基于肽矩阵的 HBV 特异性 CD4 T 细胞响应和 HLA-DR 受限 CD4 T 细胞表位的识别分析

在慢性乙肝病毒感染中，CD4 T细胞在病毒清除和返回中都起着重要作用。此方法使我们能够同时评估 HBV 特定 CD4 T 细胞响应并识别 HBV 特定 CD4 T 细胞表位。演示程序的将是研究助理肖建梅。

还有来自比劳的技术员兴万首先，使用Ficoll密度梯度离心，将周围血液单核细胞（PBMCs）与血液分离，在800倍G下进行20分钟。然后，使用巴氏管移液器收集血细胞和红细胞层之间的粒细胞。

将解冻的细胞悬架转移到15毫升离心机管中，加入1毫升预加热的本佐纳塞RPMI 1640，明智地下降，然后慢慢再加6毫升。用两毫升本佐纳塞RPMI 1640冲洗冷冻小瓶，以取回剩余的细胞。然后以 400 倍 G 离心管 10 分钟。

取出超高超剂，通过敲击管子松开颗粒。轻轻地将颗粒重新悬挂在一毫升温暖的本塞纳斯NACERPMI 1640中。轻轻混合细胞，并过滤他们通过70微米的细胞过滤器，如果任何细胞团是可见的。

使用锥蓝色和血细胞计计算可行细胞。重新暂停 PBMC 和完整的培养介质，每毫升 IL2 包含 10 个单位，每毫升 IL7 包含 10 毫微克。将细胞密度调整到每毫升 1.5x10 到 6 个细胞。

然后将细胞以每口井 3x10 的密度镀在 96 井平底板中，以第五个细胞为单位。将乙型肝炎病毒或乙肝病毒衍生肽池添加到每个井中。对于背景和正控井，添加相同数量的溶剂。

在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵化板材。第三天，将培养介质补充为每毫升IL250单位，每毫升IL710毫微克。在第七天，用含有新鲜介质的新鲜介质替换一半的培养基:每毫升肽4微克，每毫升IL2100毫克，每毫升IL720毫微克。

在第10天，轻轻地将每口井中的细胞移液7到9次，以分解细胞簇。计算可行细胞的数量，并将 2x10 转移到第五个细胞到 96 井圆形底板的每个井中，以便进行 HPV 特定 CD4 T 细胞响应分析。对于 96 井平底板中的残余细胞，通过丢弃过量的介质将培养介质的体积调整到 100 微升。

然后，用100微升新鲜、完整的培养基补充培养基，包括:每毫升肽4微克，每毫升IL2100微克，每毫升IL72微克20毫微克。继续在37摄氏度和5%的二氧化碳下培育细胞，以便在第12天进行表位鉴定。通过添加 200 微升 RPMI 1640，以 550 倍 G 离心板三分钟来清洗 96 井圆底板中的细胞，并丢弃超高分子。

在最后一次洗涤时，使用完整的培养介质重复洗涤两次。对于每口用特定肽池刺激的细胞，加入200微升完整的培养介质微升，辅以相同的肽池。对于背景控制井，添加完整的培养介质，辅以每毫升 DMSO 一微升。

对于正控制井，添加完整的培养基，每毫升DMSO1微升，每毫升PMA150毫微克，每升离子霉素1微摩尔。在37摄氏度的22氧化碳中孵育板6小时。经过一个小时的孵化，在培养物中加入每毫升莫宁素1.37微克。

6 小时孵化完成后，以 550 倍 G 离心板进行三分钟。删除超高分子，用200微升的DPP清洗细胞一次，如前所述。表面标记 CD3、CD4 和 CD8 以及生存性标记的污渍。

用振动器暂停细胞后，然后在摄氏4度下冷藏30分钟。用 200 微升 DPBS 清洗盘子一次后，固定并渗透细胞，染色细胞因子、TNF Alpha 和干扰素伽马，并在 4 摄氏度下冷藏板 45 分钟。再次清洗细胞，并重新悬挂在150微升的流动细胞学缓冲器中。

然后，使用流细胞仪获取流细胞学数据。在 T-75 烧瓶中保持过敏性 B 淋巴细胞细胞系或 BLCL。在 PBMC 扩展的第 12 天，计算可行 BLC 的数量，并将它们转移到 15 毫升离心机管中。

以 350 倍 G 离心细胞 10 分钟，并取出超高分子。重新暂停细胞颗粒和完整的培养介质。然后，将BLCL以每口井4x10到第四个细胞的96井圆底板，以及80个完整培养介质的微升。

每毫升添加10微克单肽，并设置两个背景控制。肽与 HLADR 阻塞和 DMSO 脉动脉动。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育盘子两个小时。

每毫升Mictomycin C加入100微克，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育一小时。用RPMI 1640的200微升洗盘三次，去除未脉动肽和米霉素C，然后使用振动器将细胞重新悬浮在120个完整培养介质的微升中。在 PBMC 扩张的第 12 天，将 PBMC 转移到 96 井圆底板。

像之前所证明的那样，将板中的细胞离心，取出超高分子，然后用RPMI 1640的200微升洗两次。将每口井中的 PBMC 重新悬挂，配备 210 个完整培养介质的微升。对于选择表位识别的 PBMC 井，细胞悬浮物的 70 微升，并与三口井中的肽脉冲 BLCL 混合，包括两个背景控制。

在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育板6小时。经过一个小时的孵化，在培养物中加入每毫升莫宁素1.37微克，使每口井的最终体积达到200微升，具有完整的培养介质。在这个具有代表性的例子中，TNF Alpha 和干扰素-伽马分泌 CD4 T 细胞对肽池 Core11 的反应低于背景值的两倍，因此被认为是负数。

同时，对肽池Core09的反应高于背景的两倍，并被认为是积极的。灰色背景表示威尔斯具有阳性的CD4 T细胞反应，表位识别候选肽以红色表示，Core01的反应率最高，从TNF阿尔法和干扰素伽马分泌CD4T细胞的列肽池来看。肽 C1 到 15， C31 到 45， C61 到 75， 和 C91 到 105 在这个肽池， 被设置为候选肽， 因为含有这些肽的肽池行也显示积极的结果.

使用肽池扩大的 PC 酷睿 07、08、09 和 10 用于这些肽的表位识别。同样，Core09 在排肽池中响应率最高。此池中的所有肽均设置为候选肽，使用肽池扩展的 PBMC:Core01、02、03、04、05 和 06 用于这些肽的表位识别。

对于肽池 Core08 扩展的 PBMC，在用肽 C31 到 45 脉冲 BLCL 刺激后，TNF Alpha 和干扰素-伽马分泌 CD4 T 细胞的频率比背景控制高两倍。因此，肽C31至45是经验证的HLADR受限CD4 T细胞表位。它在那里， 额外的扩展 Pbmcs 剩余后， 表位识别。

可使用缩短肽面板对已识别的表位进行精细标记。