Name: 高通量MHC II类分子结合分析抗原表位肽的定量分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学习高通量肽-MHC II结合分析方法，使用384孔板和时间分辨荧光技术定量检测短肽与人MHC II蛋白的结合亲和力。该方法可加速免疫原性表位鉴定，为疫苗开发和蛋白质去免疫化研究提供快速、经济的技术支持。

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本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）授予 CBK 和 KEG 的 R01-GM-098977 和 R21-AI-098122 基金项目资助。RSS 部分受卢斯基金会（Luce Foundation）研究员项目资助，部分受工程学院（Thayer School of Engineering）塔耶创新计划（Thayer Innovation Program）研究员项目的资助。

肽-MHC II 结合实验包含四个主要步骤：1-结合：待测肽段与标记的对照肽段在溶液中竞争结合可溶性 MHC II 蛋白。通过一系列不同浓度的待测肽段测定结合情况。2-捕获：当结合反应接近平衡后，利用固定化的抗体通过构象依赖性识别，将肽-MHC II 复合物从游离的肽段和蛋白质中捕获并分离出来。3-检测：使用时间分辨荧光法对捕获的对照肽段进行定量检测。4-分析：对光谱数据进行处理、绘图和分析，以确定待测肽段与 MHC II 蛋白之间的剂量依赖性结合特性。
在以下实验步骤中的多个环节，如果条件允许，建议使用液体处理机器人。特别是在384孔板体系中，自动加样和稀释液体可最大限度减少人为操作误差，使各孔之间的液体体积更加一致，并相比手动操作的96孔板检测获得更窄的IC50值95%置信区间（数据未显示）。若无液体处理机器人，标注有“（液体处理机器人）”的步骤可手动完成。同样，如条件允许，建议使用与384孔板兼容的自动洗板机，以有效标准化洗板过程。若无洗板机，标注有“（洗板机）”的步骤也可手动完成。
1. 包被 ELISA 板（第 1 天）
<ol>
	<li>将 L243 抗体原液（0.5 mg/ml）用硼酸盐缓冲液稀释至工作浓度 10 µg/ml。
	<ol>
		<li>为包被一块 384 孔板，将 200 µl 抗体原液加入 9.8 ml 硼酸盐缓冲液中。（不同规模稀释请参见补充电子表格计算器）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向 384 孔高结合白色 ELISA 板的每孔中加入 25 µl L243 抗体溶液。（使用液体处理机器人）</li>
	<li>用聚酯膜密封板孔，并在 4 °C 下孵育过夜。 
	注意：每块 384 孔 ELISA 板最多可容纳 15 种测试肽段，每种肽段设 8 个稀释度，对应一种 MHC II 等位基因，同时包含阳性和阴性对照。最终可获得三复孔测量结果。</li>
</ol>
2. 制备测试肽段稀释液（第1天）
<ol>
	<li>从每种测试肽在 DMSO 中的 10 mM 原液开始，使用 384 孔聚丙烯板在柠檬酸磷酸盐缓冲液中配制以下系列稀释液（表 1）。（液体处理机器人） 
	注意：一个完整的 384 孔聚丙烯板需要三个独立的 ELISA 板。三分之一的聚丙烯板仅需一个 ELISA 板（图 1）。</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody align="center">
		<tr>
			<td rowspan="2">稀释序号</td>
			<td>从前一稀释液/原液中取用的体积</td>
			<td>需加入的柠檬酸盐缓冲液体积</td>
			<td>稀释液浓度</td>
			<td>结合反应中的浓度</td>
			<td>中和 ELISA 中的浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(μl)</td>
			<td>(μl)</td>
			<td>(μM)</td>
			<td>(μM)</td>
			<td>(μM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0.7</td>
			<td>35.1</td>
			<td>195.531</td>
			<td>97.765</td>
			<td>48.883</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>14.3</td>
			<td>14.3</td>
			<td>97.765</td>
			<td>48.883</td>
			<td>24.441</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>7.1</td>
			<td>28.7</td>
			<td>19.389</td>
			<td>9.695</td>
			<td>4.847</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>14.3</td>
			<td>14.3</td>
			<td>9.695</td>
			<td>4.847</td>
			<td>2.424</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>7.1</td>
			<td>28.7</td>
			<td>1.923</td>
			<td>0.961</td>
			<td>0.481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>14.3</td>
			<td>14.3</td>
			<td>0.961</td>
			<td>0.481</td>
