Name: 金刚石光源的固定目标串行数据收集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 了解固定靶串行同步辐射晶体学方法，用于结构生物学中蛋白质动态研究。本方案详细介绍金刚石I24光束线芯片制备、对准及实时数据处理流程，适用于有限样品量的室温实验。

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本工作由欧洲委员会“地平线2020”计划资助的iNEXT-Discovery（资助号871037）支持。

1. 芯片的准备与加载
注意：该过程需在湿度可控的环境中进行（图1），通常相对湿度保持在80%至90%或更高，以防止蛋白质晶体干燥。一旦装载并密封，晶体可存活24小时以上。然而，不同晶体系统之间可能存在显著差异。在样品腔内，需要配备连接至装载台的低功率真空泵以固定硅芯片（图1）、硅芯片、带聚酯薄膜的芯片架（图2）、P200移液器、200 µL移液器吸头、镊子、滤纸以及蛋白质晶体悬液。
<ol>
	<li>准备一个芯片架。
	<ol>
		<li>将两张聚酯薄膜裁剪成约 6 cm × 6 cm 的正方形。</li>
		<li>将聚酯薄膜覆盖在两个基板（大号和小号）上。</li>
		<li>使用金属密封环将聚酯薄膜固定到位。</li>
		<li>轻轻拉紧多余的聚酯薄膜，去除任何褶皱，以便后续更方便地观察和居中样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据晶体的大小，选择具有合适孔径（7–30 μm）的硅芯片。</li>
	<li>在 0.39 mBar 气压和 15 mA 电流下对芯片进行辉光放电处理 25 秒，以促进微晶在芯片表面均匀分散。</li>
	<li>用镊子将硅芯片放置在芯片加载台上，使凸起的条状结构朝下。</li>
	<li>使用移液器将 200 μL 微晶悬液加到芯片的平坦面一侧。</li>
	<li>将晶体悬液铺展，覆盖芯片上所有&#34;城市街区&#34;区域。</li>
	<li>如果芯片受损，可用一小片聚酯薄膜或滤芯吸头封住任何孔洞，以确保能够均匀施加真空。</li>
	<li>施加轻柔的真空，直至所有过量液体被吸过芯片。</li>
	<li>用镊子将芯片从加载台上取下。</li>
	<li>用滤纸小心吸干芯片底面，去除多余液体。</li>
	<li>将已加载样品的芯片放置在芯片架较大一半的导引标记之间，平坦面朝下。</li>
	<li>将芯片架的小半部分盖在上面，完成密封。
	<ol>
		<li>芯片架的两半会自动卡合到位。如果第二半未完全贴合，可将整个芯片架旋转 180°，以正确对齐磁铁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用六角螺钉将芯片架拧紧，牢固固定芯片。 
	&#8203;注：也可采用类似方式加载&#34;无芯片&#34;结构，即将较小体积的晶体悬液（约 15 µL）夹在芯片架内的两层聚酯薄膜之间37；或者如先前所述38，使用厚度为 50 µm 的双面胶垫片直接贴附于聚酯薄膜上进行小体积加载&#160;。使用胶垫片还允许在每个无芯片结构上加载多个样品（或样品变体，例如配体浸泡样品）。在 Diamond 同步辐射光源，也可采用基于声波液滴喷射（ADE）的互补性加载方法来加载硅芯片39。ADE 技术相比移液加载可使用更少的晶体悬液体积，特别适用于样品稀缺的情况，但需考虑悬液的化学组成和黏度。</li>
</ol>
2. 光束线处的图形用户界面与设置
<ol>
	<li>通过简单的 EPICS Display Manager (edm) 图形用户界面 (GUI) 完成所有芯片对准和数据采集设置（图 3a）。该界面为光束线仪器提供点击式操作接口，并为基于 Python 的数据采集提供输入参数。子窗口可进一步控制样品 holder 上子区域的数据采集（图 3b）或激光/LED 泵浦-探测实验（图 3c）。</li>
</ol>
3. 芯片的对准
<ol>
	<li>将加载好的芯片放置于光束线的XYZ样品台上（如图所示） 图4a) 使用运动学安装座。
	<ol>
		<li>注意避免沿运动方向拉动载物台。运动定位座中的磁铁磁性很强，因此很容易意外发生此类情况。</li>
		<li>接近安装座时，应将芯片架保持在轻微倾斜的角度（±30°）。当磁铁接触时，使芯片架旋转至与地面平行。&#160;（0°）且芯片架会咔嗒一声就位（图4b).</li>
		<li>卸载芯片时应遵循相反的操作路径。先将芯片从载物台上旋转并倾斜移开，再将芯片架拉出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用光束线的同轴观测系统和芯片对齐图形用户界面（GUI），定位芯片的左上角对准标记。对准标记为三个呈直角排列的方形，其中两个较小，一个较大（图 5a芯片采用背照式设计，因此芯片整体呈暗色，而孔径则呈现为白色方块。</li>
