利用基于病毒的Cre重组马赛克产后小鼠脑开发基因功能分析
2011年8月1日
一个在体内产后脑的方法来测试基因功能描述。表达CRE和/或荧光蛋白的重组自动增值服务注入新生小鼠大脑。马赛克基因的失活和稀疏的神经标签实现，使神经电路的发展过程的关键基因功能的快速分析。
该程序的总体目标是在大脑发育的出生后期间纵基因功能。这是通过首先选择和制备适当的病毒，将它们装入注射器并准备注射设备来实现的。然后将病毒注射到新生小鼠幼崽的大脑中，最后一步是牺牲动物并对注射区域进行成像。
最终，可以获得通过免疫荧光显微镜检查显示对照细胞和敲除细胞的差异标记的结果。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如出生后发育期如何受到遗传调节。对于注射，可以使用全滴度（通常为每毫升 10 到 12 个基因组拷贝）的市售腺相关病毒溶液来作大量细胞。
如果需要稀疏或标记，请从 1 到 10 的稀释开始。在冰上解冻病毒后，立即将预稀释体积转移到无菌的 250 μL PCR 管中。将稀释液保存在冰上。现在。
选择合适的注射器并将其连接到加载针头，以准备注射泵。接下来，轻轻吸取病毒溶液，直到在注射器中看到非常小的气泡，并且可以使用惰性上样染料来简化此步骤。现在用固定器将注射器固定到泵上。
然后在注射器和针架之间轻轻连接结缔管。确保注射针与持针器内部的结缔管直接接触。现在，慢慢地将溶液穿过结缔管，直到在针尖可以看到一小滴溶液。
用泵上的支架小心地将柱塞固定在推杆块旁边。将进样速率设置为每分钟 8 微升，并将进样体积设置为 1 到 2 微升之间。然后调整泵注射器直径设置以匹配您正在使用的注射器的直径。
最后，为了在恢复阶段保护幼犬，将热板设置为 38 摄氏度并用纸巾盖住。使用 IACUC 批准的方案，通过对 P zero 或 P 1 小鼠幼崽进行冷麻醉来准备注射。用水弄湿几张纸巾，然后将它们放在冰上。
然后将四五只幼崽放在纸巾上，分开。将纸巾折叠在幼犬上，轻轻地将少量碎冰放在纸巾上，然后将幼犬孵育约五分钟。幼崽可以安全地在冰上保存长达 15 分钟，并且仍然可以很好地恢复。
现在将麻醉的小狗放在安装块上，以便最好地进入注射部位。例如，将动物平放在腹部最容易接触到皮层。可以使用创可贴将幼犬固定到位，手动稳定幼犬的头部并拉紧皮肤以防止其移动。
然后浏览颅骨的解剖标志，如 lambda 缝合线，并用另一只手选择一个可重复的注射点，轻轻地将针头插入颅骨。如果针头不容易穿透颅骨，请不要用力推动。相反，请重新定位针头并轻轻重试。
注射深度因个体动物和皮层菌株而异，半毫米到一毫米的深度通常有效。现在，通过让同事启动泵来注射病毒溶液，以尽量减少手部运动。理想情况下，注射后可以使用脚踏板来启动泵。
将针头保持在原位几秒钟，然后保持幼犬的头部平稳静止。将针滑出。现在，让幼犬在有盖的热板上恢复 5 到 10 分钟。
在此期间，继续注射其他幼崽。当幼崽都恢复了粉红色并都开始活动时，用它们家的一部分被褥轻轻擦拭它们。只有这样，他们才能回到母亲身边。
否则，它们可能会被视为不熟悉的幼崽，在幼崽被送回母亲身边后，母亲很可能会杀死它们。通过用丙酮或 70% 乙醇完全装入注射器来清洁注射装置。如果使用丙酮敏感成分（如 sano、acurate、粘合剂），请使用新鲜溶液通过进样装置冲洗溶液数次。
这将去除任何残留的病毒溶液，沉淀物溶剂将蒸发。冲洗装置后，对漂白剂的工作区域进行消毒，以便为下一位实验人员做好准备。导师。成功的技术在注射部位产生强烈的神经元感染。
注射到特定区域（如皮层和上丘）通常会产生局部感染，并且对邻近区域的扩散最小。使用高滴度病毒溶液会使邻近区域如海马体的感染，更有可能注射低滴度病毒溶液。导致稀疏感染通常在注射部位附近，如中线的小脑注射，感染的细胞数量应与注射病毒溶液的滴度相关。
例如，将表达不同荧光蛋白的两种 R AAV 8 病毒的高滴度溶液混合物注射到小脑中，会感染许多差异标记的金字细胞。相反，注射低滴度病毒溶液会导致稀疏感染，以帮助可视化单个细胞。荧光标记的神经元可以直接在新鲜切割的活组织中观察到，也可以进行免疫染色。
这增强了内源性荧光信号，以便以后通过宽场或共聚焦荧光显微镜进行图像采集。最后，RAAV eight 能够感染皮层中的各种神经元类型，并强烈标记精细过程一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约 30 分钟内完成。
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概述
本文描述了一种使用重组AAV进行体内测试基因功能的方法，该方法适用于出生后大脑发育期间。通过将这些病毒注射到新生小鼠的大脑中，研究人员可以实现基因马赛克失活和稀疏的神经元标记，从而便于分析基因功能在神经回路发育中的作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因功能
- 神经回路发育
背景
- 了解基因在出生后大脑发育期间的功能至关重要。
- 重组AAV可用于操控基因表达。
- 该方法允许研究关键发育时期的基因调控。
- 免疫荧光显微镜可以区分对照和敲除细胞。
研究目的
- 操控出生后大脑发育期间的基因功能。
- 研究遗传因素如何调控出生后的神经发育。
- 提供有关神经回路形成机制的洞见。
使用的方法
- 选择和准备适当的重组AAV。
- 将病毒注射到新生小鼠幼崽的大脑中。
- 使用免疫荧光显微镜对注射区域进行成像。
- 分析对照和敲除细胞的差异标记。
主要结果
- 成功实现基因失活和神经元标记。
- 结果展示了出生后发育的基因调控。
- 该方法为未来的神经科学研究提供了框架。
- 获得的洞见可以帮助理解神经回路动力学。
结论
- 该方法对于研究发育中大脑的基因功能是有效的。
- 研究结果有助于理解神经回路发育。
- 未来的研究可以在此方法的基础上探索基因对行为的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, scalable interrogation of gene function in postnatal brain development, addressing a critical gap in target validation for neurodevelopmental disorders. By bypassing embryonic lethality constraints, it supports mechanistic de-risking of therapeutic targets in pathways relevant to autism and schizophrenia. The approach provides predictive confidence in target selection by linking genetic perturbation to circuit-level phenotypes in a physiologically relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in postnatal neural circuits where many neurodevelopmental disorder genes exert their effects.
- Operational Value: Achieves mosaic gene inactivation and sparse labeling within days, avoiding months-long conditional mouse model generation.
