基于增强子的表达构建体在小鼠 大脑中的 AAV部署

该协议意义重大，因为它不仅可以可视化增强子序列是否可以驱动表达，还可以可视化它可以驱动身体特定部位的表达。它很快。注射只需不到10分钟即可完成，并且在样本采集后的短短几天内即可看到报告基因是否表达以及在哪里表达。

要开始克隆，请选择或设计报告器构造。这里使用的构建体将增强子候选者置于在hsp68最小启动子控制下表达的EGFP报告基因的三个主要非翻译区域中。为了设计用于扩增目标序列并克隆到载体中的PCR引物，请在引物的五个素末添加适当的Gibson克隆同源臂。

使用设计的引物，从DNA样品中进行PCR。使用 Pac1 和 Asc1 消化 1 至 10 微克的载体 DNA，具体取决于所需的克隆反应次数。通过在 100 伏下采用 0.7 至 1% 凝胶电泳 30 至 60 分钟，分离限制性酶切片段。

提取线性化载体的条带，并使用商业凝胶提取试剂盒纯化。一旦完成吉布森克隆和细胞转化，将细胞铺在选择性培养基上，并在37摄氏度下孵育过夜。在验证报告构建体的成功克隆后，使用甘油原液接种五毫升发酵剂。

在 30 摄氏度的振荡培养箱中培养培养 8 至 16 小时，每分钟 180 次旋转。当肉汤变浑浊时，将发酵剂培养物在 250 至 300 毫升新鲜选择性 LB 肉汤中稀释 1， 000 倍，并在 30 摄氏度和每分钟 180 旋转的振荡培养箱中孵育过夜。使用商业质粒超大试剂盒纯化质粒。

要测试ITR的重组，请执行Xma1消化。可视化波段。确保摘要显示预期的波段数。

重组将导致波段少于预期。准备重组AAV混合物以进行交付。如果比较多种增强子报告病毒的表达模式，请稀释每种病毒，使病毒滴度等同于浓度最低的病毒。

将增强子报告病毒和组成型表达的对照报告病毒以二比一或三比一的比例混合。加入少量终浓度为0.06%的快速绿色染料，轻轻刺入精致的无绒擦拭布中，打破由微升刻度毛细管制成的拉动玻璃移液管的尖端。将移液器插入吸引器组件中，带有连接到橡胶垫圈的压力施加装置，用于固定微毛细管移液器。

通过吸气器施加负压，将少量约0.2至0.5微升的矿物油吸入移液器中。将抽吸器组件放在一边，将病毒放在冰上，直到准备好注射。冷冻麻醉新生小鼠后，使用吸引器组件施加负压，并将病毒混合物吸入拉动的玻璃移液管中，直到半月板通过两微升刻度线。

将鼠标从冷室中取出，然后将其放在工作台上。定位双侧注射部位在λ和前膛之间，以及矢状缝和每只眼睛之间。使用酒精湿巾对它们进行消毒。

使用拉动的玻璃移液管刺穿新生小鼠的头骨。当针头进入颅骨时，通过吸引器组件施加正压。将一微升病毒分配到侧心室，然后取出移液器。

将鼠标放在加热垫或加热室上以恢复。动物醒来后将动物放回笼子里。使用低放大倍率5倍主观镜片记录横跨脑切片的荧光图像。

通过定位注射部位，根据红色荧光细胞的密度和强度评估病毒转导的程度。比较相似转导的动物。使用超过25倍的高倍率物镜记录荧光图像。

接下来，打开分析软件，并应用三乘三的中值滤波器来降低噪声。单击"处理"菜单，然后单击"噪声"，然后选择"去斑点"选项。接下来，要从图像中减去背景荧光，首先分离多通道图像的通道。

单击"图像"菜单，然后单击"颜色"，然后选择"拆分通道"选项。使用矩形或圆形选择工具，在没有任何荧光细胞的图像区域中绘制一个小形状。通过单击"分析"，然后单击"测量"来测量背景的平均像素强度，然后重复多次采样。

平均 5 到 8 个背景区域的平均灰度值，并删除十进制值。通过选择"处理"菜单从图像中的每个像素中减去值，然后单击"数学并减去"。接下来，输入要减去的背景值，然后单击"确定"。如果需要，通过选择"图像"菜单将通道合并回多通道图像，然后单击"颜色"，然后选择"合并通道"。

要计算绿色荧光细胞的数量，请隐藏绿色通道，并使用自由形式选择工具在表达红色荧光的大脑区域周围绘制一个形状。单击测量功能以测量所选区域中红色通道的面积、积分密度和平均灰度值。使用多点选择工具计算绿像元的数量，并通过红色通道的积分强度对绿像元数进行归一化。

在转导增强子报告基因后，小鼠在P0处颅内注射，AAV构建体阳性，注射后28天在皮质的中下层显示增强子驱动的EGFP表达。在P0处注射阴性对照构建体的小鼠在注射后28天没有显示EGFP的任何表达，这表明发现增强子元件可以驱动小鼠大脑中EGFP的转录。为了可视化成功转导的区域并控制潜在的变异性，检查了AAV递送的不同滴度增强子报告文库。

候选增强子的高滴度库驱动广泛的EGFP表达，而候选增强子的低滴度库驱动P7小鼠大脑中稀疏的CGFP表达。在每次注射时将增强子报告基因AAV与阳性对照混合至关重要，以区分没有活性的增强子和失败的交付。该程序可以与免疫组织化学、RNA FISH 或单细胞 RNA 测序配对，以确定增强子在哪种细胞类型中具有活性。