	<li>在 X、Y 和 Z 方向上对准标志点零位图5b）。通过左右和上下移动分别对齐X轴和Y轴。通过将芯片移入和移出焦平面来对齐Z轴。</li>
	<li>点击 设置 基准零点.</li>
	<li>重复步骤 3.2，针对标记点一（右上角， 图5c）和基准点二（左下， 图5d) 以使所有标记物与X射线束对齐。</li>
	<li>通过按下生成坐标矩阵 建立坐标系，这会计算芯片相对于载物台的偏移量、俯仰角、横滚角和偏航角，从而使得所有后续操作均可在芯片坐标系下进行。</li>
	<li>点击 阻断检测 将XYZ载物台移动至每个城市区块的第一个孔，以目视确认芯片对齐良好。</li>
	<li>如果X射线十字线与孔径对齐，则芯片已对准；否则，重复步骤3.2–3.3。 
	&#8203;注意：如果对齐困难（标记点断裂），可使用芯片上的不同孔径进行对齐，方法是利用 &#34;对齐类型&#34; 下拉菜单。用于固定目标数据收集的芯片类型有多种。通过“芯片类型”下拉菜单可选择不同的芯片类型。I24线站最常用的芯片类型为“Oxford”和“custom”芯片。芯片上的孔径数量及其间距、定位标记等信息均从预定义的芯片字典中读取 通过 下拉菜单。自定义芯片功能可实时定义光阑间距，对于薄膜片对片或其他“无芯片”类型的样品载体（晶体随机分布在载具上）尤为有用37一个全新的Python图形用户界面，提供单击移动功能和自动芯片对齐功能，目前正在开发中，但在本文撰写时尚未准备好用于常规使用。</li>
</ol>
4. 设置数据采集
注意：数据采集设置将取决于所研究的系统及拟进行的实验。这可能包括从最简单的SSX实验（收集低剂量结构）到使用激光或快速混合技术启动反应的时间分辨实验（需要在不同时间延迟下采集多个完整的数据集）。为设置数据采集，需定义以下参数。
<ol>
	<li>实验变量：根据实际情况填写文件夹、文件名、曝光时间、透射率、探测器距离以及每个孔径的拍摄次数。</li>
	<li>芯片类型：如上所述，将芯片类型设置为当前使用的芯片类型。
	<ol>
		<li>若使用的是薄膜或“无芯片”（chipless）样品，则将芯片类型设为 None。</li>
		<li>在图形用户界面（GUI）中定义 x 和 y 方向的步数及步长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置图谱类型：此选项允许选择芯片的特定区域进行数据采集（图3b）。“None”表示从芯片上的所有孔径采集数据；“Lite”表示仅从芯片上选定的区块采集数据（图3b），当已知芯片某区域加载不佳或为空时，此模式尤为有用；“Full”模式允许选择单个孔径进行数据采集，此时必须提供一个格式正确的文本文件。&#160;具体细节和模板可向线站工作人员获取。</li>
	<li>泵浦-探测：选择泵浦-探测实验的类型及所需的时间延迟。泵浦光源（通常为LED或激光）的触发方式通常因具体实验而异，此处不作详细描述。
	<ol>
		<li>“Short”延迟适用于在每个孔径处泵浦与探测之间存在停留时间的实验（即：泵浦，探测，移动至下一个样品），延迟时间通常在1秒或数十毫秒量级。</li>
		<li>“Long”延迟对应“激发后再次访问”（EAVA）策略，即每个孔径被访问两次，两次访问之间具有确定的时间间隔（即：泵浦，移动，泵浦，移动，探测，移动，探测，等等）。时间延迟由系统计算得出，并结合X射线曝光时间进行控制（图3c），通常约为1秒或更长。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 常见的数据收集方法
注意：以下是定义所进行实验类型的几个关键参数。本节假设已设定协议 3 &#34;设置数据采集&#34; 中的其他参数。
<ol>
	<li>情景1： 低剂量数据采集。从样品架上每个选定的孔径采集一张衍射图像。
	<ol>
		<li>将每个孔径的曝光次数设置为1。</li>
		<li>将泵浦-探测设置为 无。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>情景2： 剂量序列，从样品架上每个选定的孔径连续采集 n 张图像。在采集每组 n 张图像时，芯片在每个孔径位置保持静止。
	<ol>
		<li>将每个孔径的曝光次数设置为“n”。请注意，当 n=5、10、20 或其他10的倍数时，数据处理将更为简便。若 n &#60; 5，则难以建立有效趋势。在增加 n 时，应考虑覆盖整个芯片所需的总时间以及生成的图像文件数量。</li>
		<li>将泵浦-探测设置为 无。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>情景3： 泵浦-探测方法
	<ol>
		<li>从 泵浦-探测 下拉菜单中选择一种方法，以打开激光激发控制中心。</li>
		<li>进行泵浦-探测实验时，填写 每个孔径处的激光停留时间 选项。</li>
		<li>对于EAVA实验，填写 每个孔径处的激光停留时间 和 X射线曝光时间，然后点击 计算。</li>
