Name: 基于增强子的表达构建体在小鼠 大脑中的 AAV部署 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 学习利用重组腺相关病毒在小鼠大脑中快速评估增强子驱动的基因表达。该方法通过EGFP报告基因可视化特定脑区的增强子活性，为神经科学研究提供高效的体内功能验证工具。

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测序工作由加州大学戴维斯分校DNA技术核心实验室完成。我们感谢加州大学戴维斯分校Lin Tian实验室在rAAV包装方面的培训，以及慷慨赠送AAV辅助病毒和rep/cap质粒。本研究得到美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所R35GM119831项目的支持。

作者声明不存在竞争性财务利益。

本方案&#160;描述了一种基于重组腺相关病毒（rAAV）的方法，用于在出生后小鼠脑中实现由增强子驱动的转基因表达。在此通用方案中，将候选增强子、最小启动子、报告基因以及可选的条形码序列克隆至AAV质粒骨架中。这些实验可针对单个候选增强子序列进行，也可并行分析多个序列。将质粒包装为rAAV后递送至出生后小鼠脑内。在允许病毒转导的一段时间后，收集小鼠脑组织并检测报告基因的表达情况。实验中同时包含一种组成型表达的报告病毒（CAG-mRuby3）作为注射对照。通过该检测方法，可证明增强子元件能够在小鼠脑内驱动EGFP的转录，从而展示其在体内的增强子活性 in vivo。
该实验的故障排除与优化主要涉及病毒滴度、注射技术以及转导时间窗口。不同的病毒滴度会对转导细胞的密度产生显著影响。尽管大多数研究可能更倾向于较高的转导效率，但最佳转导水平在很大程度上取决于实验目的。颅内注射可在局部产生较高密度的转导细胞，但转导区域通常较为局限，尽管感染扩散范围可能受病毒血清型和动物年龄的影响52。眶后静脉注射可能使转导细胞在全脑范围内的分布...

增强子是一类基因组顺式调控元件，可作为转录因子的结合位点，并以时空特异性的方式驱动靶基因的表达1,2。它们在不同细胞类型、组织以及发育阶段中具有差异性活性，并且可能是与疾病风险相关的基因组变异的作用靶点3,4。因此，深入理解增强子功能的动态变化，对于基因组学领域中转化医学和基础科学研究的进展至关重要。in silico 对增强子活性的预测可为增强子功能能力的假设生成提供宝贵的资源5,6。然而，此类预测的增强子活性通常需要进一步的验证和深入分析，才能全面理解其功能活性。增强子报告基因检测已被证明在从细胞到动物的多种系统中均具有重要价值7,8,9。为了在灵活且经济高效的瞬时in vivo 条件下拓展此类研究，本实验方案描述了利用in vivo 腺相关病毒（AAV）介导的方法，检测候选增强子序列在新生小鼠脑中驱动异位报告基因表达的能力。该方法体系适用于单个候选序列的功能分析，也可用于并行文库筛选，对基础研究和转化研究均具有重要意义。
该方法将一个假定的增强子候选DNA序列与报告基因（此处为EGFP）组合于同一质粒中，二者由一个最小启动子调控，该启动子单独存在时不足以驱动显著表达。该质粒被包装为重组腺相关病毒（rAAV），并注射至动物模型体内。尽管此处应用针对脑组织，但利用不同血清型的rAAV可实现多种组织类型的感染，因此该策略可拓展至其他系统。

