使用生物提取野外试剂盒和野外qPCR仪进行现场微生物DNA分析

我们的研究范围实际上涉及开展分子分析，以表征参与环境修复、生物采矿和腐蚀防护的微生物，并帮助我们解答有关可持续发展的各种问题。本研究通过采用可靠且便于携带至现场的分子生物学实验流程，弥补了多项科研和可及性方面的不足，且该流程易于使用。打开滤器两端的盖子，使用锁定式鲁尔接头将一支装有空气的三毫升注射器连接到滤器上。

推动空气以排出残留的水分。断开注射器，吸入更多空气后重复操作。然后，重新盖上红色出口盖。

将溶液倒置以混匀。取下鲁尔锁紧式注射器帽，通过鲁尔锁紧接头将溶液A的注射器连接至封装的0.2微米滤器入口。缓慢推动活塞，使溶液A缓慢加入。随后，用力手动振荡密闭滤器5分钟。

现在，将溶液B的注射器反复倒置数次以混匀。取下鲁尔锁紧帽，通过鲁尔锁紧接头将注射器连接至封装滤器的入口。重新盖上入口滤器帽后，用力手动振摇密闭滤器5分钟。

取下进样帽并将滤器倒置。使用连接在封装滤器单元上的3毫升注射器向滤器中推入1毫升空气，然后回拉活塞以完全移除裂解液。

将裂解液转移至一个5毫升的珠管中。用封口膜密封后，用力手动振荡珠管5分钟，然后将其直立放置。将样本制备柱置于平坦表面上，并将一个Luer锁扣柱连接到1毫升注射器上。

使用柱子的尖端在样本制备卡的第一区段上戳出两个孔。从珠管中移取一毫升裂解液，加入卡第一区段新打的孔中。将注射器柱重新插入卡的红色区段。

然后，将液体完全吸入注射器中，并反复推注10次。现在，将注射器柱的尖端对准红橙色区域，刺穿铝箔屏障形成两个孔。使用活塞，将全部体积的液体完全吸入注射器内，再将液体彻底推出。

同样，使用注射器柱穿刺并泵取橙色、黄色、蓝色、风干以及绿色区域，按照各区域所列次数来回推动活塞。然后，使用1毫升注射器和样品制备柱，将绿色区域中的全部溶液转移至已标记的1毫升微量离心管中。将最多三个野外提取的DNA样品放入基于野外的qPCR仪器的纯样品托盘批次中，确保每个指定区域放置一个样品。

将每个样本的检测条放入托盘上对应的 A、B 或 C 条槽中，使每条的第一个孔与托盘上的第一个槽对齐。解锁手机并打开以注册商标 qPCR 仪器命名的应用程序。应用程序打开后，点击“开始运行”按钮。

在下一个界面中，点击“生成 ID”按钮。通过点击“样本 ID”下方并输入样本名称来填写样本信息。点击样本单位并选择合适的单位，然后点击“样本量”下方并输入提取过程中使用的体积。

输入所有样本的信息后，点击“继续”按钮。在下一个屏幕中，点击文件夹图标，然后点击“保存到当前文件夹”。输入运行名称，然后点击“确认”。

按下并按住电源按钮，直到所有前面板指示灯亮起，以开启仪器。在应用程序中点击“确认”以继续。在应用程序中按下“通过集成的短距离无线连接”进行连接。

按下仪器上的集成短距离无线按钮，直到蓝灯闪烁。然后点击确认并选择仪器名称进行连接。取下第一个样本的go条管盖帽。

向每个孔中加入 18 微升无菌水，轻轻吹打以溶解沉淀。向每个孔中加入 2 微升样品，并用橡胶检测条盖密封试管，确保方向正确。所有检测条准备完毕后，在应用程序中点击确认。

取出每根检测条。检查孔底部是否有气泡，然后轻轻摇动检测条，直至气泡上浮。点击“确认”以继续。

打开仪器盖，将检测试纸条按正确顺序和方向放入仪器中。关闭盖子直至其锁定，然后点击“确认”。在应用程序中点击“开始运行”按钮以启动运行。

当运行结束后，点击“电子邮件发送结果”。连接到无线网络后，点击“再次发送”以传输结果。每次运行之间需彻底清洁托盘，以防止污染。

通过与已验证的实验室方法进行比较，使用生物提取现场试剂盒成功完成DNA分离的结果得到了qPCR数据的一致性确认。采用现场qPCR设备分析脱卤球菌（Dehalococcoides）的标准培养稀释液，在21摄氏度和30摄氏度条件下各重复10次，结果均显示偏差较低。对现场仪器进行的精密度测试表明，所有运行中的相对标准偏差均低于5%。

因此，我们的研究通过实现偏远地区的环境监测，真正推动了该领域的发展，切实促进了科研的可及性与社区参与，并产生了重要的科学影响。我们的结果为理解样本在运输过程中与立即提取分析相比所发生的变化奠定了基础。未来的研究将聚焦于明确这些方法在极端样本（如卤水）以及极端天气条件下的应用限度。