Name: 活微生物组共培养与人的微工程肠绒毛在肠道上一个芯片微流体装置 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 了解肠道芯片微流体装置中人类肠道细胞与活肠道微生物组的共培养方法。该技术模拟蠕动样运动和流动，促进绒毛生长，为研究溃疡性结肠炎和克罗恩病等胃肠道疾病机制及药物开发提供重要平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢哈佛大学怀斯研究所（Wyss Institute at Harvard University）的 Sri Kosuri 提供表达 GFP 标记的 E. coli 菌株。本研究由美国国防高级研究计划局（Defense Advanced Research Projects Agency）合作协定编号 W911NF-12-2-0036、美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration）合同编号 HHSF223201310079C，以及哈佛大学生物启发工程怀斯研究所（Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University）资助支持。本文所表达的观点和结论均为作者意见，不应被视为代表美国陆军研究办公室、陆军研究实验室、食品药品监督管理局或美国政府的官方政策，无论明示或暗示。尽管本文标注了版权信息，美国政府仍被授权为政府用途复制和分发重印本。

1. 肠芯片装置的微加工
注意：肠芯片是一种由透明、透气的硅基聚合物（聚二甲基硅氧烷，PDMS）制成的微流控装置，包含两个平行的微通道（1 mm 宽 × 150 µm 高 × 1 cm 长），通道之间由一层柔性的多孔 PDMS 膜隔开（孔径 10 µm，孔间距 25 µm）5,9。请按照提供的步骤制备肠芯片（图 1A，左图）。
<ol>
	<li>肠道芯片的微加工制备流程5,9。
	<ol>
		<li>将PDMS预聚物与固化剂按15:1（质量比）混合，制备未固化的脱气PDMS，并置于真空干燥器中处理30分钟。</li>
		<li>分别将30 g和3 g未固化且已脱气的PDMS倾倒至两个硅模具上，这两个模具分别具有基于SU-8的肠道芯片上、下微通道的微结构图案；随后在干燥烘箱中60 °C条件下固化至少4小时。</li>
		<li>使用外科手术刀沿边缘切割，从各自的硅模具上脱模得到上层和下层PDMS层；使用活检打孔器（孔径2.0 mm）打出6个孔（两个入口、两个出口以及两个真空腔）。</li>
		<li>通过在含有圆柱阵列（直径10 µm，高度25 µm）的硅片上倾倒10 g未固化且已脱气的PDMS来制备多孔膜，该硅片已进行硅烷化处理，并覆盖有一层平整的硅烷化PDMS支撑层（15:1，w/w；厚度1 cm）；在装置上放置3 kg重物压紧，在60 °C下固化12小时或更长时间。</li>
		<li>小心抬起支撑板的一角，从硅片上逐步剥离，使附着于PDMS支撑板上的多孔PDMS膜完全脱离硅片，完成脱模。</li>
		<li>分别使用手持式电晕处理仪对上层PDMS（15:1，w/w）的通道面和多孔膜的一面进行等离子体处理，处理时间分别为1分钟和3秒。</li>
		<li>将经过等离子体处理的多孔PDMS膜与上层微通道层对齐贴合，确保两者平行接触且无气泡产生。</li>
		<li>将整个装置在80 °C条件下过夜孵育，以实现两层PDMS之间的不可逆键合。</li>
		<li>小心抬起支撑层的一角，逐步剥离PDMS支撑层，使其完全从带有膜的上层组件上分离。</li>
		<li>使用精细镊子撕除位于真空腔上方（即主通道两侧的两个腔室）的膜部分，形成中空的真空腔。</li>
		<li>按照步骤1.1.6所述方法，对顶部部件带膜的一侧和底部部件带刻蚀通道的一侧同时进行等离子体处理，时间为1分钟。</li>
		<li>在体视显微镜下，将带有膜的上层微通道层与下层部件精确对齐，确保两者平行贴合且无气泡。</li>
		<li>将整个装置置于干燥烘箱中80 °C条件下过夜固化，最终获得一个完整的肠道芯片微流控装置，其包含两个紧邻微流控细胞通道的中空真空腔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过90°弯曲的不锈钢钝头针，将管路连接至肠道芯片中与上层或下层微通道相连的每个端口的入口和出口。</li>
	<li>使用90°弯曲的不锈钢钝头针，将管路连接至与真空腔相连的孔道。</li>
	<li>使用1 ml无菌一次性注射器注入70%（v/v）乙醇，流经微通道和管路，以实现灭菌。</li>
	<li>在60 °C干燥烘箱中过夜干燥微通道和管路。</li>
</ol>
2. 肠芯片装置中微工程化肠绒毛的培养
<ol>
	<li>种子型肠上皮细胞（Seed Intestinal Epithelial Cells, SIECs）例如 Caco-2BBE 在肠芯片微装置上的应用5,9.
	<ol>
		<li>使用1 ml无菌一次性注射器，以70% (v/v) 乙醇对装置进行灭菌（见步骤1.4），随后在60 °C干燥烘箱中过夜干燥（见步骤1.5），再进行表面活化。</li>
		<li>暴露肠道芯片微系统（gut-on-a-chip microsystem）的完整装置即，&#160;将连接有管路的肠道芯片装置暴露于紫外光（253.7 nm）和臭氧中，同时处理40分钟。</li>
		<li>在室温下使设备冷却&#160;在生物安全柜（BSC）中用紫外光照射15分钟。</li>
		<li>使用一次性无菌1 ml注射器，将100 µl细胞外基质（ECM）包被液加入上下微通道中，ECM包被液为50 µg/ml I型胶原蛋白与300 µg/ml细胞外基质混合物用无血清Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）稀释而成。</li>
		<li>在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育整个装置2 孵育1小时。</li>
		<li>在生物安全柜中，使用50 ml过滤系统（孔径0.45 µm），对预热至37 °C的50 ml完全培养基（DMEM，20% v/v胎牛血清（FBS），100单位/ml青霉素和100 µg/ml链霉素；分装于3 ml一次性注射器中）进行脱气处理，持续1分钟。
		<ol>
			<li>将预热的培养基通过过滤系统，并轻轻敲击装有滤过培养基的容器1分钟，以去除培养基中的气泡或溶解气体。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将脱气完全培养基分装液置于3 ml一次性注射器中，于37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育2 孵育1小时。</li>
		<li>将两个装有脱气且预热的完全培养基的3 ml一次性注射器分别连接到上侧和下侧微通道。</li>
		<li>使用注射泵以30 µl/hr的体积流速将脱气的完全细胞培养基注入上层微通道（相当于0.02 dyne/cm的剪切应力）2) 于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中2 过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肠道芯片中微工程化Caco-2微绒毛的形成
	<ol>
		<li>使用传代次数在50至65之间的Caco-2BBE细胞。</li>
		<li>在含完全培养基的T75培养瓶中培养Caco-2细胞，置于37 °C、5% CO₂湿润培养箱中2 在培养箱中孵育4-5天，以获得完全融合的细胞。</li>
		<li>加入10 ml的Ca2+ 和 Mg2+向T75培养瓶中完全汇合的Caco-2细胞加入无菌PBS，洗涤细胞，然后吸除PBS。重复此步骤两次。</li>
		<li>加入1 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液，于37 °C、5% CO₂湿润环境中孵育2 孵育5分钟。</li>