关键词：增强子候选序列，报告基因，EGFP，最小启动子，重组腺相关病毒，rAAV，动物模型，脑组织10一段时间后，可采集脑组织并检测报告基因的表达水平。与对照组相比，若表达显著增强，则表明所测试的候选序列具有调控能力 &#34;增强&#34; 基因的表达（图1）。这种简单设计为测试序列的增强子活性提供了一种简便且清晰的方法 体内 在大脑中。
除了检测某序列的增强子功能外，该方法还可与其他技术联用，以确定不同细胞类型中增强子的活性。在基于序列分析的差异性增强子活性研究中，可在进行DNA和RNA测序前，根据细胞类型特异性标记对细胞进行分选，从而帮助研究人员判断不同细胞类型是否表现出差异性的增强子活性，如Gisselbrecht等所述。11在基于成像的方法中，使用细胞类型特异性标记物进行共标记染色可实现对&#160;表达增强子驱动荧光的细胞是否也表现出目标细胞类型的标记物12,13,14,15,16增强子报告基因检测能够直接验证与风险相关的等位基因变异对增强子功能的影响。全基因组关联研究（GWAS）所鉴定的绝大多数风险位点位于基因组的非编码区域。17功能注释研究表明，这些风险位点中有很大一部分可能作为增强子发挥作用18,19,20. MPRA 技术的应用 体内 可用于检测这些与风险相关的变异在大脑中的增强子活性12,21最后，在不同时间点进行递送和采集可以揭示增强子在发育过程中活跃的具体阶段。
增强子-报告基因质粒的设计具有多样性，可根据实验目的进行定制。在增强子研究中，已有多种最小启动子可供选择，例如人β-珠蛋白最小启动子22和小鼠Hsp68最小启动子23。这些启动子本身仅能驱动较低水平的表达，除非与增强子元件结合才能被激活。相比之下，组成型启动子元件可驱动转基因的强表达，适用于阳性对照，或用于在高表达背景下检测增强子功能。常用的组成型启动子包括CAG（一种源自鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒早期增强子的杂合启动子）24以及人EF1α启动子25。由于已知增强子可双向发挥作用26，因此增强子相对于最小启动子的方向和位置具有灵活性（图2A）。传统的增强子-报告基因检测通常将增强子置于启动子上游，在文库递送系统中，还在报告基因下游加入条形码序列，以便将测序读段与被测试的增强子相对应27。然而，增强子也可插入报告基因的开放阅读框内，并作为其自身的条形码序列，如STARR-seq方法中所采用的策略28。本文所述方案采用STARR-seq检测设计，将候选增强子序列插入报告基因的3'非翻译区（3' UTR）。尽管STARR-seq的构建方式在克隆操作上更为简便，但其机制相较于传统方法尚不明确，且可能在不同构建体之间引起RNA稳定性的差异。所描述的方法可通过克隆过程中的少量调整，轻松适配于STARR-seq或传统方向的构建方式，相关修改已在其他文献中有所描述27,29。
可采用不同的AAV递送方法，以进一步定制本技术，满足特定的实验目标（图2B）。本方案中进一步描述的直接颅内注射可将高浓度病毒直接递送至脑组织30。该方法在注射部位实现高转导效率，因此非常适合旨在最大化特定组织区域内转导细胞密度的实验。立体定位注射有助于在不同动物间标准化注射位点，从而实现可重复的局部转导。颅内注射在出生后早期动物中操作最为简便。作为替代方法，系统性注射可利用能够穿越血脑屏障的AAV血清型递送转基因31。尾静脉注射使病毒在全身循环，从而实现多个组织的广泛递送10。眶后注射是另一种系统性注射技术，将病毒注入眼后窦32。该方法为AAV从静脉系统进入脑组织提供了更直接的通路，相比注入更外周的血管，可在脑内实现更高浓度的转导细胞33。
该技术的另一个灵活之处在于其读出方法。总体而言，读出方法可分为基于报告基因和基于测序两类（图2C）。将荧光报告基因（如GFP）插入构建体的开放阅读框中，可在候选增强子驱动表达的任何转导细胞中表达荧光蛋白。免疫组织化学等标记与成像技术可实现信号放大。基于测序的读出方法则涉及从组织中收集的RNA中鉴定递送构建体的序列。通过定量最初递送的病毒DNA量，可比较表达的RNA与递送的DNA，从而确定待测增强子序列驱动转基因表达增强的能力，例如在大规模并行报告基因分析（MPRA）中的应用。MPRA显著拓展了这些技术的应用，可同时检测数千个候选增强子的活性，已在基因组学研究中被广泛描述12,27,34,35,36。通过批量而非单独进行候选增强子的克隆、包装、递送和测序步骤，可实现更高通量的筛选。
候选增强子的选择提供了另一种灵活性（图2D）。例如，该检测可用于鉴定特定基因的增强子，确定感兴趣非编码DNA区域的功能，或明确增强子在哪些特定细胞类型或发育阶段具有活性——这些目标在基础科学研究和疾病研究中均具有重要意义。通常，候选增强子的选择依赖于in silico对增强子活性的预测。常见的in silico预测包括针对提示可能为增强子的组蛋白修饰（如H3K27ac37）进行的ChIP-seq分析，以及染色质可及性图谱分析38。最后，一个日益增长的研究方向是对人工设计的增强子元件进行基于功能的筛选，从而推动对增强子序列如何决定其功能的研究39，并实现具有特定特性的增强子的设计40。