			<td>0.24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>7.1</td>
			<td>28.7</td>
			<td>0.191</td>
			<td>0.095</td>
			<td>0.048</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>14.3</td>
			<td>14.3</td>
			<td>0.095</td>
			<td>0.048</td>
			<td>0.024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">从第 8 号稀释液中移除并弃去 7.1 μl 肽溶液。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 测试肽稀释系列的制备。
<img alt="ELISA 板示意图；聚乙烯 vs. 高结合；肽梯度稀释；比较性检测结果。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 肽结合检测的板布局图。（A）聚丙烯384孔板中肽梯度稀释的布局。每块聚丙烯板可容纳三组15种肽，用于针对单一MHC II等位基因的竞争性结合反应。（B）结合反应接近平衡后，每组肽以三复孔形式转移至另一块已预先包被抗MHC II抗体的384孔ELISA板中。
3. 准备MHC II主混合液（第1天）
<ol>
	<li>配制反应缓冲液
	<ol>
		<li>向 3,920 µl 的柠檬酸磷酸盐缓冲液中加入 80 µl 的 1 mM Pefa Bloc 和 60 µg 的辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷。（参见补充电子表格计算器以进行其他比例换算）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 15 ml 圆底离心管，用反应缓冲液将选定的 MHC II 原液稀释至 101 nM（表 2）。 
	注意：MHC II 在结合反应中的最终浓度为 50 nM，在中和 ELISA 检测中的最终浓度为 25 nM。MHC II 原液的浓度会因生产商批号不同而有所差异。（参见补充电子表格计算器）。</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II 等位基因 DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II 储存液浓度 (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II 储存液浓度 (µM)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>需加入的 MHC II 储存液体积 (µl)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>需加入的反应缓冲液体积 (µl):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II 主混合液浓度 (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. MHC II主混合液的制备。
4. 准备阴性对照和阳性对照（第1天）
<ol>
	<li>向步骤 2.1 中的 384 孔聚丙烯板的“阴性对照”孔中加入 21.5 µl 柠檬酸磷酸盐缓冲液（图 1A）。</li>
	<li>向 384 孔聚丙烯板的“阳性对照”孔中加入 21.5 µl 柠檬酸磷酸盐缓冲液。 
	注意： “阳性对照”将在下文第 5 节中完成。</li>
	<li>从步骤 3.2 中取出 49.5 µl MHC II 主混合液，并用移液器转移至一个 1.5 ml Eppendorf 管中。</li>
	<li>向步骤 4.3 中的 49.5 µl MHC II 主混合液中加入 0.5 µl 柠檬酸缓冲液。</li>
	<li>将步骤 4.4 中浓度调整后的 MHC II 主混合液 21.5 µl 加入 384 孔聚丙烯板的“阴性对照”孔中（图 1A）。 
	注意：此样品代表零信号阴性对照，含有 MHC II 蛋白、无对照肽和无待测肽。</li>
</ol>
5. 向 MHC II 预混液中加入适当对照肽段（第 1 天）
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II 等位基因 DRB1*</td>
			<td>生物素标记对照肽</td>
			<td>（残基）</td>
			<td>序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0101</td>
			<td>Flu-HA-B</td>
			<td>(306-318)</td>
			<td>Biotin-(Ahx)(Ahx)PRYVKQNTLKLAT-amide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0301</td>
			<td>肌红蛋白</td>
			<td>(137-148)</td>
			<td>Biotin-(Ahx)-(Ahx)-LFRKDIAAKYKE-OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0401</td>
			<td>YAR-B</td>
			<td>(1-14)</td>
			<td>Biotin-(Ahx)(Ahx)YARFQSQTTLKQKT-OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0701</td>
			<td>TetTox-B</td>
			<td>(830-843)</td>