		<li>用移液器上下吹打3至5次，将解离的细胞重悬于10 ml预热的完全细胞培养基（含FBS）中。</li>
		<li>以500 × g离心5分钟，使细胞悬液沉淀，然后弃去上清液。</li>
		<li>再次用1 ml预热的完全培养基重悬，以调节细胞密度至约1.5 × 10⁶ cells/ml5 细胞/厘米²2 在设备中使用血细胞计数板估算细胞密度。</li>
		<li>通过将连接有25 G5/8针头的1 ml一次性注射器置于与上层微通道相连的管路出口处，注入100 µl重悬的Caco-2细胞至上层微通道（管腔侧）。</li>
		<li>使用长尾夹夹住连接上、下微通道的所有管路的入口和出口。</li>
		<li>在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育整个装置2 在孵育箱中孵育1小时，使解离的Caco-2细胞贴附于多孔膜表面。</li>
		<li>取下夹子，使用注射泵以30 µl/hr的流速仅向顶部微通道恢复培养基流动，持续24–36小时，直至细胞形成完整的单层。采用相差显微镜或微分干涉差（DIC）显微镜观察，以确认细胞单层中的细胞间连接。</li>
		<li>当细胞形成单层后，以相同的流速（30 µl/hr）向顶侧（管腔）和底侧（毛细血管）微通道中灌注培养基。</li>
		<li>模拟蠕动运动的机械形变应用5,9.
		<ol>
			<li>打开配备张力装置的真空泵。</li>
			<li>通过不锈钢接头和管路将真空室连接至真空控制器。</li>
			<li>在真空控制软件中，将拉伸运动设置为10%的平均细胞应变，频率为0.15 Hz，采用循环正弦函数模式，然后点击 &#34;开始&#34;.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在机械形变（10%，0.15 Hz）条件下，向汇合的Caco-2单层细胞的上、下微通道中持续灌注培养基（30 µl/hr），维持约100小时。 
		注意：Caco-2 细胞会自发进行绒毛形态发生，形成波浪状的三维突起，延伸至上皮微通道的管腔内5,8-10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在肠道芯片中模拟具有肠腔-毛细血管组织界面的活体人肠器官级功能10，按照所述步骤进行操作。
	<ol>
		<li>通过重复步骤 2.1 至 2.2，培养微工程化的 Caco-2 绒毛。</li>
		<li>以30 µl/hr的流速将预热的共培养基（完全Caco-2细胞培养基与完全HMVECs培养基按1:1 v/v混合）注入上、下微通道中。</li>
		<li>加入100 µl解离的正常人毛细血管微血管内皮细胞（HMVECs；终末细胞密度约为5.0 × 10⁵ cells/cm²）5 细胞/厘米²2采用与2.2.3至2.2.9步骤中所述相同的方法，将溶液注入下层微通道。</li>
		<li>将一块已固化的矩形PDMS（0.5 cm × 1 cm × 1 cm；宽 × 长 × 高；弹性体∶固化剂 = 15∶1，w/w）放置于器官芯片装置上方，然后将整个装置倒置即， 上层微流控通道朝下，下层微流控通道朝上。</li>
		<li>在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育装置2 孵育1小时，使解离的人微血管内皮细胞（HMVECs）贴附于下层微通道多孔膜表面。</li>
		<li>从 CO 中取出整套装置2 培养箱，并再次翻转装置。</li>
		<li>以机械拉伸运动（10%，0.15 Hz）以30 µl/hr的速度向上下微通道中灌注预热的共培养基（完全Caco-2细胞培养基与完全HMVECs培养基按1:1 v/v混合），持续至少三天，以形成内皮单层细胞间的细胞连接。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肠道芯片微装置中的宿主-肠道微生物组共培养
<ol>
	<li>按照以下步骤对细菌细胞进行预培养，以在微加工的肠绒毛上共培养共生肠道微生物组。
	<ol>
		<li>将冻干的益生菌粉末混合物重悬于10 ml经高压灭菌的乳杆菌MRS肉汤与强化梭菌培养基（1:1, v/v）的混合液中。</li>
		<li>通过添加适量培养基将最终细胞密度调整至约0.2个光密度单位（600 nm处），然后将3 ml微生物细胞悬液分装至10 ml一次性无菌试管中。</li>
		<li>将含有重悬微生物细胞的试管放入厌氧容器中。在容器中加入两包厌氧气体发生袋。 tightly 密封容器盖，于37 °C、含5% CO₂的湿润环境中静置培养2 过夜孵育</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微生物组接种与肠道上皮细胞共培养5,10.
	<ol>
		<li>准备含有脱气无抗生素细胞培养基的 3 ml 一次性注射器（即， 含20% FBS的DMEM）。培养基脱气步骤详见2.1.6。</li>
		<li>从 CO₂ 培养箱中取出含有微加工绒毛结构的肠芯片装置整套系统2 孵育箱，然后转移至生物安全柜。</li>
		<li>移除与上、下微通道相连的注射器。将3.2.1步骤中准备好的注射器连接至装置，并放回CO₂培养箱中。2 孵育箱中，然后在接种微生物组之前，用不含抗生素的培养基灌流12小时。</li>
		<li>将预培养的益生菌混合菌液（见步骤3.1）在10,000 × g离心5分钟。用真空抽吸去除上清液，然后重悬于无抗生素的DMEM培养基中（终浓度细胞密度约为1.0 × 10⁸ cells/mL）。7 CFU/ml</li>
		<li>将细胞悬液注入含有微通道腔侧 &#34;无菌&#34; 使用连接25 G5/8针头的1 ml一次性注射器向肠绒毛灌注。通过夹闭所有管路末端，使微生物细胞在无流动条件下与肠绒毛的顶膜表面黏附约1.5小时。</li>
		<li>以40 µl/hr的流速将预热的无抗生素培养基灌注到上、下微通道中，同时施加周期性节律性形变（10%，0.15 Hz）。</li>
		<li>对于表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的共培养 E. coli （GFP E. coli；非致病性 DH5-Alpha E. coli 宿主10,11 具有微加工绒毛的细胞，预先培养GFP E. coli 在37 °C、200 rpm振荡条件下，将细胞接种于高压灭菌的LB培养基中培养12小时。重复步骤3.2.5至3.2.6，进行GFP共培养 大肠杆菌 具有微加工绒毛的细胞</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像细胞5,8-10
	<ol>
		<li>进行微分干涉相差显微镜、落射荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜观察，以记录微生物和上皮细胞的形态5,8,10.
		<ol>
			<li>对于微分干涉差（DIC）成像，从CO₂培养箱中取出一个肠芯片微系统装置2 将培养箱中的装置放置在显微镜载物台上，然后记录细胞形态。</li>
			<li>为进行绒毛上皮的荧光成像，以每小时100 µl的速度用PBS灌流清洗细胞，持续10分钟。
			<ol>
				<li>用4%（w/v）多聚甲醛固定绒毛15分钟，然后以100 µl/hr的流速用PBS冲洗细胞10分钟。</li>
				<li>用含2%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的PBS稀释0.3%（v/v）Triton X-100，对绒毛进行透化处理，持续10分钟。随后以100 µl/hr的流速用PBS冲洗细胞，持续10分钟。</li>
				<li>用含2% (w/v) BSA的PBS溶液封闭细胞，1小时。随后以每小时100 µl的流速用PBS冲洗细胞，持续10分钟。</li>
				<li>在避光条件下，加入用 PBS 稀释的 300 nM 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）溶液进行细胞核染色。</li>
