Name: 利用基于病毒的Cre重组马赛克产后小鼠脑开发基因功能分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 了解利用重组腺相关病毒在小鼠产后脑发育中进行基因功能分析的方法。通过向新生小鼠脑内注射病毒，实现马赛克基因失活和稀疏神经元标记，结合免疫荧光显微镜成像，为神经回路发育研究提供重要框架。

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本工作由美国国立卫生研究院（NINDS）的RO1基金资助。

1. 准备用于注射的病毒
<ol>
 <li>重组腺相关病毒（rAAVs）可从推荐的商业供应商处购买，也可在实验室自行制备（见下文讨论）。病毒溶液的滴度通常为每毫升约 1×1012 基因组拷贝（GC/ml），可直接使用原液以操控大量细胞。或者，也可将其稀释以实现所需程度的稀疏标记。具体稀释比例需由使用者自行确定，但建议起始稀释比例为 1:10。</li>
 <li>使用前立即将病毒置于冰上解冻。将所需体积的未稀释病毒溶液转移至一个小型（约 250 μl）PCR 管中。在组织培养超净台中，用适量无菌 DPBS 稀释病毒溶液。稀释后的病毒溶液应置于冰上保存，直至使用。</li>
</ol>
注意：所有病毒的操作均应根据您所在机构批准的生物安全规程进行
2. 注射器装填与设备组装
<ol>
 <li>将上样针连接至玻璃注射器，并通过轻柔拉动活塞从 PCR 管中吸取病毒溶液。持续拉动活塞，直至注射器内可见一个微小的气泡；这表明所有溶液均已进入注射器，未残留在上样针中。或者，可在溶液中加入少量惰性染料以使其更易观察。 
 注意：应使用小型 PCR 管，因为上样针通常不够长，无法触及大多数其他类型试管的底部。</li>
 <li>取下上样针，将注射器放置于注射泵的注射器支架上，并用注射器固定夹将其固定。</li>
 <li>将连接管的一端轻轻插入注射器，另一端插入针头夹持器中。随后将注射针插入针头夹持器内，确保注射针末端与连接管在针头夹持器内部直接接触。</li>
 <li>手动缓慢推动活塞，使溶液流经连接管，直至在注射针尖端可见一微小液滴。</li>
 <li>小心将活塞移至推块附近，并使用推块支架将其固定到位。</li>
 <li>设定注射参数：注射速率应约为 8μl/min (˜130nl/s)；注射体积通常为 1–2μl；根据所用注射器的尺寸选择合适的注射器直径（参见注射泵使用手册中的指导说明）。</li>
 <li>将加热板温度设置为 ˜38°C，并覆盖纸巾或其他薄层屏障，以在幼崽恢复期间对其进行保护。</li>
</ol>
3. 注射操作与仔鼠恢复
<ol>
 <li>根据IACUC批准的方案，通过低温麻醉准备P0或P1小鼠幼崽用于注射。将几张纸巾沾湿后置于冰上。将所需数量的小鼠幼崽（4-5只）放在纸巾上（保持充分分离），然后轻轻将纸巾折叠覆盖在幼崽上方。在纸巾上轻轻放置少量碎冰，将幼崽孵育约5分钟。幼崽可在冰上保持最多15分钟，之后可正常恢复。</li>
 <li>当幼崽充分麻醉后，将其放置在固定块上（我们使用通常用于放置15 ml离心管的泡沫块），并调整位置以便于接近注射部位。对于大脑皮层注射，最方便的是将动物平趴在腹部；而对于小脑注射，则建议将幼崽头部置于固定块边缘，以便更好地接近颅骨后部。如有需要，可用创可贴将幼崽固定在原位。</li>
 <li>一只手固定幼崽头部，另一只手手动将针头插入颅骨目标位置。注射时拉紧皮肤有助于防止其移动。对于皮层注射，建议以明确的解剖标志（如颅骨的人字缝）为参照进行定位，这有助于后续重复注射。小脑可通过颅骨观察到，表现为位于丘脑后方的一条细长组织带。针头插入深度在不同个体和品系间略有差异，可通过针头上预设的刻度标记进行判断；然而，对于皮层和小脑，我们发现从表面下约0.5–1 mm的深度通常较为合适。其他注射位点的插入深度应由最终使用者通过实验确定。 
 注意：针头应能轻松穿透颅骨；若无法穿透，请勿用力过猛，以免损伤动物。应重新调整针头位置并轻柔地再次尝试。</li>
 <li>注射病毒溶液。根据所用压力注射仪的型号，通过按压泵上的“START”按钮或踩下脚踏开关来启动注射。若无脚踏开关，建议由同事协助按压按钮，以尽量减少可能影响注射效果的额外手部动作。</li>
 <li>在注入预定体积后，保持针头静止数秒钟，然后平稳地轻轻拔出针头。务必固定幼崽头部以减少不必要的移动。由于注射设备在每次实验之间均使用乙醇清洁和消毒，且伤口较小，因此无需使用抗菌剂。</li>
 <li>将幼崽放置在温度设定为约38°C的加热板上，以促进其恢复，通常需要5–10分钟。在此期间，可继续对其他幼崽进行注射。</li>
 <li>待所有幼崽恢复后（应呈现粉红色并开始活动），取部分原笼垫料轻轻擦拭幼崽身体，然后将它们成组归还给母鼠。</li>
</ol>