			<td>Biotin-(Ahx)(Ahx)QYIKANSKFIGITE-OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1101</td>
			<td>Flu-HA-B</td>
			<td>(306-318)</td>
			<td>Biotin-(Ahx)(Ahx)PRYVKQNTLKLAT-amide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1501</td>
			<td>MBP-B </td>
			<td>(84-102)</td>
			<td>Biotin-(Ahx)(Ahx)NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*我们建议订购10 mg规格以节省成本。 
表3. 各种MHC II等位基因的对照肽段。
<ol>
	<li>将对照肽（以 DMSO 保存于 400 µM 浓度）用新鲜 DMSO 按 1:20 比例稀释，得到 20 µM 的稀释储备液。
	<ol>
		<li>取 25 µl 400 µM 对照肽加入 475 µl DMSO 中。注意：此比例为大量过量，但有助于准确操作黏稠的 DMSO 溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将第 5.1 步中稀释后的对照肽（20 µM）进一步按 1:100 比例加入第 3.2 步制备的 MHC II 主混合液中。
	<ol>
		<li>取 28.8 µl 第 5.2 步稀释后的对照肽加入剩余的 2,850.5 µl MHC II 主混合液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取 21.5 µl 含对照肽的 MHC II 主混合液（第 5.2 步）加入 384 孔聚丙烯板的阳性对照孔中（第 4.2 步）（图 1A）。注意：该样品为高信号阳性对照，包含 MHC II 蛋白、对照肽，但不含待测肽。</li>
</ol>
6. 制备结合反应体系（第1天）
<ol>
	<li>按1:1比例将含有对照肽的MHC II主混合液（步骤5.2）加入各测试肽稀释液（步骤2.1）中，以建立结合反应。
	<ol>
		<li>使用液体处理机器人，将步骤5.2中含对照肽的MHC II主混合液21.5 µl加入至步骤2.1中每种测试肽稀释液21.5 µl中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用聚酯膜密封结合反应体系，并在37 °C、无CO2控制的培养箱中孵育12–24小时，期间不振荡。</li>
</ol>
7. 中和并转移结合反应（第2天）
<ol>
	<li>从37 °C培养箱中取出含有结合反应液的384孔聚丙烯板（步骤6.2）。</li>
	<li>用中和缓冲液将结合反应液按1:1比例稀释。（液体处理机器人）
	<ol>
		<li>向每个结合反应孔中加入43 µl中和缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从4 °C取出ELISA板（步骤1.3），用每孔60 ml的PBS-0.05%吐温20溶液洗涤3次。（洗板机）</li>
	<li>将步骤7.2中每个中和后的结合反应液各25 μl转移至步骤7.3中已包被抗体的384孔ELISA板的三个复孔中。（图1）（液体处理机器人）</li>
	<li>用聚酯膜覆盖ELISA板，置于37 °C培养箱中孵育2.5小时，或置于4 °C冰箱中过夜。</li>
</ol>
8. ELISA 检测的建立（第2天或第3天）
<ol>
	<li>从第 7.5 步中取出 ELISA 板，用 60 µl/孔的 PBS-0.05% Tween 洗涤 3 次。（使用板式洗涤仪）</li>
	<li>将链霉亲和素-铕储备液（0.1 mg/ml 链霉亲和素，每链霉亲和素结合 7 个 Eu3+）用 DELFIA 检测缓冲液稀释 1,000 倍。
	<ol>
		<li>对于一块 384 孔板，将 10 µl 链霉亲和素-铕加入 10 ml 检测缓冲液中进行稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向第 8.1 步的 384 孔 ELISA 板每孔中加入 25 µl 稀释后的链霉亲和素-铕溶液。（使用液体处理机器人）</li>
	<li>用聚酯膜覆盖板孔，置于室温避光环境中孵育 1 小时。注意：在 1 小时孵育期间，从冰箱中取出增强溶液，并在避光条件下于室温放置 10 ml/板备用。</li>
	<li>完成 1 小时孵育后，用 60 µl/孔的 PBS-0.05% Tween 对第 8.3 步的 384 孔 ELISA 板洗涤 3 次。（使用板式洗涤仪）</li>
	<li>向第 8.5 步的 384 孔 ELISA 板每孔中加入 25 µl 增强溶液。（使用液体处理机器人）</li>
	<li>用聚酯膜覆盖 384 孔 ELISA 板，置于室温避光环境中静置 10–15 分钟。</li>
	<li>完成 10–15 分钟孵育后，使用时间分辨荧光酶标仪（设置为铕检测模式，例如：起始时间：200，终止时间：1,000，激发波长：340，发射波长：615，截止波长：无，PMT：自动，每孔读数次数：50）读取第 8.7 步 384 孔 ELISA 板的荧光信号。</li>
</ol>
9. 数据分析
<ol>
	<li>以 XY 格式图表输入数据，将 3 次重复值置于并列的列中（X = 测试肽浓度；Y = 荧光测量值）。</li>
	<li>对所有数据的 X 值进行对数转换：X = log(X)。</li>
	<li>使用单一位点竞争性结合模型拟合对数转换后的数据，以提取 IC50 值。</li>
	<li>将底部值约束为阴性对照的平均值。</li>
	<li>对顶部值进行全局拟合，并确保全局拟合参数低于或等于阳性对照值。</li>
</ol>

