利用计算机图像分析提高4T1乳腺癌模型中肺转移的定量

该协议量化肺转移，这是乳腺癌相关死亡的一个积极和常见的原因，在临床前乳腺癌模型的精度和效率更高。与原始技术相比，该协议为研究人员提供了更快、更一致的结果。它通过易于使用的计算机技术来减轻人工计数错误。

这项技术绝对可以推广到临床前研究，研究乳腺癌疗法对肺转移的影响，让研究人员在成功治疗后证明转移负担减轻了。首先为组织样本标记 15 毫升锥形管。然后加入2.5毫升的四型胶原酶混合物和30单位的弹性酶到管。

将肺移动到一个干净的1X HBSS井，用钳子旋转它，以去除任何剩余的血液，然后转移到一个空的3.5厘米组织培养板。用剪刀将肺切碎，然后用2.5毫升的HSSS冲洗盘子，然后用肺片将HSS转移至准备好的15毫升锥形管中，并含有胶原酶和弹性酶鸡尾酒。在摇轮或旋转轮上，在4摄氏度下孵育管子75分钟。

同时，为每只小鼠贴上一个50毫升离心管和一个10厘米组织培养板的标签。如果进行稀释，标记足够的组织培养板进行稀释。使用 1X HBSS 将管的体积调至 10 毫升，然后将 70 微米细胞过滤器中的内装物倒入 50 毫升锥形管中。

使用一毫升注射器的柱塞通过过滤器轻轻研磨样品。在350倍G下离心管5分钟，丢弃上当液，然后用10毫升1X HBSS洗涤颗粒两次。将颗粒重新在 10 毫升 60 微摩尔 6-硫瓜氨酸完整培养基中，如果需要，使用稀释方案将 10 厘米细胞培养板中的样品进行板状。

在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育5天。将培养介质从盘子中倒入适当的废物容器中。要修复细胞，在每个盘子中加入五毫升未稀释的甲醇，并在室温下孵育五分钟，确保甲醇旋转，使其覆盖整个盘子。

将甲醇从盘子中倒入适当的废物容器中，然后用五毫升蒸馏水冲洗每个盘子。每盘加入五毫升0.03%甲苯蓝，在室温下孵育五分钟，确保使甲基蓝溶液旋转，使其覆盖整个板。将甲基蓝倒入适当的废物容器中，然后用五毫升蒸馏水再次冲洗每个盘子。

将盘子倒置，用纸巾盖住，以去除多余的液体。将盘子放在盖子上，让它在一夜之间风干。转移性菌落将是蓝色的。

一旦板干燥，它们可以无限期地储存在室温下。从盘子上取下贴有标签的盖子，注意确保样品的清晰识别。将所有染色的肺板放在干净、轻盈的表面上。

在光线充足的区域拍摄板集合的照片，确保尽量减少反射。板中的反射会影响图像分析，应避免。密切关注拍摄的照片，从多个角度拍摄几张照片。

拍摄板后，裁剪图像以排除盖子或背景中的任何东西。在斐济 ImageJ 中打开图像，然后通过单击图像、调整和颜色阈值将图像更改为黑白。然后选择默认的阈值方法，黑白的阈值颜色，以及颜色空间的实验室。

确保未选择深色背景框。图像现在应该是黑白的。黑色表示浅色背景，白色表示蓝色转移菌落。

使用圆工具选择要分析的区域。绘制一个圆圈用于所有板，以确保每个板都分析为相同大小的区域。选择可最大化板上分析区域的大小，同时最大限度地减少板边缘的背景噪音。

绘制时，工具栏中将显示大小。分析所选圆以确定白色区域的百分比。单击分析和分析粒子，然后选择零到无穷大的大小，零到一的圆形，没有显示。

选中汇总框并击打正常。将圆圈移动到图片中的下一个板，抓住它居中并重复分析。将结果复制并粘贴到电子表格中。

百分比区域（即所选区域的白色百分比）表示转移性负担。分析所有板和图像后，平均每个板的不同图像之间的百分比区域结果，以减轻图片之间的任何不一致。将斐济 ImageJ 分析与人工计数和组织病理学分析进行比较。

当三个独立的研究人员手动计算转移菌落时，结果在计数器之间是不一致的。斐济 ImageJ 结果在三个图像的计数器之间是一致的。三个图像和三个计数器的结果合并在每个肺板。

每个板的结果是平均的，以考虑图像之间的变化，这提供了计数器之间的一致结果。当排名板从最到最不转移，手动计数同意在最汇合板，但所有以下排名是不一致的。从平均斐济 ImageJ 结果的排名在计数器之间更加一致。

为了证明避免图像中反射的重要性，将显示具有手反射的图像及其随后的 Fiji ImageJ 分析，以及没有反射的同一板的图像。来自脏背景表面的暗瑕疵或血型板上的血液样本残留物也会对斐济 ImageJ 分析产生负面影响。这个血盘只有两个转移菌落，但黑暗残留物导致斐济图像J认为它作为31.6%转移。

尝试此协议时，请记住仔细检查图片进行反射，对图像中每个板使用相同的尺寸圆，并在至少三个单独的图像之间对每个板的结果进行平均。