				<li>在避光条件下，加入溶于PBS的荧光鬼笔环肽（Phalloidin-CF647偶联物），终浓度为25单位/ml，用于F-actin染色。</li>
				<li>使用激光扫描共聚焦显微镜记录荧光染色细胞的图像。 
				注意：共聚焦显微镜观察时使用了25倍物镜，并配合适当的光学变焦。在 图3B，使用了约525倍的放大倍数。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444, 1027-1031 (2006).</li>
<li>Tremaroli, V., Backhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+the+gut+microbiota+and+host+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism.</a> Nature. 489, 242-249 (2012).</li>
<li>Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+Microbiota+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gut Microbiota in Health and Disease.</a> Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+microbiome+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The human microbiome project.</a> Nature. 449, 804-810 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).</li>
<li>Round, J. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+shapes+intestinal+immune+responses+during+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).</li>
<li>Garrett, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communicable+ulcerative+colitis+induced+by+T-bet+deficiency+in+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system.</a> Cell. 131, 33-45 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-a-Chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).</li>
<li>Huh, D., Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).</li>
<li>Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+microbiome+and+mechanical+deformation+to+intestinal+bacterial+overgrowth+and+inflammation+in+a+human+gut-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).</li>
<li>Miller, W. G., Lindow, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+GFP+cloning+cassette+designed+for+prokaryotic+transcriptional+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions.</a> Gene. 191, 149-153 (1997).</li>
<li>Odijk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+direct+current+trans-epithelial+electrical+resistance+in+organ-on-a-chip+microsystems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems.</a> Lab Chip. 15, 745-752 (2015).</li>
<li>Lentle, R. G., Janssen, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+characteristics+of+digesta+and+their+influence+on+flow+and+mixing+in+the+mammalian+intestine%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+B%22%5BJournal%5D)">Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review.</a> J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).</li>
<li>Granato, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface-associated+lipoteichoic+acid+acts+as+an+adhesion+factor+for+attachment+of+Lactobacillus+johnsonii+La1+to+human+enterocyte-like+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells.</a> Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).</li>
<li>Dewhirst, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+oral+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The human oral microbiome.</a> J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).</li>
<li>Grice, E. A., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The skin microbiome.</a> Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).</li>
<li>Hay, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+bacterial+colonisation+of+the+genital+tract+and+subsequent+preterm+delivery+and+late+miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J%22%5BJournal%5D)">Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage.</a> Br Med J. 308, 295-298 (1994).</li>
</ol>

