利用计算机图像分析提高4T1乳腺癌模型中肺转移的定量
2020年10月2日
我们描述了一种更一致和快速的方法，通过使用 Fiji-ImageJ 来量化 4T1 乳腺癌模型中的肺转移。
该协议量化肺转移，这是乳腺癌相关死亡的一个积极和常见的原因，在临床前乳腺癌模型的精度和效率更高。与原始技术相比，该协议为研究人员提供了更快、更一致的结果。它通过易于使用的计算机技术来减轻人工计数错误。
这项技术绝对可以推广到临床前研究，研究乳腺癌疗法对肺转移的影响，让研究人员在成功治疗后证明转移负担减轻了。首先为组织样本标记 15 毫升锥形管。然后加入2.5毫升的四型胶原酶混合物和30单位的弹性酶到管。
将肺移动到一个干净的1X HBSS井，用钳子旋转它，以去除任何剩余的血液，然后转移到一个空的3.5厘米组织培养板。用剪刀将肺切碎，然后用2.5毫升的HSSS冲洗盘子，然后用肺片将HSS转移至准备好的15毫升锥形管中，并含有胶原酶和弹性酶鸡尾酒。在摇轮或旋转轮上，在4摄氏度下孵育管子75分钟。
同时，为每只小鼠贴上一个50毫升离心管和一个10厘米组织培养板的标签。如果进行稀释，标记足够的组织培养板进行稀释。使用 1X HBSS 将管的体积调至 10 毫升，然后将 70 微米细胞过滤器中的内装物倒入 50 毫升锥形管中。
使用一毫升注射器的柱塞通过过滤器轻轻研磨样品。在350倍G下离心管5分钟，丢弃上当液，然后用10毫升1X HBSS洗涤颗粒两次。将颗粒重新在 10 毫升 60 微摩尔 6-硫瓜氨酸完整培养基中，如果需要，使用稀释方案将 10 厘米细胞培养板中的样品进行板状。
在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育5天。将培养介质从盘子中倒入适当的废物容器中。要修复细胞，在每个盘子中加入五毫升未稀释的甲醇，并在室温下孵育五分钟，确保甲醇旋转，使其覆盖整个盘子。
将甲醇从盘子中倒入适当的废物容器中，然后用五毫升蒸馏水冲洗每个盘子。每盘加入五毫升0.03%甲苯蓝，在室温下孵育五分钟，确保使甲基蓝溶液旋转，使其覆盖整个板。将甲基蓝倒入适当的废物容器中，然后用五毫升蒸馏水再次冲洗每个盘子。
将盘子倒置，用纸巾盖住，以去除多余的液体。将盘子放在盖子上，让它在一夜之间风干。转移性菌落将是蓝色的。
一旦板干燥，它们可以无限期地储存在室温下。从盘子上取下贴有标签的盖子，注意确保样品的清晰识别。将所有染色的肺板放在干净、轻盈的表面上。
在光线充足的区域拍摄板集合的照片，确保尽量减少反射。板中的反射会影响图像分析，应避免。密切关注拍摄的照片，从多个角度拍摄几张照片。
拍摄板后，裁剪图像以排除盖子或背景中的任何东西。在斐济 ImageJ 中打开图像，然后通过单击图像、调整和颜色阈值将图像更改为黑白。然后选择默认的阈值方法，黑白的阈值颜色，以及颜色空间的实验室。
确保未选择深色背景框。图像现在应该是黑白的。黑色表示浅色背景，白色表示蓝色转移菌落。
使用圆工具选择要分析的区域。绘制一个圆圈用于所有板，以确保每个板都分析为相同大小的区域。选择可最大化板上分析区域的大小，同时最大限度地减少板边缘的背景噪音。
绘制时，工具栏中将显示大小。分析所选圆以确定白色区域的百分比。单击分析和分析粒子，然后选择零到无穷大的大小，零到一的圆形，没有显示。
选中汇总框并击打正常。将圆圈移动到图片中的下一个板，抓住它居中并重复分析。将结果复制并粘贴到电子表格中。
百分比区域（即所选区域的白色百分比）表示转移性负担。分析所有板和图像后，平均每个板的不同图像之间的百分比区域结果，以减轻图片之间的任何不一致。将斐济 ImageJ 分析与人工计数和组织病理学分析进行比较。
当三个独立的研究人员手动计算转移菌落时，结果在计数器之间是不一致的。斐济 ImageJ 结果在三个图像的计数器之间是一致的。三个图像和三个计数器的结果合并在每个肺板。
每个板的结果是平均的，以考虑图像之间的变化，这提供了计数器之间的一致结果。当排名板从最到最不转移，手动计数同意在最汇合板，但所有以下排名是不一致的。从平均斐济 ImageJ 结果的排名在计数器之间更加一致。
为了证明避免图像中反射的重要性，将显示具有手反射的图像及其随后的 Fiji ImageJ 分析，以及没有反射的同一板的图像。来自脏背景表面的暗瑕疵或血型板上的血液样本残留物也会对斐济 ImageJ 分析产生负面影响。这个血盘只有两个转移菌落，但黑暗残留物导致斐济图像J认为它作为31.6%转移。
尝试此协议时，请记住仔细检查图片进行反射，对图像中每个板使用相同的尺寸圆，并在至少三个单独的图像之间对每个板的结果进行平均。
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概述
该协议在临床前乳腺癌模型中以更高的精确度和效率量化肺转移瘤。与传统方法相比，它提供了更快速和更一致的结果，通过用户友好的计算机技术减少了人为计数错误。
关键研究组成部分
科学领域
- 乳腺癌研究
- 转移瘤量化
- 临床前模型
背景
- 肺转移瘤是乳腺癌相关死亡的常见原因。
- 准确量化对于评估治疗效果至关重要。
- 传统方法可能在计数中引入人为错误。
- 计算机辅助技术可以提高精确度。
研究目的
- 开发一种更有效的肺转移瘤量化方法。
- 提高实验结果的一致性。
- 促进乳腺癌治疗研究。
使用的方法
- 在锥形管中标记组织样本。
- 使用胶原酶混合物和弹性蛋白酶进行样本制备。
- 使用Fiji-ImageJ进行图像分析。
- 将结果与传统计数方法进行比较。
主要结果
- 新方法在量化转移瘤方面显示出更高的精确度。
- 结果比以前的技术获得得更快。
- 减少人为错误提高了数据的可靠性。
- 该协议可以适用于各种乳腺癌研究。
结论
- 该方法显著改善了肺转移瘤的量化。
- 它是研究乳腺癌治疗的研究人员的宝贵工具。
- 未来的研究可以基于这一技术探索治疗影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of metastatic burden is critical for preclinical evaluation of breast cancer therapies, where inconsistent manual counting introduces variability that obscures treatment effects. This computer-based image analysis method enhances predictive confidence by reducing human error and improving reproducibility in highly metastatic tissues like lung. It supports go/no-go decisions in early discovery by providing standardized, quantitative readouts for metastatic phenotype assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables objective interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying lung metastatic burden as a functional readout of metastatic potential.
- Operational Value: Reduces inter-operator variability in metastasis quantification, supporting consistent target validation across research teams.