		<li>在edm GUI的泵浦-探测下拉菜单中，选择适当的 重复 选项以设定所需的延迟时间。</li>
		<li>如果实验需要预照射步骤，请填写 激光2停留时间 部分。</li>
		<li>在定义所有实验变量后，按下 设置参数并生成简短列表。此操作将实验变量加载到geobrick控制器上。完成后，按下 开始 将使探测器移入、背光移出，并开始数据采集。在整个数据采集设置过程中，建议打开一个终端窗口，以便实时查看各步骤的状态反馈和执行结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 数据处理
注意：从广义上讲，数据处理可根据反馈所需的紧迫性分为三类。第一类需要快速反馈，以判断晶体是否存在及其衍射情况，以及衍射晶体的数量，此类处理应能跟上数据采集的速度。第二类包括数据指标化（indexing）和积分（integration），速度可稍慢，但仍需在与数据采集相当的时间尺度内完成。第三类是将衍射强度合并和标度，生成用于结构解析的 mtz 文件以及电子密度图，属于最后一步，允许更慢的处理速度。本文仅讨论 I24 线站前两个阶段的初始处理流程，因为它们对于提供实时反馈以指导实验至关重要。但需注意，诸如命中率（hit-rates）和标度统计（scaling statistics）等指标并不能替代对电子密度图的直接观察，后者可能是确认配体结合或原位（in crystallo）反应发生的唯一依据。
<ol>
	<li>快速反馈
	<ol>
		<li>加载数据处理模块，请输入 加载 i24-ssx 模块 进入任意光束线工作站的终端。</li>
		<li>运行命中筛选分析的类型 i24-ssx /path/to/visit/directory/ 进入终端：i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/ 
		注意：这将打开三个终端窗口，一旦数据写入磁盘，将显示来自先进光源衍射积分（Diffraction Integration for Advanced Light Sources, DIALS）的斑点寻址结果的图形化表示 40,41(图6a).
		<ol>
			<li>默认设置每10个进行评分th 图像每几秒刷新一次，以最小化计算负载。</li>
			<li>通过在上述命令末尾添加参数来更改默认设置。例如，输入 'i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2' 将使 i24-ssx 每隔一张图像执行一次命中查找。然而，这可能会对集群（共享资源！）造成过大的负载，从而延长处理时间。该图根据成功索引的可能性进行颜色编码：红色表示已找到至少15个布拉格衍射点（索引成功率较高），蓝色表示几乎没有有用的衍射信号。</li>
			<li>通过点击斑点查找界面中的斑点，在DIALS图像查看器中查看感兴趣的衍射图像。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>索引与整合反馈 
	注意：使用 DIALS 中的 dials.still_process 函数对衍射数据进行索引和整合 40,41因此，应将与您的晶体相关的特定信息（预期的晶体空间群、晶胞参数以及实验几何结构）输入到一个 .phil 文本文件中。
	<ol>
		<li>通过输入以下命令加载 DIALS 模块 加载 dials 模块 在终端中。</li>
		<li>开始处理数据集类型 dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil-file.phil所有仍在处理中的数据集的进度均可通过运行以下命令进行监控 静止图像监测器 通过键入脚本 monitor_stills_process.py （在执行后 加载模块 i24-ssx 并更改目录至当前访问目录）图6b).</li>
		<li>标定衍射数据的晶胞分布图7a) 可通过以下命令进行监测 ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments /path/to/dials/output/*refined.expt combine_all_input=true 这对于识别和解决晶胞多晶型具有重要意义，正如前文所讨论的那样&#160;42.</li>
		<li>通过生成二维图来可视化该分布在一个固定目标上的变化情况（如果存在变化及其变化方式）图7b）使用命令 python pacman.py /visit/processing/_hit_finding/chip.out.</li>
		<li>生成所有已标定衍射数据的立体投影图图7c) 使用 DIALS 命令 dials.stereographic_projection hkl= 0,0,1 expand_to_P 1 =True /path/to/dials/output/*refined.expt. 