Donald E. Ingber 是 Emulate 公司的创始人，持有该公司股权，并担任其科学咨询委员会主席。其他作者没有财务披露事项。

理解宿主与微生物组之间的相互作用对于推动医学发展至关重要；然而，传统的细胞培养模型在塑料培养皿或静态孔板中进行时，通常无法支持人类肠道细胞与活体肠道微生物稳定共培养超过1-2天，因为微生物细胞往往会过度生长并覆盖哺乳动物细胞 体外过度生长的微生物群落会迅速消耗氧气和营养物质，进而产生大量代谢废物（例如，&#160;有机酸），严重损害肠道屏障功能，并导致肠道上皮细胞死亡。因此，在共培养微环境中，防止因微生物过度生长所引发的营养物质耗竭和微生物代谢废物积累，对于维持宿主与微生物群长期（从数天至数周）稳定共存至关重要。
为克服这些挑战，一种微生理肠道芯片装置5,8 已开发出可形成完全分化的类人肠绒毛并维持肠腔稳态微环境的技术 体外设计与功能单元（例如， 肠道芯片微流控装置中的微流控流体腔室、由真空驱动的周期性形变等条件经过改进，可精确模拟微生物共培养所需的生理、物理和化学微环境5,10肠道芯片微流控培养中施加的剪切应力由人肠道管腔内流动的生理范围决定5,13</s...