<ol><li>Steere, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-refractory+Lyme+arthritis+is+associated+with+HLA-DR+molecules+that+bind+a+Borrelia+burgdorferi+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide.</a> J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).</li>
<li>Raddrizzani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+peptide+interaction+enable+HLA-DQ+and+HLA-DR+molecules+to+bind+diverse+peptide+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires.</a> J. Immunol. 159, 703-711 (1997).</li>
<li>Osipovitch, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+immune-evading+enzymes+for+ADEPT+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng.+Design%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy.</a> Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).</li>
<li>Moise, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico-accelerated+identification+of+conserved+and+immunogenic+variola%2Fvaccinia+T-cell+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes.</a> Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).</li>
<li>Moise, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+HLA+DR+epitope+de-immunization+of+Factor+VIII+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo.</a> Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).</li>
<li>Aggarwal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+fueling+the+biotech+engine-2011+to+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">What's fueling the biotech engine-2011 to 2012.</a> Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).</li>
<li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).</li>
<li>Warmerdam, P. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+a+human+T-cell+region+in+staphylokinase+by+T-cell+screening+and+computer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling.</a> Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).</li>
<li>Jones, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+removal+of+a+promiscuous+CD4%2BT+cell+epitope+from+the+C1+domain+of+factor+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thrombosis+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII.</a> J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).</li>
<li>Harding, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beta-lactamase+with+reduced+immunogenicity+for+the+targeted+delivery+of+chemotherapeutics+using+antibody-directed+enzyme+prodrug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy.</a> Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).</li>
<li>Mazor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+elimination+of+an+immunodominant+T-cell+epitope+in+recombinant+immunotoxins+based+on+Pseudomonas+exotoxin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).</li>
<li>Cantor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+enzyme+deimmunization+by+combinatorial+T-cell+epitope+removal+using+neutral+drift%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).</li>
<li>Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Ag-specific+immune+responses%3A+understanding+immunopathogenesis+and+improving+diagnostics+in+infectious+disease%2C+autoimmunity+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer.</a> Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).</li>
<li>Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+T+epitope+mapping+and+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High throughput T epitope mapping and vaccine development.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720(2010).</li>
<li>Hoffmeister, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+T+cell+epitopes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping T cell epitopes by flow cytometry.</a> Methods. 29, 270-281 (2003).</li>
<li>Singh, H., Raghava, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProPred%3A+prediction+of+HLA-DR+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ProPred: prediction of HLA-DR binding sites.</a> Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).</li>
<li>Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHCPred%3A+bringing+a+quantitative+dimension+to+the+online+prediction+of+MHC+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding.</a> Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).</li>
<li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SVRMHC+prediction+server+for+MHC-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides.</a> BMC Bioinformatics. 7, 463(2006).</li>
<li>Bui, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+generation+and+evaluation+of+specific+MHC+binding+predictive+tools%3A+ARB+matrix+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications.</a> Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).</li>
<li>Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+MHC+class+II+binding+affinity+using+SMM-align%2C+a+novel+stabilization+matrix+alignment+method%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method.</a> BMC Bioinformatics. 8, 238(2007).</li>
<li>Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NetMHCIIpan-2.0+-+Improved+pan-specific+HLA-DR+predictions+using+a+novel+concurrent+alignment+and+weight+optimization+training+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Immun.+Res%22%5BJournal%5D)">NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure.</a> Immun. Res. 6, 9(2010).</li>
<li>De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De-immunization+of+therapeutic+proteins+by+T-cell+epitope+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification.</a> Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).</li>
<li>Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+redesign+of+proteins+for+minimal+T-cell+epitope+content%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content.</a> J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).</li>
<li>Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+deimmunization+of+therapeutic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins.</a> J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).</li>
<li>Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+therapeutic+proteins+to+delete+T-cell+epitopes+while+maintaining+beneficial+residue+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bioinform.+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions.</a> J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).</li>
<li>Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+algorithms+for+functional+deimmunization+of+therapeutic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins.</a> BMC Bioinformatics. 11, 180(2010).</li>
<li>De Groot, A. S., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+risk%2C+improving+outcomes%3A+Bioengineering+less+immunogenic+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics.</a> Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+assessment+of+MHC+class+II+peptide+binding+predictions+and+evaluation+of+a+consensus+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000048(2008).</li>
<li>Sette, A., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+vaccinology%3A+developing+vaccines+in+the+era+of+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics.</a> Immunity. 33, 530-541 (2010).</li>
<li>Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+power+of+genomics+and+immunoinformatics+to+produce+improved+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines.</a> Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).</li>
<li>Sturniolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tissue-specific+and+promiscuous+HLA+ligand+databases+using+DNA+microarrays+and+virtual+HLA+class+II+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices.</a> Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologic+drugs+set+to+top+2012+sales%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Biologic drugs set to top 2012 sales.</a> Nat. Med. 18, 636(2012).</li>
<li>Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+vaccines+in+the+era+of+genomics%3A+a+decade+of+reverse+vaccinology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology.</a> Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).</li>
<li>Jiang, W., Boder, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+engineering+and+analysis+of+peptide+binding+to+class+II+MHC%5BTitle%5D)+AND+%22+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).</li>
<li>Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -L. B., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+recombinant+MHC+class+II+molecules+and+high-throughput+peptide-binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Immun%22%5BJournal%5D)">Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays.</a> Immun. 5, 1-20 (2009).</li>
</ol>