		注意：在处理晶体衍射数据时，若布拉维点阵的对称性高于空间群对称性，常会出现合并后的数据呈现完美孪晶的病理现象。数据处理算法已逐步发展以解决此类问题。 43,44,45,46&#160;但用户在处理数据时应留意这一点。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

序列同步辐射数据采集是一种在MX光束线上相对较新的技术，它填补了目前在XFEL上进行的超快数据采集与传统的基于同步辐射的MX之间的空白。本文旨在概述如何在中国台湾光源I24光束线上成功采集固定靶序列数据，用于低剂量、剂量序列以及时间分辨实验。与标准晶体学一样，样品制备是结构解析中的主要瓶颈。序列晶体学（SSX）也不例外，制备足量且均一的晶体悬浊液尚未像大尺寸单蛋白晶体的生长那样受益于数十年的研究与优化。然而，这些悬浊液的制备不在本文讨论范围之内，已在其他文献中进行了总结36。本文所述方法的关键步骤在于，利用易于操作的图形用户界面（GUI）（步骤3）和自动化的数据处理流程（步骤6），对芯片加样（步骤1）及实验的后续进行提供指导，从而谨慎高效地使用有限的样品。
快速反馈管道是一种强大的工具，可让用户在数据收集中评估初始命中率，从而为后续芯片加样方案提供依据，以确保数据收集的成功。当命中率较低时（&#60;5%），用户可能会因数据收集不完整和/或需要额外收集而浪费同步辐射机时。此时，可将样品合并，通过温和离心进行浓缩，和/或在步骤1.5中加载更大体积的样品。较高的命中率通常更有利，但当载样量过高时会出现收益递减现象，即导致同一孔中出现多个晶体。DIALS 能够处理多晶格衍射数据50，但相较于索引与整合，更令人担忧的是晶体聚集对晶体均匀激活所造成的不利影响，例如在需要精确时间分辨的实验中，激光照射或快速混合时晶体的激活会因此变得不均匀。需特别注意&#160;因此，在时间分辨实验中应避免使固定靶过载。
索引与积分处理步骤生成一幅图，其中心十字代表光束方向，每个点代表单个晶格的 hkl 001 衍射面方向，圆的外环代表距离光束轴 90° 的旋转范围。该图可显示晶体是否存在择优取向，这可能影响数据的完整性，并提示需要收集更多数据或调整上样方案。在 图7c 的左侧面板中，展示了在芯片上过量加载 HEWL 晶体所造成的影响。当孔径中填入过多晶体时，它们会附着在孔径的倾斜侧壁上，而非以随机取向楔入孔底。两个正交的椭圆是晶体位于芯片内壁上的结果，这些内壁与光束方向呈约 35° 夹角。这会减少所加载晶体的有效体积，降低命中率，并显著降低处于这些择优取向晶面的晶体比例。
需要注意的是，I24 光束线上还提供其他序列化方法，例如 LCP 挤出器和微流控芯片。这些方法使用类似的图形用户界面（GUI）和相同的处理流程，因此即使采用不同的技术，上述大部分内容仍然适用。除本文所述的固定靶方法外，针对 SSX 和 SFX 已存在多种序列化方法，每种方法在不同实验条件和所用光束线的情况下各有优势。由于序列化方法发展迅速，建议在规划机时的早期阶段，及时查阅光束线网页（https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html）以获取最新信息，并尽早与光束线工作人员沟通。I24 光束线对常规实验和序列化实验的使用均免费。对于英国和欧盟用户，部分差旅与住宿费用可通过 iNEXT Discovery 资助覆盖。