人类肠道中栖息着种类极为多样的微生物物种（&#60;1,000 个物种）以及数量巨大的微生物细胞（是人体宿主细胞数量的 10 倍）和基因（是人类基因组基因数量的 100 倍）1这些人类微生物组在营养物质和异源物质的代谢、免疫应答的调节以及肠道稳态的维持中发挥着关键作用2鉴于这些多种功能，共生肠道微生物组对健康和疾病具有广泛的调节作用3因此，了解肠道微生物组及其与宿主相互作用的作用对于促进胃肠道健康以及探索肠道疾病的新疗法具有重要意义4。然而，现有的 体外 肠道模型（例如， 静态培养）将宿主-微生物组共培养限制在较短的时间内（&#60;1天）因为微生物细胞过度生长，会破坏肠道屏障功能5. 替代动物模型（例如， 无菌6 或基因工程小鼠7也通常不用于研究宿主-肠道微生物组相互作用，因为人类肠道微生物组的定植和稳定维持较为困难。
为了克服这些挑战，我们近期开发了一种仿生的人源&#34;Gut-on-a-Chip&#34;微生理系统（图1A，左），用于模拟活体人肠道中宿主与肠道微生物组之间的相互作用5,8。该肠道芯片微装置包含两个平行的微流控通道，由一层柔性的、多孔的、涂有细胞外基质（ECM）的膜隔开，膜上排列着人肠上皮Caco-2细胞，从而模拟肠道腔-毛细血管组织界面（图1A，右）9。通过真空驱动的周期性节律性形变，可诱导产生模拟蠕动所引起生理机械形变的效果（图1A，右）。有趣的是，当Caco-2细胞在肠道芯片中培养超过100小时后，会自发形成具有紧密连接、顶膜刷状缘、局限于基底隐窝的增殖细胞、黏液分泌、药物代谢活性增强（例如，细胞色素P450 3A4，CYP3A4）以及葡萄糖重吸收能力提高的三维（3D）肠绒毛结构8。在此“无菌”微环境中，可实现益生菌Lactobacillus rhamnosus GG或一种益生菌混合制剂与宿主上皮细胞共培养长达两周5,10。
本研究中，我们详细描述了在肠道芯片装置中进行宿主-肠道微生物组共培养的长期实验方案。此外，我们还讨论了该宿主-微生物组共培养方案在广泛应用时需要考虑的关键问题和潜在挑战。

<table><tbody><tr><td>含25 mM葡萄糖和25 mM HEPES的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td>在37 &amp;deg;C水浴中预热。</td></tr><tr><td>Difco乳酸杆菌MRS肉汤</td><td>BD</td><td>288120</td><td>在121 &amp;deg;C下高压灭菌15分钟。</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>15:1（w/w），PDMS : 固化剂</td></tr><tr><td>Caco-2BBE人结肠直肠癌细胞系</td><td>哈佛消化疾病中心</td><td></td><td>人结肠直肠腺癌&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>在DMEM中占20%（v/v）</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺混合液</td><td>Gibco</td><td>10378-1016</td><td>在DMEM中1:100稀释</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>细胞核染色</td></tr><tr><td>鬼笔环肽-CF647偶联物（25单位/ml）</td><td>Biotium</td><td>00041</td><td>F-肌动蛋白染色</td></tr><tr><td>Flexcell FX-5000张力系统</td><td>Flexcell国际公司</td><td>FX5K</td><td>类蠕动拉伸运动（10%细胞应变，0.15 Hz频率）</td></tr><tr><td>倒置落射荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>成像，微分干涉对比（DIC）</td></tr><tr><td>扫描共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>DMI6000</td><td>成像，荧光</td></tr><tr><td>UVO清洗仪</td><td>Jelight公司</td><td>342</td><td>肠道芯片表面活化</td></tr><tr><td>I型胶原蛋白&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td>用于芯片内细胞培养的细胞外基质组分</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>354234</td><td>用于芯片内细胞培养的细胞外基质组分</td></tr><tr><td>1 ml一次性注射器</td><td>BD</td><td>309628</td><td>细胞和培养基注射用具</td></tr><tr><td>25 G 5/8针头</td><td>BD</td><td>329651</td><td>细胞和培养基注射用具</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Braintree Scientific公司</td><td>BS-8000</td><td>向芯片内注射的设备</td></tr><tr><td>VSL#3</td><td>Sigma-Tau Pharmaceuticals</td><td>7-45749-01782-6</td><td>由8种不同共生肠道微生物组成的制剂</td></tr><tr><td>强化梭菌培养基</td><td>BD</td><td>218081</td><td>厌氧细菌培养基</td></tr><tr><td>含指示剂的GasPak EZ厌氧容器系统</td><td>BD</td><td>260001</td><td>厌氧气体发生袋&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4%多聚甲醛</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>157-4-100</td><td>用于染色前细胞固定</td></tr><tr><td>曲拉通X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>细胞通透处理</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>细胞染色用封闭剂</td></tr><tr><td>电晕处理仪</td><td>Electro-Technic产品公司</td><td>BD-20AC</td><td>用于芯片制备的等离子体发生器</td></tr><tr><td>Steriflip&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>完全培养基脱气</td></tr><tr><td>一次性血细胞计数板</td><td>iNCYTO</td><td>DHC-N01</td><td>用于手动细胞计数</td></tr></tbody></table>

