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金刚石光源的固定目标串行数据收集
金刚石光源的固定目标串行数据收集
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Biochemistry
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This content is Free Access.
JoVE Journal Biochemistry
Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

金刚石光源的固定目标串行数据收集

Full Text
3,661 Views
06:19 min
February 26, 2021

DOI: 10.3791/62200-v

Sam Horrell1, Danny Axford1, Nicholas E. Devenish1, Ali Ebrahim1, Michael A. Hough2, Darren A. Sherrell1,3, Selina L. S. Storm1,4, Ivo Tews5, Jonathan A. R. Worrall2, Robin L. Owen1

1Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 2School of Life Sciences,University of Essex, 3X-ray Science Division,Argonne National Laboratory, 4European Molecular Biology Laboratory, Hamburg Outstation c/o DESY, 5Biological Sciences, Institute for Life Sciences,University of Southampton

AI Banner

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

我们提供了有关钻石光束线 I24 的串行同步加速器晶体学的固定目标样品制备、数据收集和数据处理的全面指南。

串行同步加速器晶体学(SSX)是MX的一个相对较新且发展迅速的领域,它非常适合低剂量和室温实验,但也许最重要的是,它确实非常适合跟踪动力学。这允许制作蛋白质在起作用的定格动画。在 I24 中,有多种 SSX 模式可用。

该协议侧重于固定目标SSX,允许使用有限量的样品进行广泛的连续实验。如果您不熟悉硅芯片,则在加载和清洁它们时可能会损坏它们。此外,对于许多晶体学家来说,芯片对准协议是全新的,数据处理与标准旋转数据略有不同。

要准备芯片支架,请将两张聚酯箔切割成约6×6厘米的正方形,然后将这些片材放在两个底板上。使用金属密封圈,将板材固定到位,然后小心地拉动多余的箔以去除任何折痕。接下来,选择一个相对于要分析的晶体的大小具有适当尺寸孔径的硅芯片。

Glow 以 0.39 毫巴的电流将芯片放电 25 秒,电流为 15 毫安。使用镊子将硅芯片放在芯片加载阶段,凸起的杆朝下。然后,使用移液器,将200微升的微晶浆液施加到芯片的平坦侧面,将浆液铺开以覆盖芯片的所有城市块。

如果切屑损坏,请用一小块聚酯箔覆盖任何孔,以确保可以施加均匀的真空。然后施加温和的真空,通过芯片吸出所有多余的液体。从芯片加载阶段取出芯片,并用滤纸小心地吸走芯片的底部以除去多余的液体。

将装载的切屑放在切屑支架的较大一半上,在导向标记之间,平面朝下。将切屑支架的一小部分放在芯片上以密封它。芯片支架的两半应卡入到位。

然后,使用六角螺栓将芯片牢固地固定到位。要对齐芯片,请在接近安装座时以 30 度角握住芯片支架。然后使用运动学支架将加载的芯片放置在光束线上的XYZ级上。

当磁铁接触时,允许芯片支架平行于流动旋转,然后卡入到位。放置芯片后,使用光束线轴上查看系统和芯片对准图形用户界面来定位芯片的左上角基准。要在 X、Y 和 Z 中的基准面 0 上居中,请移入和移出焦点以对齐 Z,上下对齐 Y,左右对齐 X。然后单击设置基准 0"以相同的方式将基准 1 和 2 与 X 射线束对齐后,单击"创建坐标系"以生成坐标矩阵。

然后单击"块检查"将XYZ阶段移动到每个城市块的第一个井。如果X射线十字准线与光圈对齐,则芯片对齐。在 DIALS 的现货发现结果的图形表示中,可以观察到更新的命中率图。

如果单击命中,相应的衍射图像将显示在DIALS图像查看器中。在此表中,可以可视化在访问期间收集数据时实时更新的当前索引和集成速率。晶胞参数的可视化可以揭示多晶型。

还可以生成有用参数的二维图,以揭示由于加载或脱水效应而产生的变化。立体投影可以揭示是否存在可反馈到加载协议中的首选方向。例如,在这种投影中,可以观察到用溶菌酶晶体过载芯片的影响。

装入切屑时,请缓慢移液,并用手指将移液器放在切屑上方。这可以防止您触摸芯片并意外刺伤硅上的孔。处理数据时,请使用可用的自动化管道。

这将使您很好地了解实验的进展情况,以及是否需要进行更改。该方法可以应用于任何可以大量结晶的蛋白质系统。反应可以通过光X射线或快速混合触发。

对一系列结构的动态研究可以为蛋白质的功能提供见解。

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