样品的清晰标识。将所有染色的肺组织平板整齐排列在干净、明亮的平面上。在光线充足的区域拍摄培养皿集合的照片，注意尽量减少反光。培养皿中的反光会影响图像分析，应予以避免。仔细检查所拍摄的照片，并从多个角度拍摄多张照片。拍摄完平板后，裁剪图像以去除盖子或背景中的任何物体。在 Fiji ImageJ 中打开图像，并通过点击图像、调整、颜色阈值，将其更改为黑白图像。然后选择默认的阈值方法、黑白作为阈值颜色，以及 lab 作为颜色空间。确保未选中深色背景框。此时图像应为黑白显示，黑色代表浅色背景，白色代表蓝色的转移性克隆集落。使用圆形工具选择待分析区域。绘制一个圆形，并将其用于所有培养皿，以确保每个培养皿的分析区域面积相同。选择的圆形大小应尽可能最大化培养皿上的分析区域，同时尽量减少培养皿边缘的背景噪声。绘制时，尺寸会显示在工具栏中。分析所选的圆形，以确定白色区域所占的百分比。点击“Analyze”（分析），选择“Analyze Particles”（分析颗粒），然后尺寸范围选择0到无穷大，圆度范围选择0到1，显示选项不作选择。勾选摘要框并点击确定。通过抓取圆圈中心，将其移动到图片中的下一个孔板，然后重复分析。将结果复制并粘贴到电子表格中。百分面积是指所选区域中呈白色部分所占的百分比，代表转移负荷。在完成所有培养板和图像的分析后，对每块板的不同图像之间的百分面积结果取平均值，以减少图像间可能存在的不一致性。Fiji ImageJ 分析结果与人工计数及组织病理学分析进行了比较。当三名不同的研究人员手动计数转移性克隆时，计数结果在不同计数者之间存在不一致。使用Fiji ImageJ分析时，三幅图像在不同计数者之间的结果均保持一致。每块肺组织平板的结果均综合了三幅图像和三名计数者的数据。对每块培养板的结果进行平均，以消除图像间的差异，从而在不同计数者之间获得一致的结果。在将培养板按转移性从高到低排序时，人工计数仅在最融合的培养板上达成一致，其余所有排序均不一致。而采用 Fiji ImageJ 平均结果所得出的排序在不同计数者之间则具有更高的一致性。为了说明避免图像中出现反射的重要性，此处展示了一张包含手部反射的图像及其后续的 Fiji ImageJ 分析结果，同时展示了一张无反射的相同培养板图像。来自脏污背景表面的深色瑕疵或培养板上残留的血样也可能对 Fiji ImageJ 分析产生负面影响。该血样培养板实际上仅有两个转移性克隆，但由于深色残留物，Fiji ImageJ 将其判定为 31.6% 转移性。进行该实验方案时，请务必仔细检查图像是否存在反光，对图像中每个平板使用相同大小的圆圈，并对每个平板至少三张独立图像的结果进行平均。

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