通过荧光 原位 杂交、凝集素染色和成像可视化肠道微生物群与宿主的相互作用

这种简化的实验方案详细介绍了检测和成像复杂组织样品中细菌的工作流程，从固定组织到用荧光 原位 杂交染色微生物。

与宿主相关的微生物构成了这个非常复杂的生态系统，确实需要成像才能被理解。通过这个粒子，我们将向您展示如何完成染色过程 并实现宿主微生物组界面的可视化。了解宿主相关细菌的生物学需要了解它们在微环境中的定位。

这项技术将使我们能够在宿主环境中以及其他细菌的背景下可视化单个分类群。通过这种技术，有可能确定哪些细菌可能已经穿透宿主组织，并确定宿主粘液等关键特征是否可能被耗尽。在含有60%无水甲醇，30%氯仿和10%冰醋酸的兼容容器中制备新鲜的甲基卡森。

使用锋利干净的工具，从小鼠身上切下肠段进行成像。尽可能减少对样品的干扰，并通过其脊处理切片，以避免影响成像区域。解剖后尽快固定样品，以防止降解。

将肠部分放入组织学盒中，用镊子小心地保持组织的边缘。关闭盒并完全浸没在新鲜的甲基吡啶溶液中，确保溶液在浸没在盒中不超过几个小时。对于将在没有通风橱的临床套件中收集的临床样本，请使用聚乙烯储存容器，盖子上有一个盖子，允许组织学盒通过。

在不通过样品时用胶带将此翻盖关闭，以防止有毒烟雾逸出。将石蜡放入耐热容器中，在60摄氏度的烤箱中融化过夜。通过在适当的废物容器中倒出液体并将其依次在无水甲醇，无水乙醇和二甲苯中孵育来洗涤组织，如文本手稿中所述。

使用双层手套或镊子稍微打开盒，使石蜡进入而不会丢失组织片段。浸没并关闭熔化石蜡容器中的盒。将容器放回60摄氏度的烤箱中，确保盒中装满石蜡并且不会留下大气泡。

孵育两小时后，将容器从烤箱中取出。使用镊子，小心地取出暗盒。将烤箱加热至60摄氏度，并预热Coplin罐。

在玻璃瓶中加入足够体积的二甲苯，以将罐中的载玻片覆盖两次，并在盖子周围放置石蜡以防止二甲苯蒸发。让二甲苯的温度达到60摄氏度。准备文本手稿中提到的FISH杂交解决方案。

将载玻片放入Coplin罐中，确保切片不与其他载玻片或罐子接触，并在60摄氏度下烘烤载玻片10分钟。在通风橱中，用烤箱中预热的二甲苯填充Coplin罐，注意不要直接倒在样品顶部并可能移走组织。将Coplin罐放回60度烤箱中。

将用过的二甲苯倒入适当的废物容器中，注意不要干扰载玻片上的组织部分，并使用一对镊子防止载玻片从Coplin罐中掉出。用剩余的二甲苯补充Coplin罐，并在通风橱中室温下孵育10分钟。在室温下将切片在99.5%乙醇中孵育五分钟。

孵育后，从Coplin罐中取出载玻片。用实验室湿巾或纸巾擦拭载玻片背面，并短暂风干，直到乙醇液滴消失。使用液体阻滞剂或PAP笔在每个组织切片周围创建非常紧密的圆圈，以限制杂交溶液需要覆盖的扩展区域，避免墨水与切片接触。

准备杂交溶液，每50微升所用溶液加入0.5微克探针。将溶液移液到载玻片上的部分。用柔性塑料盖玻片覆盖截面，确保使用的液体体积覆盖整个截面。

使用移液器吸头盒创建一个潮湿的腔室，该吸头盒带有湿巾或纸巾，这些湿巾或纸巾已被过量的杂交溶液或PBS浸泡以提供湿度。根据探头设置，将载玻片在45至50摄氏度的潮湿室中孵育至少三个小时，以减少蒸发。取下塑料盖玻片，并将载玻片在COPLIN罐中的FISH洗涤缓冲液中孵育，两者都预热至50摄氏度。

将Coplin罐放回50摄氏度的烤箱中10至20分钟。取出FISH洗涤缓冲液，并将其替换为Coplin罐中的PBS。在用PBS重新填充Coplin罐后，立即醒酒PBS。

从罐子中取出载玻片，将复染剂移液到整个部分的顶部，同时确保不要用移液器吸头接触组织。在四摄氏度下孵育45分钟。用新鲜的PBS快速清洗污渍三次。

用湿巾或纸巾擦拭载玻片的背面，让大部分PBS从部分蒸发，并由连接到移液器吸头的真空管路辅助。使用安装介质安装截面。用透明的指甲油沿着盖玻片的边缘绘画，将盖玻片贴在幻灯片上，注意远离滑盖的边缘。

让它在室温下凝固。这里显示了单孢子菌单定植的小鼠远端结肠和双定植于肠杆菌肠和拟杆菌的远端结肠的图像。用FISH探针对样品进行染色，三种标记有针对Muribaculum分离物的特有的优质菁氨酸-3，并用罗丹明结合的凝集素UEA-1和DAPI进行复染。

用菁-3 FISH，DAPI以及联合菁-3 FISH和DAPI通道染色的部分的图像显示Muribaculum肠的定位。所有细菌形状和细菌大小的DAPI信号都标有处于单定植状态的菁-3。在双定植状态下，除了这些菁-3和DAPI双阳性细胞外，还有DAPI染色的细菌细胞如预期的那样是菁-3阴性的。

除了较长的丝状细菌外，较大的DAPI阳性结构是来自宿主细胞的植物材料或细胞核。在提供管腔视图以及上皮纵向视图的深度进行切片的肠段和仅显示隐窝横截面且没有恒定粘液层或细菌的浅截面部分证明浅切片不会提供肠腔切片。组织或盖玻片覆盖不均匀会导致瓷砖扫描模糊且照明不均匀。

此处还显示了普通背景和高背景的示例。随着我们对微生物群的了解越来越多，很明显，测序等批量检测不足以真正确定不同微生物物种之间发生的事情以及它们如何相互作用。为此，我们确实需要成像。

这种类型的技术允许一些非常重要的发现，例如，从饮食中剥夺纤维会导致粘液层变薄和病原体的潜在感染，例如Martins组的研究，以及对渗透性腹泻的影响的研究以及粘液层的消耗如何真正影响宿主和微生物群。这些是由Sonnenberg小组以及我们小组所做的研究。