- Predictive Value: Improves confidence in preclinical data by minimizing counting artifacts that could mislead mechanism-of-action interpretation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative outputs (percent area stained) suitable for high-content screening of compounds affecting metastatic colonization.
- Reproducibility: Averaging multiple images per sample mitigates imaging variability, ensuring reliable assay performance across plates and experiments.
- Scalability: Compatible with Fiji-ImageJ, a widely accessible platform, enabling deployment across multiple labs without specialized instrumentation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models stage IV breast cancer lung metastasis, providing a clinically relevant system for evaluating anti-metastatic therapies.
- Translational Continuity: Supports seamless transition from discovery to preclinical validation by delivering consistent metastatic burden measurements.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven prioritization of candidates based on reproducible metastasis reduction metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow following in vivo modeling and tissue harvest, providing a quantitative bridge between phenotypic metastasis assessment and downstream mechanistic or therapeutic evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by delivering quantitative metastasis data that clarifies the impact of genetic or pharmacological interventions on metastatic spread.
- Screening: Delivers standardized, numeric readouts that enable reliable comparison of compound effects across treatment groups in metastasis-focused screens.
- Analytics: Generates percentage-based metrics that facilitate statistical comparison and normalization across experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by providing clinically relevant lung metastasis quantification that informs therapeutic efficacy assessments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis capability applicable to multiple metastasis models beyond 4T1 lung metastasis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in metastasis quantification by reducing subjective counting error and enhancing data reliability.
- Operational Value: Improves throughput and consistency through automated image analysis, reducing time and labor compared to manual colony counting.
- Strategic Value: Enables more confident go/no-go decisions by providing reproducible metastatic burden data that reduces false positives/negatives in therapeutic screening.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by generating dependable metastasis metrics for prioritizing candidates with genuine anti-metastatic activity.
Implementation Considerations
- Requires basic proficiency in Fiji-ImageJ for image thresholding and particle analysis.
- Depends on standardized imaging conditions to minimize reflections and background artifacts that affect quantification accuracy.
- Necessitates multiple image captures per sample to average results and mitigate inter-image variability.
- Relies on consistent staining and drying protocols to ensure uniform methylene blue signal across plates.
- Benefits from standardized circle sizing for region-of-interest selection to maintain comparability across samples.