同步辐射序列晶体学（serial synchrotron crystallography, SSX）是一种新兴的数据收集方法，其灵感来源于X射线自由电子激光（XFEL）1,2,3。在XFEL中，通常从一个非常微小的&#160;蛋白质晶体上记录单张衍射图样，随后晶体即被极强的X射线脉冲摧毁。这意味着，通常需要将新的晶体不断引入X射线束中，以获取下一张衍射图样4。这种持续补充晶体的需求推动了多种序列样品递送技术的发展5。
在同步辐射装置中，经典的（非序列式）旋转晶体学方法被广泛应用，该方法利用单个大尺寸晶体，通过测角仪将其在X射线束中旋转，从而收集完整的数据集以解析结构6。为了延长晶体的寿命，使其能够收集完整的数据集7,8，并便于运输和自动化样品转移，通常在约100 K的低温下对晶体进行冷冻处理以用于数据收集。在高强度微聚焦光束线上，由于辐射损伤可能阻碍从单个晶体获得完整数据集，因此经常采用多晶体策略9,10,11。尽管辐射损伤带来了限制，所使用的晶体数量仍然相对较少，且所采用的方法本质上与单晶实验相同。
另一方面，SSX 采用连续样品递送方式，从数千个随机取向的晶体中获取单张静态衍射图样，从而生成完整的数据集。需要注意的是，结合晶体旋转的连续技术正在开发中12,13&#160;，但本文重点讨论静态、无旋转的方法。目前存在多种样品递送系统，各有优缺点14，包括通过聚焦流动/高黏度喷流递送晶体流15,16,17、微流控芯片18,19，或使用固定靶（如刻蚀硅芯片）承载晶体20,21。通常情况下，晶体在室温下保存，这有助于观察更广泛的构象多样性，并提供更接近生理状态的环境22。SSX 能够采集极低剂量的数据集23，因为整个数据集的总辐射剂量相当于对单个晶体进行一次短暂的X射线曝光。SSX 的另一大优势在于可通过时间分辨方法研究蛋白质动力学，反应可通过激光照射24,25,26,27或晶体与配体/底物混合来触发28,29。使用更小的晶体意味着激光能够完全穿透晶体，均匀地启动反应，避免多光子吸收，从而在不同时间点采集到定义明确的反应中间体的衍射数据27。相比之下，使用较大晶体和基于旋转的数据采集方法受限于激光穿透深度有限、激活不均匀或多光子效应、辐射损伤以及数据扫描过程中的机械延迟时间，导致反应中间体混合，难以甚至无法在较快反应速度下进行解析。在混合实验中，较小的晶体同样具有优势，因为配体可以更快且更均匀地扩散至整个晶体，从而在不同时间延迟下记录到明确的反应中间体30,31,32。
在 Diamond 同步辐射光源的微聚焦光束线 I24 上，既可以进行常规旋转晶体学实验，也可以开展串行晶体学（SSX）实验。本文提供了在 I24 光束线上使用固定靶进行 SSX 样品制备和数据收集的全面实验方案，以及 Diamond 光源处串行数据处理的分析流程。尽管本文及配套视频可帮助用户在 I24 成功实施 SSX 实验，但需注意该领域发展迅速，相关方法正在持续演进。此外，串行方法也可在其他同步辐射光源上实现，包括但不限于 Petra III（P14-TREXX）、MAX IV（BioMAX）33、SLS（PXI 和 PXII）34 以及 NSLS（FMX）35。尽管不同光源在串行数据收集与处理的具体细节上会有所差异，&#160;其核心原理保持一致。以下所述方案应被视为开展工作的起点，是通往可能成就的“大本营”之路，而非最终顶峰。
本方案假设使用者已具备蛋白质或小分子晶体体系，并已制备出体积约为0.5–2.0 mL的微晶悬液，且每毫升悬液中含有较高密度的微晶。获取晶体悬液的方案已有报道。&#160;如前所述&#160;36有多种不同类型的固定靶可供使用，I24线站最常用的是精确定义的硅芯片。为了区别于其他芯片布局，下文及光束线界面中将其称为“牛津芯片”。如前所述，牛津芯片布局包含8×8个“街区”，每个街区含有20×20个孔径，总计25,600个孔径。20,21.