注意：在将幼崽放回母鼠前，必须确保幼崽保持温暖并已接触过巢穴垫料，且应将它们成组放回。若不这样做，可能导致母鼠伤害或杀死幼崽。
4. 仪器设备清洁
<ol>
 <li>注射完成后，将幼崽放回母鼠身边，用丙酮或70%乙醇完全充满注射器以清洗注射装置。每次使用新鲜溶液，反复冲洗注射装置数次。此步骤可清除残留的病毒溶液及沉淀物。丙酮或乙醇随后会自然挥发。 
 注意：推荐使用丙酮进行清洗，但如果装置中含有对丙酮敏感的组件（如氰基丙烯酸酯类胶粘剂），则应使用70%乙醇完成这些步骤。</li>
 <li>用漂白剂对工作区域进行消毒，并将废弃物丢弃至适当的生物危害容器中。</li>
</ol>
5. 分析
<ol>
 <li>使用经 IACUC 批准的安乐死方法在所需年龄处死动物。建议进行灌注固定，以利于后续感染神经元的可视化，尤其是在成年动物中。</li>
 <li>可采用标准免疫染色程序以增强荧光信号。简言之，将 100 μm 的游离振动切片在 PBS + 1% Triton X-100 中通透，并在 PBS + 1% Triton X-100 + 10% 正常山羊血清中封闭。切片于封闭液中与一抗在 4°C 下孵育过夜，随后进行额外的洗涤和封闭。然后将切片在封闭液中与二抗于室温孵育 2 小时，充分洗涤后贴附于载玻片上，并用抗荧光淬灭封片介质加盖盖玻片。冷冻切片也可用于观察标记的神经元，但内源性荧光可能会丢失。</li>
</ol>
6. 典型结果：
成功的注射操作将在注射部位区域实现神经元的高效感染，且不会对动物造成可观察到的组织损伤或其他不良影响。如图1所示，在不同解剖位点注射rAAV8-Cre后，可在Cre报告基因小鼠（ROSA26R）12中观察到感染的扩散情况。向特定脑区（如皮层和上丘）注射通常产生局部感染，向邻近区域的扩散极少（图1A-B）。使用高滴度病毒溶液会增加对邻近区域（如海马）的感染可能性（图1A）。而低滴度病毒溶液注射则导致稀疏感染，感染通常局限于注射位点附近，如在ROSA26R报告基因小鼠中线处小脑注射rAAV8-Cre所示（图1C-D）。我们观察到，在注射rAAV8-Cre后2天内，ROSA26R报告基因小鼠中即可发生基因重组，表明感染、重组及报告基因的表达均可迅速发生。此外，我们已成功应用该技术研究在非ROSA位点使用floxed条件等位基因进行基因敲除的效果，相关结果将另文发表。
感染的细胞数量应与注射病毒溶液的滴度相关。例如，将两种表达不同荧光蛋白的高滴度rAAV8病毒混合后注射至小脑，可感染大量不同标记的浦肯野细胞（图2A）。相反，注射低滴度病毒溶液则可实现稀疏感染，有助于单个细胞的观察（图2B）。荧光标记的神经元可直接在新鲜切开的活体组织中观察（图2B），也可通过免疫染色增强内源性荧光信号，以便后续使用宽场或共聚焦荧光显微镜成像（图2A，图3A-C）。最后，rAAV8能够感染大脑皮层中多种类型的神经元，并对细小突起实现强效标记（图3A-C）。
<img alt="胚胎脑组织的组织学分析；显微镜图像；细胞分化研究。" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1：在出生后第 0 天（P0）注射了 rAAV8-Cre 的 ROSA26R 报告小鼠脑组织中的 LacZ 染色，显示 Cre 活性及感染位置。
<ol type="A">
 <li>对 P14 小鼠脑组织进行的大视野矢状面观察，显示向大脑皮层和上丘注射了高滴度（1x1012 GC/ml）病毒。使用高滴度病毒会增加邻近区域同时被感染的可能性。</li>
 <li>P14 小鼠皮层的矢状切面，注射病毒滴度较低（1x1011 GC/ml），显示感染范围局限，扩散较少。</li>
 <li>在中线位置注射低滴度（1x109 GC/ml）病毒溶液的 P28 小鼠小脑整体标本观察显示，感染细胞稀疏，通常局限于注射位点附近。</li>
 <li>对应于 C 项中小脑中线的矢状面视图。需要注意的是，rAAV8 通常仅感染浦肯野细胞。</li>
</ol>
<img alt="显微成像：荧光标记的神经元，神经元结构可视化，实验结果。" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：通过注射高滴度和低滴度表达荧光蛋白的 rAAV8 实现小脑标记。
<ol type="A">
 <li>表达EGFP（绿色）和DsRed（红色）的两种病毒混合感染的P21小脑矢状切面。使用高滴度病毒混合液感染大量浦肯野细胞。</li>
 <li>来自极低滴度病毒感染的活体P14小脑中的浦肯野细胞，在解剖后立即进行成像。</li>
</ol>
<img alt="荧光显微镜下的神经元结构；红色荧光突出显示神经元形态。" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：rAAV8-DsRed对皮层的标记。 
P0时感染rAAV8-DsRed的P21皮层冠状切片中多种皮层神经元类型的示例。

