利用基于病毒的Cre重组马赛克产后小鼠脑开发基因功能分析

该程序的总体目标是在大脑发育的出生后期间纵基因功能。这是通过首先选择和制备适当的病毒，将它们装入注射器并准备注射设备来实现的。然后将病毒注射到新生小鼠幼崽的大脑中，最后一步是牺牲动物并对注射区域进行成像。

最终，可以获得通过免疫荧光显微镜检查显示对照细胞和敲除细胞的差异标记的结果。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如出生后发育期如何受到遗传调节。对于注射，可以使用全滴度（通常为每毫升 10 到 12 个基因组拷贝）的市售腺相关病毒溶液来作大量细胞。

如果需要稀疏或标记，请从 1 到 10 的稀释开始。在冰上解冻病毒后，立即将预稀释体积转移到无菌的 250 μL PCR 管中。将稀释液保存在冰上。现在。

选择合适的注射器并将其连接到加载针头，以准备注射泵。接下来，轻轻吸取病毒溶液，直到在注射器中看到非常小的气泡，并且可以使用惰性上样染料来简化此步骤。现在用固定器将注射器固定到泵上。

然后在注射器和针架之间轻轻连接结缔管。确保注射针与持针器内部的结缔管直接接触。现在，慢慢地将溶液穿过结缔管，直到在针尖可以看到一小滴溶液。

用泵上的支架小心地将柱塞固定在推杆块旁边。将进样速率设置为每分钟 8 微升，并将进样体积设置为 1 到 2 微升之间。然后调整泵注射器直径设置以匹配您正在使用的注射器的直径。

最后，为了在恢复阶段保护幼犬，将热板设置为 38 摄氏度并用纸巾盖住。使用 IACUC 批准的方案，通过对 P zero 或 P 1 小鼠幼崽进行冷麻醉来准备注射。用水弄湿几张纸巾，然后将它们放在冰上。

然后将四五只幼崽放在纸巾上，分开。将纸巾折叠在幼犬上，轻轻地将少量碎冰放在纸巾上，然后将幼犬孵育约五分钟。幼崽可以安全地在冰上保存长达 15 分钟，并且仍然可以很好地恢复。

现在将麻醉的小狗放在安装块上，以便最好地进入注射部位。例如，将动物平放在腹部最容易接触到皮层。可以使用创可贴将幼犬固定到位，手动稳定幼犬的头部并拉紧皮肤以防止其移动。

然后浏览颅骨的解剖标志，如 lambda 缝合线，并用另一只手选择一个可重复的注射点，轻轻地将针头插入颅骨。如果针头不容易穿透颅骨，请不要用力推动。相反，请重新定位针头并轻轻重试。

注射深度因个体动物和皮层菌株而异，半毫米到一毫米的深度通常有效。现在，通过让同事启动泵来注射病毒溶液，以尽量减少手部运动。理想情况下，注射后可以使用脚踏板来启动泵。

将针头保持在原位几秒钟，然后保持幼犬的头部平稳静止。将针滑出。现在，让幼犬在有盖的热板上恢复 5 到 10 分钟。

在此期间，继续注射其他幼崽。当幼崽都恢复了粉红色并都开始活动时，用它们家的一部分被褥轻轻擦拭它们。只有这样，他们才能回到母亲身边。

否则，它们可能会被视为不熟悉的幼崽，在幼崽被送回母亲身边后，母亲很可能会杀死它们。通过用丙酮或 70% 乙醇完全装入注射器来清洁注射装置。如果使用丙酮敏感成分（如 sano、acurate、粘合剂），请使用新鲜溶液通过进样装置冲洗溶液数次。

这将去除任何残留的病毒溶液，沉淀物溶剂将蒸发。冲洗装置后，对漂白剂的工作区域进行消毒，以便为下一位实验人员做好准备。导师。成功的技术在注射部位产生强烈的神经元感染。

注射到特定区域（如皮层和上丘）通常会产生局部感染，并且对邻近区域的扩散最小。使用高滴度病毒溶液会使邻近区域如海马体的感染，更有可能注射低滴度病毒溶液。导致稀疏感染通常在注射部位附近，如中线的小脑注射，感染的细胞数量应与注射病毒溶液的滴度相关。

例如，将表达不同荧光蛋白的两种 R AAV 8 病毒的高滴度溶液混合物注射到小脑中，会感染许多差异标记的金字细胞。相反，注射低滴度病毒溶液会导致稀疏感染，以帮助可视化单个细胞。荧光标记的神经元可以直接在新鲜切割的活组织中观察到，也可以进行免疫染色。

这增强了内源性荧光信号，以便以后通过宽场或共聚焦荧光显微镜进行图像采集。最后，RAAV eight 能够感染皮层中的各种神经元类型，并强烈标记精细过程一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约 30 分钟内完成。