<table><tbody><tr><td>芯片架</td><td>定制构建</td><td>N/A</td><td>自制的定制金属芯片支架，由2个磁性底板、2个金属环和一个运动学支架组成。</td></tr><tr><td>无芯片芯片垫片</td><td>SWISCII</td><td>N/A</td><td>LCP模块化系列产品中的LCP粘合片</td></tr><tr><td>Geobrick LV-IMS-II</td><td>Delta Tau</td><td>N/A</td><td>A&amp;nbsp;多轴控制器/放大器，配备定制的Diamond Light Source硬件配置</td></tr><tr><td>运动学支架</td><td>ThorLabs</td><td>KB25/M</td><td>带有三个呈三角形排列磁铁的方形底座固定在芯片支架上。</td></tr><tr><td>KNF Laboport 真空泵</td><td>默克</td><td>Z262285-1EA</td><td>固体聚四氟乙烯真空泵，抽速为10升/分钟。</td></tr><tr><td>Mylar 薄膜 6 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>15360562</td><td>6 密耳厚度的 300 英尺卷装膜 &amp;micro;SPEX SamplePrep 生产的 1.25 微米厚聚酯 X 射线荧光薄膜</td></tr><tr><td>Mylar 薄膜 3 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-675-4</td><td>300英尺长的3号卷 &amp;micro;m 厚的 Mylar XRF 薄膜（由 SPEX SamplePrep 生产）</td></tr><tr><td>Pelco easiGlow 电晕放电系统</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>91000</td><td>一种用于产生亲水性表面的紧凑型独立辉光放电系统</td></tr><tr><td>硅芯片</td><td>南安普顿大学</td><td>N/A</td><td>定制蚀刻硅芯片，带有256,000个孔径，提供多种尺寸选择。</td></tr><tr><td>翻译阶段</td><td>Smaract</td><td>N/A</td><td>XYZ样品台是由Diamond Light Source与SmarAct合作设计，由SmarAct定制制造，采用三个线性平移行程为50 mm的运动台、精密交叉滚柱导轨以及集成传感器，分辨率高达1 nm</td></tr><tr><td>1byOne 加湿器 (701UK-0003)</td><td>1byOne</td><td>B01DENO0EQ</td><td>市售1.3升超声波加湿器</td></tr></tbody></table>

在钻石光源进行固定靶连续数据采集

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

序列数据收集是同步辐射用户相对较新的技术。本文提供了在Diamond Light Source的I24线站进行固定靶标数据收集的用户手册，包含详细的分步操作说明、图示和视频，以确保数据收集过程顺利进行。

低剂量数据采集与剂量序列 
在 I24 线站对亚硝酸盐还原酶微晶进行了低剂量（步骤 5.1：情景 1）和剂量序列（步骤 5.2：情景 2）数据采集，相关数据此前已发表42。所有样品均按步骤 1 所述方法制备，数据按照步骤 3、4 和 5 采集，并采用步骤 6 中的方法进行处理。本研究中，每个光阑位置快速采集一组剂量序列，共获取 20 张衍射图像（即上图所示数据采集图形用户界面中的 n=20），然后转移至新的样品区域。基于这些数据，在空间群 P213 中识别出两种晶胞的双峰分布（a = b = c = 97.25 Å，以及 a = b = c = 96.38 Å）。在数据处理过程中识别并分离这两种晶胞多晶型后，数据质量指标显著改善，并揭示了残基 189–193 之间一个柔性环的两种不同构象，而若将所有数据合并处理则仅能观察到混合状态。此类多晶型的识别在精细的时间分辨结构研究中可能起到决定性作用，尤其是在预期仅存在微小结构变化的情况下。此外，剂量序列数据还揭示了晶体中剂量依赖性的晶胞变化，随着剂量增加，较大晶胞的占比逐渐升高。
Ebrahim 等（2019）47 也开展了类似工作，其中从天蓝色链霉菌（Streptomyces lividans）的一种染料型血红素过氧化物酶（DtpAa）收集了剂量系列数据（第5.2步：情景2），以将SSX（第5.1步：情景1）获得的低剂量结构与在同一固定靶系统中通过SFX测量的结构进行比较。SFX数据在SACLA BL2 EH3光束线上采集，脉冲长度为10飞秒，重复频率为30 Hz。10飞秒的脉冲持续时间确保了SFX数据中不存在剂量依赖性效应。SFX数据与在I24光束线上采集的SSX数据进行了比较，后者在每个样品位置进行了10次连续的10毫秒曝光（即 n=10）。在SSX剂量系列中观察到血红素铁配位水分子从铁原子处发生剂量依赖性迁移，以及其中一个血红素丙酸基团的构象变化。尽管SSX结构不像SFX结构那样无损伤，但通过剂量系列可外推零剂量数据集（高铁血红素）的Fe-O键长，该值在实验误差范围内与SFX获得的数值一致。
