高通量MHC II类分子结合分析抗原表位肽的定量分析

该程序的总体目标是使用高通量 3 84 孔板测定法定量短肽与人 MHC 两种免疫蛋白的结合。这是通过首先对目标肽进行液相竞争结合测定来实现的。在第二步中，用固定在高结合力 ELIZA 板上的抗 MHC 2 抗体捕获平衡肽 MHC two 复合物。

接下来，将捕获的复合物与鸦片标记的链霉亲和素一起孵育，然后洗去未结合的链霉亲和素并激活捕获的鸦片。最终，时间分辨荧光法可用于量化 MHC 两种捕获的对照肽的水平。该方法可初步了解靶蛋白的免疫原性潜力。

它对于验证计算机预测变量的输出特别有用，通过将 25 μL 新鲜稀释的 L 2 43 抗体溶液添加到 3 84 的每个孔中来开始该程序。高结合力白色 ELIZA 板用聚酯薄膜密封板，并在 4 摄氏度下孵育过夜。然后从每个测试的 10 毫摩尔原液开始。

肽和 DMSO 制备以下稀释系列，并使用 3 84 孔聚丙烯板制备柠檬酸盐磷酸盐缓冲液。请注意，如图所示，一个完整的 3 84 孔聚丙烯板需要三个单独的 EIA 板。接下来，使用 15 mL 锥形管在反应缓冲液中将选定的 MHC 两种储备液稀释至 101 纳摩尔浓度。

然后在新鲜制备的 MHC two 预混液中将对照肽从 20 微摩尔稀释至 1：100 的比例，并将 21.5 微升 MHC 二预混液与对照肽添加到阳性对照中。在 3 84 孔聚丙烯板的孔中，以一比一的比例将含有对照肽的 MHC 二预混液添加到每个测试肽稀释液中，以此时也产生结合反应。最后，用聚酯薄膜密封结合反应物，并将板在 37 摄氏度的非二氧化碳受控培养箱中孵育 12 至 24 小时，不要摇晃。

第二天，稀释 3 84 中的结合反应孔。孔板与中和缓冲液以 1：1 的比例进行。然后用每孔 60 微升 PBS 0.05% 洗涤 Eliza 板 3 次，在 20 次下一次转移之间，从 3 84 孔板中加入 25 微升每种中和结合反应溶液，一式三份到抗体包被 3 84 中。

然后，将 Eliza 板在孵育后在 4 摄氏度下孵育覆盖在聚酯薄膜中的 ELIZA 板过夜。如前所述，将 ELIZA 板清洗 3 次，然后向每个板中加入 25 微升新鲜稀释的链球菌丁鸦片。将覆盖有聚酯薄膜的板在室温下避光孵育 1 小时。

在孵育过程中，将每板 10 毫升增强溶液也置于室温下，一小时后也要在黑暗中，如图所示洗涤 ELIZA 板，然后向每个孔中加入 25 微升增强溶液，并将覆盖有聚酯薄膜的板在黑暗中孵育 10 至 15 分钟。最后，使用具有 opium 设置的时间分辨荧光酶标仪读取荧光。在这个代表性实验中，分析了肠杆菌 Cloe P 9 9 β-内酰胺酶的成熟肽序列，以寻找 MHC 两个等位基因的推定肽结合剂。

DRB 1、15 oh、1、117 non 或 peptides 在位置 1 处鉴定出强制性 P 1 锚残基，这是 MHC 所需的 2 个，仅在 5% 阈值下结合。分数大于或等于 2.6 的肽可能是结合剂。因此，在 5% 阈值下，预测只有前 11 个肽能结合 MHC 2 DRB 1 15 0 1。

选择一组具有代表性的预测表位进行 MHC 双结合测定分析。这 15 个残基的 β-内酰胺酶肽片段经过化学合成，使得推定的九聚体 MHC 两个表位嵌入其合成蛋白质片段中。然后分析这些合成肽与生物素化髓鞘碱性蛋白 B 对照肽竞争结合 MHC 2 DRB 1 15 0 1 的能力，就像刚刚证明的那样。

合成肽的竞争性结合曲线如图所示。通过使用 prism 的单位点竞争结合非线性拟合函数拟合对数变换数据来计算 IC 50 值。如表中所示，肽自然分为三组，强结合剂的 IC 50 小于 1 微摩尔 中等结合剂 IC 50 大于或等于 1 微摩尔，但小于 100 微摩尔的弱结合剂 IC 50 大于或等于 100 微摩尔 后显影。

这项技术为分子免疫学和生物治疗设计领域的研究人员铺平了道路，以更全面地探索人类患者抗蛋白免疫反应的关键分子识别事件。