<table><tbody><tr><td>10x 柠檬酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9999-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>5'-gatcactctcggcatggac-3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A: 定制设计</td><td>用于转化后验证克隆的正向引物。这些引物针对实验中所用载体特异性设计。</td></tr><tr><td>5'-gatggctggcaactagaagg-3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A: 定制设计</td><td>用于转化后验证克隆的反向引物。这些引物针对实验中所用载体特异性设计。</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>VWR</td><td>VWRVN605-500G</td><td></td></tr><tr><td>吸液管组件</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td>用于口控递送重组腺相关病毒（rAAV）</td></tr><tr><td>细菌培养用培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389-5G</td><td></td></tr><tr><td>鸡IgY抗GFP抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10262</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM900</td><td>图像采集使用的是LSM800型号，但Zeiss近年来已推出LSM900型号以取代LSM800。</td></tr><tr><td>15 mL锥形离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>冷冻模具</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9806558</td><td>该模具适用于P28小鼠脑组织。其他尺寸可能更适合更大或更小的组织样本。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀，4.5&quot;</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>驴抗鸡AlexaFluor-488抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS 1x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MT21031CV</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL Eppendorf微量离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Falcon圆底管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>快绿染料</td><td>Grainger</td><td>F0099-1G</td><td></td></tr><tr><td>精细细节画笔套装</td><td>Artbrush Tower</td><td>B014GWCLFO</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed 质粒大提试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>12663</td><td>商业化质粒大提纯试剂盒</td></tr><tr><td>HyClone HyPure分子生物学级水</td><td>VWR</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>带12&quot;软管和25G针头的静脉输液蝶形套件</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26708</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td>无尘擦拭纸</td></tr><tr><td>LB琼脂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td>用于选择性培养基的LB琼脂预混粉</td></tr><tr><td>McPherson Vannas虹膜剪</td><td>Integra LifeSciences</td><td>360-215</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma Life Science</td><td>69794-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NEB Stable 感受态大肠杆菌</td><td>NEB</td><td>C3040I</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin凝胶与PCR产物纯化试剂盒</td><td>Takara</td><td>740609.5</td><td>用于酶促反应纯化和凝胶回收的试剂盒</td></tr><tr><td>OCT包埋介质</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>Cole Parmer</td><td>60-100</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR排管</td><td>VWR</td><td>490003-692</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Gilson</td><td>F155005</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II 高保真DNA聚合酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F549L</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Sunny Select</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart缓冲液</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>PacI、AscI和XmaI限制性酶切缓冲液</td></tr><tr><td>限制性内切酶：AscI</td><td>NEB</td><td>R0558L</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶：PacI</td><td>NEB</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶：XmaI</td><td>NEB</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>SOC扩增培养基</td><td>NEB</td><td>B0920S</td><td>转化后的恢复培养基</td></tr><tr><td>蔗糖（RNase/DNase-free）</td><td>Millipore Sigma</td><td>033522.5KG</td><td></td></tr><tr><td>TAE缓冲液</td><td>Apex</td><td>20-194</td><td></td></tr><tr><td>转移软管</td><td>Gilson</td><td>F1179941</td><td>用于蠕动泵</td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV质粒小提DNA纯化系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1460</td><td>质粒小提试剂盒</td></tr></tbody></table>

基于增强子的表达载体的aav递送 在体 小鼠脑中

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

增强子是多种转录因子的结合平台，可驱动组织和细胞类型特异性基因的特异性表达模式。多种评估非编码DNA及不同染色质状态的方法已被证明在预测基因组中增强子序列的存在方面具有实用价值，但验证这些序列的活性及其发挥作用的器官和发育阶段仍是一个劳动密集型过程。腺相关病毒（AAV）载体的最新进展使得外源基因能够广泛递送至小鼠组织，从而实现了 体内 无需转基因动物即可进行增强子活性检测。本实验方案展示了如何利用报告基因载体，在最小启动子（其本身不足以驱动显著表达）控制下表达EGFP，以研究候选增强子序列在小鼠脑中的活性模式。将包装为AAV的报告基因载体递送至小鼠脑内，孵育1–4周后处死动物，制备脑切片并在显微镜下观察。在增强子足以启动基因表达的细胞中可检测到EGFP信号，从而精确定位该增强子在脑内活跃的区域及其发育阶段。结合标准克隆技术、低成本AAV包装方法，以及不断拓展的AAV血清型和递送手段 体内 递送与标准成像读出使得该方法可用于研究脑内基因表达的调控机制。