在肠道芯片微流控装置中将活性微生物组与微工程化人肠绒毛共培养

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

在此，我们描述了一种在人源肠芯片微生理系统装置中，将多物种人肠道微生物组与微工程化肠绒毛进行长期共培养的实验方案。我们于微流控装置中重建了肠腔-毛细血管组织界面，并持续施加生理性的机械形变和流体剪切力，以模拟肠道蠕动。在腔侧微通道中，培养人源肠上皮Caco-2细胞，形成“无菌”绒毛样上皮结构，并重建小肠绒毛。将预先培养的微生物细胞接种至腔侧，以建立宿主-微生物生态系统。当微生物细胞黏附于绒毛顶端表面后，恢复液体流动和机械形变，从而形成稳态微环境，其中持续供给新鲜培养基，并不断清除未结合的细菌及细菌代谢废物。经过数天至数周的持续共培养后，可在绒毛间随机观察到多个微菌落，且微生物与上皮细胞在培养中至少一周内均保持活性与功能。本共培养方案可进一步拓展，为研究存在于人体多种器官中的其他宿主-微生物组生态系统提供一个多功能平台，有望促进 体外 研究人类微生物组在调控健康与疾病中的作用。

模拟人类肠道宿主-微生物组生态系统 体外，它是 有必要建立一种实验方案，以在生理条件下（如类似蠕动的力学环境和流体流动）重建肠道细菌与人肠上皮细胞的稳定长期共培养体系。本文中，我们采用一种仿生的“肠芯片”微装置 (图1A将活的微生物细胞与活的人类绒毛直接接触共培养，持续一周或更长时间 体外肠上皮细胞在存在生理相关流体流动和周期性机械形变的条件下，于双通道微流控装置的一个通道内，在多孔ECM包被膜的一侧培养时，可自发形成高度分化的绒毛结构。5微工程化的绒毛可模拟人体小肠绒毛的结构与功能，包括形成由顶端刷状缘覆盖的柱状上皮细胞、具有子代细胞从隐窝向绒毛顶端迁移并分化特征的基底增殖型隐窝、高水平的黏液分泌、增强的药物代谢活性以及升高的葡萄糖重吸收能力8活的内皮细胞可在同一膜的对侧进行培养，以重建肠壁的组织-组织界面，同时可在该系统中培养免疫细胞10为验证肠上皮细胞的保护功能，通过测量跨上皮电阻（TEER），间...