Leonard Moise 任职于位于罗德岛州普罗维登斯的私营生物技术公司 EpiVax, Inc.，并持有该公司股票期权。本研究报告所包含的工作不受该公司商业目标可能带来的任何偏见影响。

生物治疗药物已成为现代医学的基石，2012年销售额最高的五种药物中有四种属于此类32。生物制药行业已持续增长多年6，新型药物的不断开发以及生物类似药的出现进一步拓展了生物制药的研发管线。展望未来，评估并降低蛋白质治疗药物的免疫原性将成为早期生物治疗药物研发中不可或缺的环节。为促进这一过程，生物技术研究人员可利用表位预测的计算方法16-22，以及旨在降低免疫原性同时保持功能的整合性蛋白质设计算法3,23-26。同样，疫苗的设计与开发也可借助预测算法的强大能力4，而反向疫苗学的持续成熟有望为以往难以攻克的多种传染病病原体提供有效的保护性疫苗33。尽管这些计算工具具备显著加速药物和疫苗研发进程的潜力，但in silico预测的结果仍需进一步筛选，以确定数量可控且性能最优的候选分子。近年来，定量肽-MHC II分析技术的进展包括工程化酵母细胞表面展示系统34和基于微珠的发光氧通道免疫分析法35，但in vitro ELISA类检测仍是量...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.
Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
to:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 &#181;g of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
Step 5.2&#160;in the Protocol was updated from:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
to:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 &#181;M) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
Table 2 was updated from:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mM)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (ml)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (ml):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (&#956;M)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (&#956;l)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (&#956;l):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.

Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

蛋白质是增长最快的治疗剂类别6，生物治疗药物研发管线的快速扩展使得人们对蛋白质药物在开发和使用过程中所面临的挑战日益关注。其中一个独特的考量因素在于，在健康且功能正常的免疫系统中，所有细胞外蛋白质都会被抗原呈递细胞（APCs）摄取。一旦被APCs内化，蛋白质将被切割成小肽片段，潜在的免疫原性片段会被装载到II型主要组织相容性复合物蛋白（MHC II）的结合槽中。肽-MHC II复合物随后呈现在APC表面，真正的免疫原性肽段（称为T细胞表位）会与相应的CD4+ T细胞表面受体形成MHC II-肽-T细胞受体三元复合物7这一关键的分子识别事件会启动复杂的信号级联反应，导致T细胞活化、细胞因子释放、CD4+ T细胞介导的B细胞成熟，最终产生可结合并清除致病性外源蛋白的循环IgG抗体。因此，可通过鉴定免疫原性蛋白中的T细胞表位，并突变参与MHC II类分子复合物形成的关键残基，实现蛋白的去免疫化。然而需要注意的是，T细胞表位数量较多且在免疫原性蛋白中分布广泛，大多数表位删除突变可能导致蛋白功能或稳定性的意外丧失。因此，设计去免疫化的生物治疗药物是一项复杂且技术上具有挑战性的目标，但目前已有一些成功删除T细胞表位的案例。3,5,8-12. 与基于嫁接的 &#34;人源化&#34;，尽管目前主要局限于抗体治疗领域，表位删除策略原则上可应用于任何蛋白质靶标，无论其序列、结构、功能如何，也不受同源人源支架是否可得的限制。实施该方法的第一步是鉴定嵌入在靶蛋白序列中的关键肽段表位。
利用合成肽和重组人MHC II分子进行高通量生化检测，可快速初步揭示表位鉴定与免疫原性降低的相关信息1,3-5。这类ELISA型检测可作为其他蛋白质/疫苗设计与开发工具的有力补充。例如，一种已被广泛采用的表位定位实验方法依赖于耗时、耗力且资源密集的ex vivo细胞增殖实验15。简而言之，首先将目标蛋白的一级序列划分为一组重叠肽段，通常为15个氨基酸长度的肽，相邻肽段之间有12个氨基酸的重叠。这些肽段通过化学合成制备，并在多种免疫检测中利用从人类供体分离的外周血单个核细胞（PBMC）测试每条肽段的免疫原性13,14。为了提高结果的可靠性，通常需使用来自50名或更多不同供体的PBMC对肽段进行重复测试。在以去免疫化为最终目标的情况下，工作量进一步增加：需要额外合成多组突变肽段，并在将任何去免疫化突变引入全长蛋白进行后续功能分析之前，先在PBMC检测中测试这些新肽段面板10。尽管这些细胞检测仍是评估人类患者免疫原性潜力的金标准，但通过快速、高通量的MHC II-肽结合检测预先筛选潜在的免疫原性表位，有望显著提高此类全面策略的效率。
同样，生化肽-MHC II 结合实验可与预测性 in silico 方法相结合，从而极大地加速表位鉴定过程。目前存在多种用于 T 细胞表位预测的计算工具，例如 ProPred16、MHCPred17、SVRMHC18、ARB19、SMM-align20、NetMHCIIpan21，以及 EpiVax 公司的专有工具 EpiMatrix22。此外，近年来表位预测工具已与其他生物信息学和分子建模工具相结合，开发出集成化的蛋白质去免疫化算法，旨在降低去免疫化突变可能破坏蛋白质结构和功能的风险23-26。尽管已有多种表位预测工具被证明具有较高的准确性27,28，但计算结果 invariably 需要通过实验验证。快速、高通量且成本效益高的实验方法最适合作为 in silico 表位预测的初步筛选手段。
类似地，表位预测工具可推动反向疫苗学中的抗原筛选29,30。例如，生物信息学的进步已实现全基因组筛选，能够快速识别出以完整蛋白质或从病原体蛋白质组中提取的肽段表位形式存在的疫苗候选物。尽管这一关键技术正在重塑保护性疫苗的发现与开发过程，但它也带来了一个新的挑战，即产生数量庞大且难以处理的免疫原性疫苗候选物列表。高通量肽段-MHC II 结合实验可通过量化肽段与多种 MHC II 等位基因之间的结合亲和力和结合广度，指导表位的选择。与蛋白质去免疫化类似，此类实验方法最终仍是验证计算预测出的有前景疫苗候选物所必需的。
本文介绍了一种适用于384孔板格式的肽段-MHC II类分子结合实验方法。该方案具有高度并行性，与先前报道的96孔板格式相比，可将试剂成本降低75%1,3-5。使用一台液体处理机器人，一名研究人员可在不到48小时内，针对四种MHC II类等位基因类型，以八个浓度梯度对约九十种待测肽段进行三复孔分析。本文详细描述了针对一种MHC II类等位基因分析七种实验肽段的单个384孔ELISA板的建立过程，同时提供了电子表格计算器作为补充材料，以便轻松将实验规模扩展至任意数量的目标肽段和/或MHC II类分子。