本文所述的序列晶体学数据收集方法也可轻松调整，用于提供新的样品环境，例如在室温下研究厌氧蛋白质结构。如 Rabe et al 202048 所述，在厌氧环境中使用不同的密封膜对“片上叠片”样品（即无芯片的芯片）进行装载，可实现对氧气敏感样品在室温下的结构数据收集。
泵浦-探测 
尽管以下代表性结果并非在Diamond I24光束线上采集，但这些方法是在iNEXT项目各设施之间密切合作开发的，旨在推动序列晶体学方法开发中的标准化。I24光束线目前或即将提供与下文所述相当的数据采集方法，可用于采用上述方案中描述的方法开展此类实验。
泵浦-探测：快速混合 
Mehrabi 等人（2019）28在 PETRA III 的 T-REXX 光束线上利用压电驱动的液滴注射器，在固定靶上启动反应，实现了快速混合SSX。该工作展示了一项基于芯片混合实验的原理验证，即将GlcNac3结合到溶菌酶微晶上，在向样品施加75 pL液滴后50 ms内即发生结合。随后，该方法被用于木糖异构酶活性的7个结构时间分辨序列研究，结果显示葡萄糖在15 ms内结合，并在60秒时间延迟后形成葡萄糖分子的开环构象。目前，一种用于I24光束线的等效液滴注射装置正在开发中。
泵浦-探测：光激活 
Schulz 等人（2018）49 报道了一项光激活的泵浦-探测序列实验。将氟乙酸脱氢酶与光笼型氟乙酸共孵育，并用 320–360 nm 激光照射，获得了四个时间点（t = 0、30、752 和 2,052 ms）的结构。静息态结构（0 ms）显示活性位点为空，仅存在少量水分子，且两个蛋白亚基的盖状结构域之间的电子密度相当。光激活后 30 ms 和 752 ms，相对于亚基 A，亚基 B 的盖状结构域中电子密度显著降低。亚基 B 盖状结构域中电子密度的降低与 752 ms 时氟乙酸在亚基 A 活性位点的出现相一致。最终在 2,052 ms 获得的数据集显示配体发生了进一步的结构重排，推测有助于形成适合 SN2 攻击的正确几何构型，并可能形成了反应中的中间态。在 I24 光束线上，可使用一种便携式 Pharos 激光系统进行光激活，该系统波长可调范围为 210–2500 nm，可提供飞秒脉冲。初步实验已成功利用 308 nm 激发实现光笼的激活，并观察到释放的配体与靶标蛋白结合。截至本文撰写时，该系统与光束线人员安全系统的整合工作正在进行中，预计于 2021 年初开始常规用户实验。对于需要较弱光脉冲的实验，已成功使用 TTL 控制的 LED 实现光激活。
<img alt="用于样品制备、真空系统和湿空气控制的手套箱静态平衡实验装置" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：在中国台湾Diamond Light Source处就位的样品装载设备。该装置包括一个真空泵（a）、手套箱（b）和加湿器（c）。在手套箱内，通过连接至三通阀（g，蓝色箭头）的压力调节器（f，黄色箭头），利用真空压力作用于载有晶体浆料的芯片，该芯片置于固定在布氏烧瓶（e，绿色箭头）上的样品块（d）中。加湿空气通过连接至加湿器（h）的塑料管导入帐篷内，并使用湿度计（i）进行测量。各组件由夹具支架（j）固定位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="XRF薄膜分析装置示意图，含Mylar膜；用于化学测试的材料已标注。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：样品支架。 采用金属O形环（a）将聚酯膜固定在上半部分（b）和下半部分（c）之间，其中下半部分配有磁性底座（d），用于将样品支架固定在样品台。聚酯膜（6 µm（e）或 3 µm（f））以及橡胶O形环（白色箭头）可防止载有晶体的芯片在用六角螺栓（g）紧密封闭的样品支架中快速干燥。芯片依次在dH2O、1 M HCl和dH2O中各清洗15分钟（h）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="固定靶材 SSX 软件界面，用于数据采集和激光激发设置；映射与控制" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：I24 线站上用于固定靶材数据采集的数据采集图形用户界面（GUI）。 （a）显示用于芯片对准及定义数据采集参数的主界面，（b）为用于定义芯片上子区域以进行数据采集的简化映射界面，（c）为用于定义激光照射参数的界面。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="DNA测序、方法、实验；测序装置、光学系统。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：如步骤3第1点所述，将芯片架安装到载台上的过程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微阵列网格分析，展示荧光模式和斑点检测网格中的数据可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：芯片对准。