我们描述一种 体外 利用人肠道芯片微生理系统长期共培养肠道微生物组与肠绒毛的实验方案

在此，我们介绍一种在人体……中利用微加工肠绒毛进行多物种人类肠道微生物组长期共培养的实验方案。

本实验方案的总体目标是在肠芯片微流控装置中，模拟肠道蠕动和流动条件，展示人类肠道细胞绒毛的生长情况，同时展示如何将这些细胞与活体肠道微生物组进行共培养。因此，该方法有助于胃肠病学、临床微生物学和药物科学领域的关键问题研究，可用于阐明疾病机制，并验证新药物化合物的疗效与毒性。该技术的主要优势在于，研究人员可利用微生理系统在体外构建出具有活性和功能的人体肠道活体微生物组生态系统。该技术的影响可延伸至溃疡性结肠炎或克罗恩病等疾病，因为宿主细胞与微生物组的稳定共培养能够模拟这些疾病的复杂性。尽管该方法可揭示肠道微生物组与肠道内免疫系统之间复杂的相互作用，也可应用于存在宿主-微生物相互作用的其他器官系统，例如皮肤、生殖道或口腔。首先，按照随附的文字方案准备肠道芯片微流控装置。该装置由一种透明的透气性硅胶聚合物构成，内含两条平行的微通道，中间由一层柔性的多孔聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜隔开。通道两侧为真空腔室，可用于施加周期性机械应变。使用1毫升注射器将70%乙醇流经通道，以对装置进行灭菌。然后，将装置置于60摄氏度的干燥烘箱中过夜干燥。次日，将肠道芯片微系统及其连接的管路同时暴露于紫外光和臭氧中处理40分钟。随后在生物安全柜的紫外光下继续冷却装置15分钟。接下来，将100微升编码细胞外基质的溶液加入1毫升注射器中，并将其注入装置的上层微通道。重复此步骤以包被下层微通道。将整个装置置于37摄氏度、含5% CO2的湿润培养箱中孵育1小时。孵育期间，将预热的完全培养基通过50毫升过滤系统中的0.45微米滤膜过滤1分钟，以去除气体。轻轻敲击过滤后的培养基1分钟，以去除培养基中可能存在的气泡或溶解气体。随后，将去气后的完全培养基转移至两个3毫升的一次性注射器中，并将注射器孵育1小时。接下来，将注射器连接至肠芯片的上层和下层微通道，通过向上下微通道中轻柔脉冲式灌注完全培养基以洗去编码溶液。随后，使用注射泵将脱气的完全细胞培养基注入装置的上层微通道，并将芯片置于37摄氏度、5% CO2条件下过夜培养。收获一个完全融合的T75培养瓶中的Caco-2肠上皮细胞，首先用10毫升无钙镁的PBS冲洗细胞。然后，吸除 PBS，并重复洗涤两次。接着，加入 1 毫升 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，将培养瓶置于 37 摄氏度孵育 5 分钟。待细胞脱落以后，加入 10 毫升预热的完全细胞培养基，上下吹打细胞悬液 3 至 5 次，然后转移至离心管中。将细胞悬液离心。随后，弃去上清液，并用预热的完全培养基将细胞重悬至每平方厘米150,000个细胞的密度。用一支配有25号、5/8英寸针头的一毫升一次性注射器吸取500微升细胞悬液。然后，通过出口管路将100微升细胞悬液加入上层微通道。接着，使用长尾夹夹闭所有连接上层和下层微通道的入口和出口。将整个装置孵育1小时，以使肠上皮细胞贴附于多孔膜表面。然后，移除夹子，将上层通道的管路连接至已装满培养基并置于注射泵上的注射器。以每小时30 µL的流速恢复向微通道上层灌注培养基，直至细胞形成完整的单层。一旦细胞形成单层，将下层通道连接至第二个注射器，并以相同的30 µL/h流速向微通道上层腔和下层毛细管通道同时灌注培养基。为了在芯片中产生类似蠕动的运动，首先打开真空泵。使用不锈钢连接器通过管路将装置的真空腔连接至真空控制器。然后，设置控制器，使其提供一个周期性的正弦拉伸运动，幅度为平均细胞应变的10%，频率为0.15赫兹，随后点击开始。在存在机械形变的情况下，持续向上下微通道中灌注培养基至少80小时，以诱导绒毛生长。配制灭菌乳酸菌MRS肉汤与强化梭菌培养基的1:1混合液。随后，将冻干的益生菌混合物重悬于10毫升该混合液中。在600纳米处测定混合物的光密度，并将最终细胞密度调整至约0.2个光密度单位。取3毫升调整后的微生物细胞悬液，分装至一次性10毫升无菌试管中。将分装的样品放入厌氧容器，并在容器中加入两包厌氧气体发生袋。紧密关闭容器盖，并将容器装置置于培养箱中静置过夜培养。接下来，准备去气泡的无抗生素细胞培养基，并将其装入三毫升一次性注射器中。将含有微工程化绒毛的器官芯片装置转移至生物安全柜中。移除连接到装置上、下微通道的注射器，并更换为装有脱气且不含抗生素的细胞培养基的注射器。操作完成后，将装置重新放回 CO2 培养箱中。随后，在接种微生物组之前，先向装置中灌注不含抗生素的培养基，持续 12 小时。接下来，离心收集预培养的益生菌细胞混合物。吸除上清液，然后将菌体重悬于不含抗生素的DMEM培养基中。取约100微升该细胞悬液，加入连接有25号、5/8英寸针头的1毫升注射器中。将细菌注入含有先前无菌肠绒毛的微通道腔侧。通过夹紧管路，在无流动条件下使微生物细胞在肠绒毛顶端表面黏附一个半小时。随后，以每小时40微升的流速，将预热的不含抗生素的培养基灌注到上、下微通道中，并施加周期性节律性形变。该共培养方案可实现多种益生菌在绒毛间隙中的稳定定植。活菌微菌落可在共培养条件下维持长达两周。图中所示为包含GFP标记的大肠杆菌（E.coli）和肠绒毛的另一种共培养体系。高倍放大清晰地显示了在72小时时间点细菌微菌落的位置。在进行此操作时，重要的是要记住，应轻柔缓慢地将培养基注入微流控通道中，以避免在培养早期阶段损伤上皮细胞单层。基于该方法，与人类免疫细胞的共培养方法也可为微生物组如何与免疫系统相互作用并影响肠道稳态及最佳肠道健康提供一些线索。观看本视频后，您应能充分理解如何重建人类肠道的微环境，并掌握在体外实现微生物组与人类肠绒毛共培养的方法。操作致病菌和人类细胞具有极高危险性，因此切勿忘记在生物安全柜内进行操作。