利用这些方法，可获得与精神疾病风险相关的基因第三内含子中的915 bp序列 CACNA1C19,49,50 在出生后小鼠脑组织中检测了该序列的增强子活性。该序列是在一项针对345个以精神疾病和神经系统疾病风险SNP为中心的候选增强子序列的MPRA研究中发现的。12 以及表征实验在此作为一般示例进行描述。在出生后第0天（P0），将包装为自互补载体的AAV9构建体注射至C57BL/6小鼠体内51 在Hsp68最小启动子调控下含有EGFP及单个候选增强子序列（图3A）。另外一些小鼠被注射了含有阴性对照序列的构建体，该序列预计不具有调控活性（图3B）。这些构建体的病毒滴度已标准化为 6.85 x 1010 v...

本方案描述了一种基于重组腺相关病毒（rAAV）的瞬时增强子报告基因检测方法。该检测可用于诱导由增强子驱动的基因表达 体内 在小鼠大脑中。

基于增强子的表达载体的AAV递送 在体 小鼠脑中

增强子是多种转录因子的结合平台，可驱动组织和细胞类型特异性基因的特异性表达模式……

该方案具有重要意义，因为它不仅能够显示增强子序列是否可以驱动表达，还能显示其在机体特定部位中何处可以驱动表达。该方法快速高效，注射过程耗时不到10分钟，且在样本采集后仅需数天即可观察到报告基因是否表达及其表达位置。开始克隆时，选择或设计一个报告基因载体。此处使用的载体将增强子候选序列插入到EGFP报告基因的3'非翻译区，该报告基因在hsp68最小启动子的调控下表达。为扩增目标序列并将其克隆至载体中，需设计PCR引物，并在引物的5'端添加适用于Gibson克隆的相应同源臂。使用设计好的引物，从DNA样本中进行PCR扩增。根据所需克隆反应的数量，用Pac1和Asc1酶消化1至10微克的载体DNA。通过在100伏电压下进行0.7%至1%的凝胶电泳30至60分钟，分离限制性消化片段。切下线性化载体的条带，并使用商业化的胶回收试剂盒进行纯化。在完成Gibson克隆和细胞转化后，将细胞涂布于选择性培养基上，在37摄氏度条件下过夜培养。在确认报告基因载体成功克隆后，使用甘油菌种接种5毫升的预培养液。在30摄氏度、180转/分钟的摇床培养箱中培养8至16小时。当培养液变浑浊后，将种子培养物按1,000倍稀释于250至300毫升新鲜的选择性LB培养液中，并在30摄氏度、180转/分钟的摇床培养箱中过夜培养。使用商业质粒大提试剂盒纯化质粒。为了检测ITR的重组，进行Xma1酶切消化。观察条带，确保酶切结果显示预期数量的条带。重组将导致条带数量少于预期。准备用于递送的重组 AAV 混合物。若比较多种增强子报告病毒的表达模式，需将每种病毒稀释至其病毒滴度与浓度最低的病毒相等。将增强子报告病毒与组成型表达的对照报告病毒按2:1或3:1的比例混合。加入少量快绿染料，终浓度为0.06%。用镊子轻轻将由微升级刻度毛细管拉制而成的玻璃微量移液管尖端刺入洁净无絮的擦拭纸中，使其尖端断裂。将该移液管插入抽吸装置组件中，该装置连接有压力施加设备，并配有橡胶垫圈以固定微毛细移液管。通过吸液装置施加负压，将约 0.2 至 0.5 微升的矿物油吸入移液管中。将吸液装置组件放置一旁，待病毒溶液置于冰上直至准备注射。在对新生小鼠进行冷冻麻醉后，使用吸液装置组件施加负压，将病毒混合液吸入拉制的玻璃移液管中，直至弯月面超过 2 微升刻度线。将小鼠从冷室中取出，放置在实验台面上。找到双侧注射位点，该位点位于人字缝与前囟中点处，且处于矢状缝与双眼之间。使用酒精棉片对注射部位进行消毒。使用拉制的玻璃移液管刺穿新生小鼠的颅骨。当针头进入颅骨时，通过吸液装置施加正压。向侧脑室注入一微升病毒，并撤出移液管。将小鼠置于加热垫或加热舱中使其恢复。待动物苏醒后，将其放回饲养笼。使用5倍物镜以低倍率记录横跨脑切片的荧光图像。通过定位注射位点，根据红色荧光细胞的密度和强度评估病毒转导的范围。比较转导效果相似的动物。使用25倍以上的高倍物镜记录荧光图像。接下来，打开分析软件，应用 3×3 中值滤波器以减少噪声。单击“Process”菜单，然后单击“Noise”，选择“Despeckle”选项。随后，为从图像中减去背景荧光，首先将多通道图像的各通道分离。单击“图像”菜单，然后单击“颜色”，并选择“拆分通道”选项。