通过点击芯片上显示的三个基准标记完成芯片对准，如图（a）所示。通过光束线轴上观察系统看到的基准标记 0、1 和 2 的视图分别如图（b）、（c）和（d）所示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="晶体学图像分析流程；衍射图样、光斑计数图、数据集表格结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：按步骤6.1所述启动的自动处理结果展示。实时更新的命中率图谱被显示（a，插图）。若点击某一“命中”，则对应的衍射图像将在dials图像查看器中显示。当前数据采集的命中率为29.6%（本示例中）。图（b）展示了一个窗口示例，显示本次实验期间截至目前所采集数据的实时更新的指标化与积分速率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="晶体学晶胞分布；图表、热图、极射赤面投影图；793个晶体。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：更深入的数据分析。 晶胞参数的可视化可揭示多晶型的存在（a）。可计算平均晶胞参数，但目前尚未扩展到对各多晶型分别计算平均值。通常，对一小部分数据进行可视化（图中显示的数据为Ebrahim et al 2019年所述数据中793个亚硝酸盐还原酶铜晶体的子集）已足以揭示趋势。还可生成有用参数的二维图，以揭示由于加样或脱水效应引起的变化，从而为后续数据采集提供优化依据（b）。极射赤面投影可揭示样品是否存在择优取向，进而反馈至加样方案的改进（c）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文介绍了在Diamond光源I24线站进行序列同步辐射晶体学实验的固定靶样品制备、数据收集和数据处理的综合指南。

序列数据收集对于同步辐射用户而言是一项相对较新的技术。英国钻石光源I24线站固定靶数据收集的用户手册是……

同步辐射序列晶体学（Serial Synchrotron Crystallography，简称 SSX）是 MX 领域中一个相对较新且快速发展的方向。它非常适合低剂量和常温实验，但更重要的是，它非常适用于追踪蛋白质的动态过程，从而能够制作出蛋白质运作过程的“定格动画”电影。在 I24 线站，提供了多种 SSX 实验模式。本方案聚焦于固定靶SSX技术，该技术可在样品量有限的情况下进行多种连续实验。在加载和清洗硅芯片时，若操作者不熟悉相关流程，则可能造成芯片损伤。此外，芯片对准方案对许多晶体学家而言是全新的，且数据处理方法与标准的旋转数据略有不同。为制备芯片支架，将两张聚酯薄膜裁剪成约6厘米×6厘米的正方形，分别覆盖在两个底板上。使用金属密封环将薄膜固定，然后小心拉紧多余的薄膜以去除任何褶皱。接下来，根据待分析晶体的尺寸，选择具有合适孔径的硅芯片。在0.39毫巴气压下，以15毫安电流对芯片进行25秒辉光放电。使用镊子将硅芯片放置在芯片装载台上，使凸起的条状结构朝下。然后，用移液器将200微升微晶悬液加到芯片的平整面，均匀铺展悬液以覆盖芯片上所有微区。 如果芯片受损，需用一小片聚酯薄膜覆盖任何孔洞，以确保能够施加均匀的真空。然后施加轻柔的真空以通过芯片抽吸去除所有多余的液体。将芯片从芯片加载台上取下，并用滤纸小心吸干芯片底部的多余液体。将已加载的芯片放置在芯片架较大一半的导引标记之间，平整面朝下。将芯片架较小的一半盖在芯片上以密封。芯片架的两部分应卡扣到位。然后，使用六角螺栓将芯片牢固固定。为对准芯片，应在接近安装位置时将芯片 holder 保持在 30 度角。接着使用运动学安装座将装载好的芯片放置到光束线的 XYZ 平台上。当磁铁接触时，使芯片架旋转至与流道平行，并卡入到位。芯片放置完毕后，使用光束线在线观察系统和芯片对准图形用户界面，定位芯片的左上角基准点。为在X、Y和Z方向上将基准点0居中，需通过调焦前后移动以对准Z方向，上下移动以对准Y方向，左右移动以对准X方向。然后单击“设置基准点0”。以相同方式对准基准点1和基准点2与X射线束后，单击“生成坐标系”以建立坐标矩阵。然后单击“Block Check”以将XYZ载物台移动到每个城市区块的第一个孔。如果X射线十字线与孔径对齐，则表示芯片已对准。在此DIALS的光斑识别结果的图形表示中，可以观察到实时更新的命中率曲线图。如果点击命中结果，相应的衍射图像将在DIALS图像查看器中显示。在此表格中，可以实时可视化当前的指标化和积分率，这些数据在访问期间随着数据采集而实时更新。晶胞参数的可视化有助于揭示多晶型现象。还可以生成有用参数的二维图，以揭示由于上样或脱水效应引起的变化。施密特投影可以揭示是否存在择优取向，这些信息可反馈到上样方案中。例如，在此投影图中，可以观察到在芯片上过量加载溶菌酶晶体所产生的效应。加载芯片时，应缓慢使用移液器，并用手指将移液器悬停在芯片上方。这样可以避免触碰芯片，防止意外刺穿硅片。处理数据时，应利用现有的自动化分析流程。这将使您清楚了解实验的进展情况，并判断是否需要调整某些条件。该方法可应用于任何能够以较大量结晶的蛋白质体系。反应可通过光照、X射线或快速混合来触发。对一系列结构进行动态研究可以揭示蛋白质的功能机制。

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