- Scientific Value: Supports cell-autonomous functional analysis of genes implicated in axonal growth, dendritic tiling, and synapse refinement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively comparable control and knockout cell populations via differential fluorescent labeling for side-by-side phenotypic assessment.
- Operational Value: Permits titration of viral titer to modulate infection density, enabling scalable sparse or dense labeling as needed for downstream assays.
- Scientific Value: Compatible with immunofluorescence and electrophysiology readouts, facilitating multimodal validation of target engagement and circuit impact.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models postnatal genetic perturbation in mice and rats, aligning with the developmental timing of human neuropsychiatric disorder onset.
- Operational Value: Extends to lentiviral delivery and shRNA/dominant-negative constructs, broadening target modulation toolkit for preclinical validation.
- Scientific Value: Enables study of gene function in critical processes like synapse formation, directly relevant to pathophysiological mechanisms in psychiatric disorders.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting target validation and lead identification by providing causal genetic evidence in postnatal neural circuits prior to compound screening.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by deleting candidate genes in defined brain regions to assess phenotypic consequences on neural circuit maturation.
- Screening: Produces standardized, reproducible neuronal preparations with internal controls (labeled vs. unlabeled cells) for reliable compound effect measurement.
- Analytics: Generates quantitative imaging and electrophysiology readouts that enable statistical comparison of genotypes and treatment conditions.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to circuit-level outcomes, supporting biomarker-aligned preclinical validation of target modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable viral delivery platform applicable across multiple gene targets and brain regions, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking postnatal gene loss to specific circuit phenotypes.
- Operational Value: Standardizes gene perturbation via viral delivery, improving reproducibility across laboratories and studies.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions by rapidly establishing genetic causality in disease-relevant postnatal windows.
- Portfolio Impact: De-risks target advancement by providing functional evidence in systems that model human neurodevelopmental timing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal mouse handling, stereotaxic injection, and viral biosafety protocols.
- Dependent on access to purified recombinant AAV or lentiviral vectors and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of viral titer, injection volume, and anesthesia procedures for cross-study consistency.
- Adaptation to different brain regions or species may require optimization of injection coordinates and viral serotype tropism.
- Practical limitation: Efficacy depends on Cre recombinase efficiency and floxed allele availability, which may vary across targets.