<table><tbody><tr><td>十水合四硼酸钠</td><td>Sigma</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma</td><td>C1901</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>OmniPur</td><td>9310</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>100% DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>辛基-&amp;beta;-D-吡喃葡萄糖苷</td><td>Fischer</td><td>29836-26-8</td><td></td></tr><tr><td>Pefa Bloc SCF</td><td>Roche</td><td>1158591600</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 10x 磷酸盐缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>14200-166</td><td></td></tr><tr><td>DELFIA 检测缓冲液</td><td>Perkin Elmer</td><td>4002-0010</td><td></td></tr><tr><td>DELFIA 增强缓冲液</td><td>Perkin Elmer</td><td>4001-0010</td><td></td></tr><tr><td>铕标记链霉亲和素</td><td>Perkin Elmer</td><td>1244-360</td><td></td></tr><tr><td>L243 抗 HLA-DR 抗体</td><td>Biolegend</td><td>307602</td><td></td></tr><tr><td>生物素化示踪肽</td><td>21st Century Biochemicals</td><td>定制订单</td><td></td></tr><tr><td>测试肽（1-4 mg，85% 纯度）</td><td>Genscript</td><td>定制订单</td><td></td></tr><tr><td>纯化的 HLA-DRB1 单体（非生物素化）</td><td>Benaroya Research Institute*</td><td>定制订单</td><td></td></tr><tr><td>384 孔白色 EIA/RIA 板</td><td>Thermo</td><td>460372</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯 384 孔板</td><td>Costar</td><td>3656</td><td></td></tr><tr><td>封膜，AxySeal，80 &amp;micro;m，ELISA 涂布器&amp;nbsp;</td><td>Axygen Ascientific</td><td>PCR-SP</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ 水</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Epimotion 液体处理仪（或类似设备）</td><td>Eppendorf</td><td>5075</td><td></td></tr><tr><td>Select TS 板式洗板机（或类似设备）</td><td>BioTek</td><td>405</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini 微孔板读板仪（或类似设备）</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*重组人 MHC II 类分子可从 Benaroya 四聚体核心实验室获取。&amp;nbsp; 参见：https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory</td></tr></tbody></table>

一种用于多肽表位定量分析的高通量mhc ii类分子结合检测方法

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

使用重组人 MHC II 分子进行的生化检测可快速、定量地提供有关免疫原性表位鉴定、删除或设计的见解1,2。本文将肽-MHC II 结合检测方法优化至 384 孔板格式。该简化后的实验方案可将试剂成本降低 75%，且通量高于此前报道的 96 孔板方法1,3-5。具体而言，该实验设计允许在单个 384 孔 ELISA 板上，对每种 MHC II 等位基因同时稳健、可重复地分析多达 15 种肽段。通过使用一台液体处理机器人，单名研究人员可在不到 48 小时内，针对八种浓度梯度和四种 MHC II 等位基因类型，对约 90 种待测肽段进行三复孔分析。从事蛋白质去免疫化或疫苗设计与开发领域的研究人员可能会发现该方案有助于推进自身工作。特别是，JoVE 提供的分步操作说明和可视化展示形式，可帮助其他用户在其各自实验室中快速、便捷地建立该技术方法。