使用矩形或圆形选区工具，在图像中无荧光细胞的区域绘制一个小形状。通过单击“分析”然后单击“测量”，测量背景的平均像素强度，并重复多次采样。从五到八个背景区域取平均灰度值，并舍去小数部分。选择“Process”菜单，点击“Math”然后选择“Subtract”，将该背景值从图像中每个像素的数值中减去。接着输入要减去的背景值，点击“确定”。如有需要，选择“Image”菜单，点击“Color”，然后选择“Merge Channels”，将各通道重新合并为一个多通道图像。为了计数绿色荧光细胞的数量，先隐藏绿色通道，然后使用自由选择工具在表达红色荧光的脑区周围绘制一个区域。点击“测量”功能，以测量所选区域内红色通道的面积、积分密度和平均灰度值。使用多点选择工具计数绿色细胞的数量，并将绿色细胞数量除以红色通道的积分强度进行归一化。在出生后第0天（P0）将增强子报告基因通过颅内注射导入小鼠体内，携带阳性AAV构建体的小鼠在注射后28天显示出皮层中下层由增强子驱动的EGFP表达。而在P0注射阴性对照构建体的小鼠在注射后28天未显示任何EGFP表达，表明该增强子元件可在小鼠脑中驱动EGFP的转录。为了可视化成功转导的区域并控制潜在的变异性，检测了不同滴度的AAV递送增强子报告基因文库。高滴度候选增强子文库在P7小鼠脑中驱动广泛的EGFP表达，而低滴度候选增强子文库则驱动稀疏的CGFP表达。每次注射时，必须将增强子报告AAV与阳性对照混合，以区分无活性的增强子与注射失败的情况。该方法可与免疫组织化学、RNA FISH或单细胞RNA测序相结合，以确定增强子在哪些细胞类型中具有活性。

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基于增强子的表达构建体在小鼠 大脑中的 AAV部署

介绍了一种在出生后大脑中测试基因功能的体内方法。将表达Cre和/或荧光蛋白的重组AAV注射到新生小鼠大脑中。通过实现基因的嵌合失活和稀疏神经元标记，可快速分析基因在神经环路发育关键过程中所发挥的功能。...

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新生小鼠脑纹状体细胞基因操作的立体定位手术

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腹侧被盖区谷氨酸能神经末梢在海马中的体内解剖与功能联合示踪

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利用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向的视网膜细胞群体进行神经元分支的延时成像

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清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

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脉络丛中基因的靶向敲低

本文介绍了一种基于悬浮培养HEK293细胞的腺相关病毒（AAV）生产方案，该方法利用商业供应商提供的可用于研究目的的组分，减少了病毒载体生产所需的时间和劳动投入。...

利用HEK293悬浮细胞生产高产量腺相关病毒载体批次

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用于研究缺血性脑卒中亚急性期和慢性期转导细胞中 Neurod1 异位表达的 AAV 系统与小鼠模型

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用于增强基因递送的间充质干细胞膜包被纳米囊泡的开发

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基于增强子的表达载体的AAV递送在体小鼠脑中

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