co-culture-living-microbiome-with-microengineered-human-intestinal

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

活微生物组共培养与人的微工程肠绒毛在肠道上一个芯片微流体装置

在本视频中，我们介绍了建立一个 离体 用于研究小鼠肠组织片段与特定肠道细菌相互作用的肠道器官培养系统。该装置包含两对进出液端口，第一对连接肠组织管腔并将其与特定细菌悬液相连，第二对持续向装置的孔中供给培养基以维持 离体...

一种用于研究宿主-微生物群相互作用的离体肠道器官培养系统

本文介绍了一种在微流控多器官芯片中对原代细胞、组织模型和打孔活检样本进行共培养的实验方案，培养时间可长达28天。人皮肤微血管内皮细胞、肝细胞聚集体和皮肤活检组织已成功在共同培养基循环系统中实现联合培养。...

多器官芯片——一种用于长期多组织共培养的微流控平台

本文介绍了一种在体外培养结肠肠道微生物群的实验方案,...

应用先进的体外培养技术研究人类肠道微生物群

在此，我们介绍一种利用微加工微流控平台构建三维简化且未分化的皮肤模型的实验方案。通过平行流动方法，可实现 原位 通过注射泵控制，在真皮层隔室上沉积以供上层接种上皮细胞。...

在微加工微流控平台中构建简化的三维皮肤芯片模型

本文介绍了一种利用新型肠道器官培养系统分析宿主-微生物组相互作用的独特方法 离体 实验。...

一种用于分析宿主-微生物群相互作用的肠道类器官培养系统

将活检来源的肠道类器官与器官芯片技术结合，构建出一种微生理系统平台，用以模拟特定区域的肠道功能。...

结合人类类器官与器官芯片技术模拟肠道区域特异性功能

一种用于研究肠道微生物组-神经系统轴的肠芯片模型

本方案描述了一种 体外 坏死性小肠结肠炎（NEC）模型，可用于疾病发病机制的机制性研究。该模型采用微流控芯片，芯片中接种了来源于人类新生儿肠道的肠类器官、内皮细胞以及一名重症NEC新生儿的肠道微生物组。...

结合人类新生儿肠类器官与失调微生物组的坏死性小肠结肠炎微流控模型

将犬类肠道类器官与“肠芯片”微流控系统相结合，为人类肠道疾病提供了具有相关性的转化研究模型。所介绍的方案支持三维形态发生和动态培养 体外 肠道建模，助力犬类和人类肠道疾病的治疗开发，推动同一健康（One...

利用炎症性肠病患者来源的肠道类器官在犬类肠芯片中实现三维形态发生

本文介绍了一种用于构建微流控阴道芯片（Vagina...

构建人阴道芯片中的健康与菌群失调阴道微环境模型

我们的详细方案概述了先进的肠芯片模型的构建与使用方法，该模型可模拟具有三维结构和多种细胞类型的肠黏膜，从而能够深入分析微生物定植引发的免疫反应和细胞功能。...

用于分析肠道黏膜免疫反应的免疫健全肠芯片模型

了解肠道芯片微流体装置中人类肠道细胞与活肠道微生物组的共培养方法。该技术模拟蠕动样运动和流动，促进绒毛生长，为研究溃疡性结肠炎和克罗恩病等胃肠道疾病机制及药物开发提供重要平台。

在肠道芯片微流控装置中将活性微生物组与微工程化人肠绒毛共培养

探索更多视频