阴沟肠杆菌 P99 β-内酰胺酶（BLA）（Genbank ID# X07274.1）的成熟肽序列通过 ProPred16 分析，预测其与 MHC II 等位基因 DRB1*1501 结合的潜在肽段（表4）。ProPred 鉴定出 117 个九肽，均含有必需的 P1 锚定残基（即 第1位为 M、L、I、V、F、Y 或 W，这是 MHC II 结合所必需的31）。在 5% 阈值下，仅得分大于或等于 2.6 的肽段才可能是结合物。因此，在 5% 阈值下，仅预测前 11 个肽段可结合 MHC II DRB1*1501。
<img alt="多肽序列排序图；预测结合/非结合、得分、起始位置、阈值分析。" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51308/51308table4highres.jpg" width="500" data-altupdat...

使用重组人MHC II分子进行生化检测，可快速、定量地获得有关免疫原性表位鉴定、去除或设计的信息。&#160;本文描述了一种适用于384孔板的肽-MHC II结合检测方法。这种成本效益高的检测格式在蛋白质去免疫化以及疫苗设计与开发领域中具有重要应用价值。

一种用于多肽表位定量分析的高通量MHC II类分子结合检测方法

利用重组人MHC II分子进行的生化检测可快速、定量地揭示免疫原性表位的鉴定、删除或……

本实验的总体目标是利用高通量384孔板检测方法，定量分析短肽与人类MHC II类免疫蛋白的结合能力。首先，对目标肽段进行溶液相竞争性结合实验；第二步，利用固定在高结合力ELISA板上的抗MHC II类抗体捕获已达到平衡的肽-MHC II类复合物。接下来，将捕获的复合物与标记了链霉亲和素的鸦片类物质孵育，然后洗去未结合的链霉亲和素，并激活被捕获的鸦片类物质。最终，可通过时间分辨荧光测定法来定量检测被捕获的MHC II类对照肽的水平。该方法可为目标蛋白的免疫原性潜力提供初步见解。它特别适用于验证计算机预测的结果。首先，在一个384孔高结合白色ELISA板的每个孔中加入25微升 freshly diluted L243抗体溶液，用聚酯薄膜密封板子，并在4°C下孵育过夜。然后从每种测试物质10毫摩尔的储备液开始。使用3个84孔聚丙烯板，以柠檬酸磷酸盐缓冲液配制肽和DMSO的以下系列稀释液。注意，完整的3个84孔聚丙烯板需要三个独立的EIA板，如图所示。接下来，用15毫升锥形管将选定的MHC II储存液用反应缓冲液稀释至101纳摩尔浓度。然后将对照肽从20 µM稀释至1:100的比例，加入新配制的MHC II主混合液中，并取21.5 µL含有对照肽的MHC II主混合液加入阳性对照孔中。将含有对照肽的MHC II主混合液以1:1的比例加入至3个96孔聚丙烯板的各个测试肽稀释液中，同时建立结合反应。最后，用聚酯膜密封反应体系，并将反应板置于37 °C、无二氧化碳控制的培养箱中孵育12至24小时，期间不进行振荡。第二天，用中和缓冲液以1:1的比例稀释384孔板中的结合反应孔。然后用每孔60微升的含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤ELISA板3次，每次间隔20秒。随后，将384孔板中每种中和后的结合反应溶液各25微升，以三复孔形式转移至包被抗体的384孔板中。将酶联免疫吸附实验板（ELIZA板）置于聚酯薄膜覆盖下，在4°C条件下孵育过夜。孵育结束后，按前述方法洗涤ELIZA板三次，然后向每孔加入25 µL新鲜稀释的链霉亲和素-生物素复合物。将板再次用聚酯薄膜覆盖，在室温避光条件下孵育一小时。孵育期间，将每块板所需的10毫升增强液在避光条件下于室温平衡1小时。按照演示方法洗涤ELIZA板，然后向每个孔中加入25微升增强液，用聚酯膜覆盖板后，在避光条件下孵育10至15分钟。最后使用时间分辨荧光酶标仪在设定的opium参数下读取荧光信号。在此代表性实验中，分析了肠杆菌Cloe P九九β-内酰胺酶的成熟肽序列，以筛选可能与MHC II类等位基因结合的肽段结合物。在5%阈值下，仅鉴定出117种DRB*15:01非肽类物质，其在第1位具有必需的P1锚定残基，该残基为MHC II类分子结合所必需。评分大于或等于2.6的肽段可能为结合物。因此，在5%阈值下，仅预测前11种肽段可结合MHC II类分子DRB*15:01。选择了一组具有代表性的预测表位，用于本MHC II类分子结合实验的分析。这些15个残基的β-内酰胺酶肽片段通过化学方法合成，使得假定的九肽MHC II类表位嵌入其合成的蛋白质片段中。随后按照前述方法，分析这些合成肽段与生物素标记的髓鞘碱性蛋白B对照肽竞争结合MHC II类分子DRB1*15:01的能力。合成肽的竞争性结合曲线如图所示。IC50值通过使用Prism软件中单一位点竞争性结合非线性拟合函数对对数转换数据进行拟合计算得到。如图表所示，这些肽自然分为三组：强结合肽（IC50小于1微摩尔）、中等结合肽（IC50大于或等于1微摩尔但小于100微摩尔）以及弱结合肽（IC50大于或等于100微摩尔）。在完成其开发后。该技术为分子免疫学和生物治疗设计领域的研究人员深入探索人类患者抗蛋白免疫反应背后的关键分子识别事件奠定了基础。