<ol><li>Geschwind, D. H., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autism+spectrum+disorders%3A+developmental+disconnection+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).</li>
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<li>Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍的新生儿病毒注射方法为研究出生后大脑发育提供了一种简单且快速生成体内嵌合体的途径。该方法可利用目前已有的或通过高通量基因靶向项目正在构建的条件性等位基因6。与使用转基因表达Cre重组酶的方法相比，该技术能够更快速地在多种细胞类型中检测基因功能，因为携带条件性等位基因的小鼠可直接用于实验，且整个病毒注射过程从开始到结束可在一小时内完成。此外，通过调整病毒滴度可轻松控制被感染细胞的数量，从而实现对单个神经元的稀疏标记。尽管示例图像中仅展示了神经元形态，但对感染神经元的分析可进一步扩展至许多重要的发育过程，包括轴突和树突的生长、分支与拼接，以及突触发育（如树突棘形态发生）等。
该操作过程中最关键的三个环节是注射位点的定位准确性、注射设备的可靠性以及幼鼠的存活率。第一个方面——准确性——需要通过实践经验来掌握。注射设备的可靠性是指在注射前必须确保设备无堵塞、泄漏或其他问题。最后，只要遵循步骤3.7中提到的注意事项，幼鼠的存活通常不会出现问题。
该方案的一个明显改进是使用表达不同基因的病毒...

<table><tbody><tr><td>rAAV8-Cre、-GFP、-DsRed</td><td>Vector Biolabs</td><td>#7060、#7061、定制订单</td><td>http://www.vectorbiolabs.com</td></tr><tr><td>Harvard Pump 11 Plus</td><td>Harvard Apparatus</td><td>#702208</td><td>（无脚踏开关接口）</td></tr><tr><td>视网膜色素上皮注射套件</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>RPE-KIT</td><td>包含连接管路、注射针头（36G）和针头夹持器</td></tr><tr><td>NanoFil 注射器，100&amp;mu;l</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NANOFIL-100</td><td>包含可重复使用的加样针</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>GFP 抗体</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>DsRed 抗体</td><td>Clontech Laboratories</td><td>632496</td><td></td></tr><tr><td>加热模块</td><td>VWR international</td><td>97042-610</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>003309</td><td></td></tr></tbody></table>

