鼠阀门内皮细胞的分离

该程序的总体目标是使用内皮报告基因从胚胎和成年小鼠中分离富集的心脏瓣膜、内皮细胞群体。首先通过仔细解剖包含所有二尖瓣、三尖瓣、主动脉和肺动脉心脏瓣膜瓣叶的心室管区域来完成。该程序的第二步是通过对组织进行一系列酶处理来解离瓣膜组织并释放单个细胞。

这个过程重复九次。然后，含有细胞和碎片的溶液通过过滤器，以确保单细胞悬液没有细胞碎片。最后一步是使用荧光激活细胞分选对解离的细胞进行分选和收集。

最终，足够大的富集瓣膜内皮细胞群可用于体外培养和分子分析。在这种方法中，我们将展示如何从小鼠中分离心脏瓣膜内皮细胞。由于生物分子工具已在小鼠模型中得到广泛建立。

这允许将一组扩展的实验设计用于心脏瓣膜研究。此外，在胚胎中分离心脏瓣膜内皮细胞可以进行以前不可行的发育研究。让我们开始吧。

确保在器械托盘上高压灭菌手术工具，使其完全消毒。手术部位应用 70% 乙醇喷洒消毒。这包括显微镜和现场可能接触的任何其他设备。

以下溶液都必须在实验前立即制备。解离缓冲液、分选缓冲液，如果培养，则为 VEC 培养物、培养基和 GFP 阴性培养基。这些溶液中的每一种都必须用 0.2 微米的过滤器进行消毒，之后必须将溶液保存在冰上，直到它们在二氧化碳后使用。

小鼠窒息，然后是颈椎脱位。使用解剖剪刀打开胸腔。这里的小鼠是 tie 2 GFP 的纯合子，或者是事实排序所需的年龄匹配的阴性对照。

接下来，暴露心脏和肺。然后用镊子夹住心脏的大动脉，将其从身体上拉出。部分浸入心脏。

在培养皿中的冷 HBSS 培养皿中，通过去除附着的肺组织来准备心脏进行解剖，消除可能污染样品的非瓣膜内皮细胞至关重要。要首先获得心房心室管环，轻轻地将心房从心脏中拉出，以去除心房。接下来，用剃须刀片切掉心室，在 AV 瓣膜正下方切开，主动脉区域应保持完整。

接下来，在根管的一侧切开一个切口，打开环，用镊子露出心房室瓣膜结构。轻轻梳理心肌以露出瓣叶。它们是心肌上致密的白色组织。

现在，如果 cordi tendai 仍然连接，请轻轻地将其从心房室瓣膜上拆下。并在此过程中去除不包含半月瓣结构的肺动脉和主动脉壁的近端区域。在不损坏瓣叶的情况下尽可能多地去除剩余的心肌，因为 ECS 可能会脱落。

仔细解剖对于去除可能污染样本的非瓣膜内皮细胞至关重要。因此，尝试尽可能多地去除周围组织，同时保持所有四个瓣膜完好无损。最后，将修剪过的心脏瓣膜区域放入装有 1 毫升冷 HBSS 的 1.5 毫升试管中，并将试管保持在冰上。

使用该技术用移液管从成年或 E 14.5 动物中制备分离的瓣膜组织。从装有组织的试管中取出 HBSS。然后加回 1 毫升解离缓冲液和 4 微升 DNAS 1。

将组织在解离缓冲液和 DN 中在 37 摄氏度下轻轻旋转孵育 7 分钟。7 分钟后，上下移液组织 3 次，以帮助解离细胞。静置约 15 秒后，收集含有解离细胞的上清液。

将细胞转移到 15 mL 锥形管中。在 15 mL 锥形瓶中结束胶原酶反应，添加马血清。这是第一个收集分数。

现在返回沉淀组织的试管，添加回解离缓冲液和 DNAS 1。重复该过程以收集第二个馏分。继续重复该过程，直到总共收集到九个细胞悬液。

现在，将所有分级收集物通过 70 微米尼龙过滤器进入单管中，以获得无碎屑的细胞悬浮液。将试管在 400 GS 下旋转 5 分钟，将细胞收集成沉淀。然后将沉淀重悬于一毫升分选缓冲液中，并保持在冰上，直到可以通过传真进行分析，这在文本中有所涉及。

协议细胞培养和染色也包含在来自并列两个 GFP 转基因的文本协议组织切片中。从成人中收集小鼠，在成人中收集 E 14.5 胚胎。用内皮标志物 CD 31 鉴定瓣膜内皮细胞，发现共分泌 GFP。

从 E 14.5 胚胎中分离出相同的细胞。此外，共表达 CD 31 和 GFP 传真分析从成体和 E 14.5 胚胎制备的细胞中鉴定出 GFP 阳性和阴性细胞群。野生型 C 57 黑色 6.

成体细胞用于设置 GFP 参数，通过 GFP 阳性细胞群中的 GFP 阴性细胞群中的基因表达通过定量 PCR 比较 GFP 阳性细胞中的基因表达。内皮标志物高，肌细胞标志物极低。在 GFP 阴性细胞中。

瓣膜间质细胞标志物高。两周后分别培养两个细胞群。GFP 阳性细胞呈现周围形态并表达 CD 31。

相比之下，GFP 阴性细胞在 9 天后呈现出间充质样形态。这些细胞在发育后还表达 VIC 标志物 alpha SMA。这项技术为心脏瓣膜生物学领域的研究人员铺平了道路，使他们能够在小鼠模型中探索发育和疾病的机制，然后将其转化为人类群体。