a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

高通量MHC II类分子结合分析抗原表位肽的定量分析

本方案描述了使用多肽:MHC 四聚体和磁性微珠分离低频表位特异性T细胞群体，并通过流式细胞术对其进行分析的方法。该方法可实现对内源性特定T细胞群体的直接研究 在体...

基于肽段-MHC四聚体的表位特异性T细胞富集

本视频展示了一种应用多肽微阵列技术来分析识别组蛋白多肽上翻译后修饰（PTM）的抗体特异性的方法。将含有已知PTM组合的固定化荧光染料标记组蛋白多肽的微阵列芯片与靶向PTM特异性抗体孵育。该过程有助于确定抗体对靶标PTM的特异性及其与非靶标PTM之间潜在的交叉反应性。...

一种用于抗体特异性分析的多肽微阵列技术

本文描述了如何开展基于（单分子）荧光共振能量转移（FRET）的检测方法，用于测量T细胞抗原受体（TCR）与负载抗原肽的主要组织相容性复合物（MHC）分子之间的结合动力学过程，该过程发生在T细胞与功能化的平面支撑脂双层接触时所形成的免疫突触内。...

测量TCR-pMHC结合 原位 使用基于FRET的显微镜检测法

本文介绍了我们在实验室中常用的方法，用于研究T细胞受体与人类白细胞抗原呈递的肿瘤抗原之间的相互作用特性如何调控T细胞功能；这些方法包括蛋白质表达与纯化、X射线晶体学、生物物理学分析以及功能性T细胞实验。...

利用X射线晶体学、生物物理学与功能检测确定T细胞受体识别肿瘤抗原的调控机制

本文介绍了一种色谱分析方法，该方法结合了肽段前体的离子淌度分离，随后对肽段碎片进行高分辨率（约30,000）质谱检测，用于定量单克隆抗体酶解产物中添加的肽段标准品。...

一种基于液相色谱离子淌度QTOF质谱的HS-MRM方法用于蛋白质类生物制药中宿主细胞蛋白的定量分析

在此，作者介绍了一种利用纯化的单克隆抗体，通过点印迹杂交结合肽段扫描来确定线性抗原表位的简单且高效的方法。所鉴定出的表位可进一步用于治疗和诊断应用。...

借助肽扫描技术鉴定单克隆抗体识别的线性B细胞表位

生物淘选细菌展示文库是发现肽类亲和试剂的一种成熟技术，可作为抗体的可靠替代方法。本文所述的半自动化分选方法简化了生物淘选流程，降低了假阳性结果的出现频率。本文将阐述在候选分子评估及减少下游分析工作量方面所采用的思路与技术。...

用于肽亲和试剂发现及分离株分析的细菌展示文库半自动生物筛选

Qa-1（人类中的 HLA-E）属于非经典主要组织相容性复合体 1b 分子家族。研究表明，使用 Qa-1 结合表位进行免疫可增强组织特异性免疫调节，并改善多种自身免疫性疾病。本文介绍一种重叠肽库策略，用于鉴定蛋白质中的 Qa-1...

重叠肽文库用于绘制蛋白质中Qa-1表位

本文介绍了一种用于体外定性检测抗原特异性CD8+...

通过MHC I类四聚体染色法在病毒载体疫苗接种后同时定量抗载体和抗转基因特异性CD8+ T细胞

基于乙型肝炎病毒（HBV）衍生的肽阵列，可同时评估HBV特异性的CD4 T细胞应答并鉴定HBV特异性的CD4...

基于肽段矩阵的乙型肝炎病毒特异性CD4 T细胞应答分析及HLA-DR限制性CD4 T细胞表位鉴定

本文介绍了一种从小鼠和人类细胞系中纯化MHC...

免疫肽组学：小鼠和人类MHC I类和II类相关肽段的分离及其质谱分析

学习高通量肽-MHC II结合分析方法，使用384孔板和时间分辨荧光技术定量检测短肽与人MHC II蛋白的结合亲和力。该方法可加速免疫原性表位鉴定，为疫苗开发和蛋白质去免疫化研究提供快速、经济的技术支持。

一种用于多肽表位定量分析的高通量MHC II类分子结合检测方法

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