利用基于病毒的cre重组技术对小鼠出生后脑发育中基因功能进行嵌合体分析

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

正常的大脑功能不仅依赖于胚胎发育阶段主要神经元通路的建立，也依赖于出生后神经回路的成熟与精细调节。此阶段的调控异常可能导致自闭症和精神分裂症等神经及精神类疾病1,2。许多基因已在产前大脑中被研究，并发现对多种发育过程至关重要3-5。然而，这些基因在出生后大脑中的功能在很大程度上仍不清楚，部分原因是这些基因在小鼠中的敲除通常导致新生期致死，另一部分原因是它们在早期发育中的必要性阻碍了对出生后阶段的分析。为克服这些障碍，目前正通过构建这些基因的条件性等位基因（floxed alleles）的小鼠模型来解决这一问题6。当与表达Cre重组酶的转基因等位基因小鼠杂交时，可实现特定细胞类型中的条件性基因敲除，从而研究基因在出生后大脑中的功能。然而，该方法需要引入额外的等位基因，并耗费额外时间（3–6个月）以获得合适基因型的小鼠，从而限制了在小鼠大脑中大规模开展遗传学分析的应用。
本文展示了一种互补性方法，利用病毒表达的Cre重组酶，对出生后大脑发育过程中这些带loxP位点的等位基因进行快速、系统的分析。通过将编码Cre的重组腺相关病毒（rAAVs）7,8 注射到新生动物脑内，我们能够在脑的不同区域特异性地敲除目标基因。通过调控病毒滴度并共表达荧光蛋白标记物，可同时实现基因的嵌合性失活和稀疏神经元标记。该方法规避了众多基因在早期发育中的必需性问题，使我们能够研究这些基因在出生后大脑发育多个关键过程中所发挥的细胞自主性功能，包括轴突和树突的生长、分支与覆盖，以及突触的形成与精细调节。本方法已在我们实验室（未发表结果）及其他研究团队8,9 中成功应用，并可拓展至其他病毒系统，如慢病毒9，也可用于表达shRNA或显性活性蛋白10。此外，将该技术与电生理学以及近期发展的光学成像工具11 相结合，为研究遗传通路如何影响小鼠和大鼠神经环路的发育与功能提供了新的策略。

介绍了一种在出生后大脑中测试基因功能的体内方法。将表达Cre和/或荧光蛋白的重组AAV注射到新生小鼠大脑中。通过实现基因的嵌合失活和稀疏神经元标记，可快速分析基因在神经环路发育关键过程中所发挥的功能。

利用基于病毒的Cre重组技术对小鼠出生后脑发育中基因功能进行嵌合体分析

正常的大脑功能不仅依赖于胚胎发育阶段主要神经元通路的建立，还依赖于出生后发育阶段……

本实验的总体目标是在出生后脑发育阶段操控基因功能。首先选择并制备合适的病毒，将其装入注射器并准备注射设备；随后将病毒注射到新生小鼠幼崽的脑内；最后一步是处死动物并对注射区域进行成像。最终，可以通过免疫荧光显微镜获得显示对照细胞和基因敲除细胞差异标记的结果。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如出生后发育阶段是如何受到遗传调控的。对于注射，可使用市售的腺相关病毒溶液，其滴度通常为每毫升10的12次方个基因组拷贝，以操控大量细胞。如果需要进行稀释或标记，可从1到10倍的稀释开始。将病毒在冰上解冻后，立即转移预稀释体积至无菌的250微升PCR管中。将稀释液保持在冰上。通过选择合适的注射器并将其连接至装样针头来准备注射泵。接着，轻柔吸取病毒溶液，直至在注射器中观察到一个非常小的气泡，可使用惰性装样染料使此步骤更简便。现在，用固定夹将注射器固定在泵上。然后轻轻地将连接管连接在注射器和针头夹持器之间。确保注射针与针头夹持器内部的连接管直接接触。接着缓慢推动溶液通过连接管，直至针尖处出现微小液滴。使用泵上的支架将柱塞紧靠推块固定。将注射速率设置为每分钟八微升，并将注射体积设置为一至二微升之间。然后调节泵的注射器直径设定值，以匹配所用注射器的直径。最后，为了在恢复期间保护幼鼠，将加热板设置为 38 摄氏度，并用一张纸巾覆盖。根据 IACUC 批准的实验方案，通过低温麻醉处理零日龄（P zero）或一日龄（P one）小鼠幼崽，以准备注射。将几张纸巾用水浸湿后置于冰上。然后将四到五只幼鼠放在纸巾上，彼此充分分开。轻轻将纸巾折叠覆盖在幼鼠上，在纸巾上方放置少量碎冰，并将幼鼠冰浴约五分钟。幼鼠在冰上可安全保存长达15分钟，仍能良好恢复。现在将一只麻醉后的幼鼠放置在固定板上，以便最佳地接触注射部位。例如，将动物腹部朝下平放，可最方便地接触大脑皮层。可用创可贴将幼鼠固定在原位，用手稳定幼鼠头部，并拉紧皮肤以防止其移动。然后定位颅骨的解剖学标志，如人字缝，并用另一只手选择一个可重复的注射点，轻柔地将针头穿过颅骨。如果针头不能轻易穿透颅骨，不要用力推进。相反，应重新调整针头位置，并再次轻柔尝试。注射深度因动物个体和品系的不同而略有差异，对于皮层而言，通常深度为0.5至1毫米即可。现在，由一位同事启动泵以注入病毒溶液，从而尽量减少手部移动。理想情况下，可在注射完成后使用脚踏开关启动泵。保持针头位置数秒钟，然后在固定幼鼠头部不动的情况下平稳地抽出针头。现在，将幼鼠置于覆盖的加热板上，使其恢复5到10分钟。在此期间，继续对其他幼崽进行注射。待所有幼崽恢复粉红色外观且均能活动时，用其原窝垫料轻轻擦拭幼崽身体，之后方可将其放回母鼠身边。否则，它们可能会被视为陌生幼崽，母鼠在幼崽被放回后很可能会将其杀死。用丙酮或70%乙醇完全填充注射器，以清洗注射装置。如果使用了对丙酮敏感的部件（如sano

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利用基于病毒的Cre重组马赛克产后小鼠脑开发基因功能分析

介绍了一种追踪突触连接神经元的方法。我们利用上游细胞中TVA的特异性，检测目标细胞群体是否接收来自基因定义细胞类型的突触输入。...

基因定义神经环路的病毒示踪

病毒载体可实现靶向基因操作。本文演示一种在小鼠脊髓中进行条件性基因表达或基因剔除的方法，通过立体定位注射将病毒载体注入脊髓背角，此处是初级躯体感觉传入神经与中枢神经系统神经元之间突触联系的重要部位。...

在小鼠脊髓中进行病毒载体的立体定位注射以实现条件性基因操作

本文展示了一种通过向新生小鼠脑内脑室内注射腺相关病毒实现广泛神经元转导的技术。该方法可快速、简便地实现病毒递送的转基因在生命全程中的持续表达。...

新生小鼠脑室内病毒注射以实现持续且广泛的神经元转导

利用一种双元遗传策略，我们提供了一种详细的神经环路示踪实验方案，适用于在Cre介导的重组后表达互补性跨突触示踪剂的小鼠。由于细胞特异性的示踪剂表达由基因编码决定，本实验方法可在单细胞分辨率下研究小鼠胚胎脑发育过程中神经环路的形成与成熟。...

胚胎小鼠大脑中的条件性遗传跨突触示踪

本文介绍了一种基于慢病毒颗粒的方法，用于对成年动物脑内室-脑室下区神经发生微环境中神经干细胞和/或其邻近的室管膜细胞进行长期遗传修饰，从而能够分别分析细胞自主性及非自主性、依赖微环境的效应在神经干细胞中的作用。...

成年小鼠脑室-脑下室区细胞的稳定高效遗传修饰用于分析神经干细胞自主性与非自主性效应

本方案提供了直接观察径向迁移皮层神经元的操作指南。In utero...

In Utero 电穿孔法结合脑片培养对小鼠胚胎脑中迁移神经元进行延时共聚焦成像

通过在稀疏分布的细胞群体中诱导基因的缺失或获得功能，可研究基因在脑内的细胞自主性功能。本文描述 在体 电穿孔法递送 Cre 重组酶至具有 floxed 基因的稀疏发育期皮层神经元以实现基因功能缺失 在体内.

通过诱导小鼠大脑皮层中的 Cre-lox 重组 子宫内 电穿孔

我们描述了一种使用自制固定装置进行立体定位手术的方案，用于将试剂微量注射到新生小鼠脑的纹状体中。该技术可实现对新生小鼠脑特定区域神经元细胞的遗传操作。...

新生小鼠脑纹状体细胞基因操作的立体定位手术

本文介绍了一种利用双标记嵌合分析（MADM）在单细胞水平上对候选基因进行谱系示踪和功能遗传学分析的实验方案。MADM克隆分析提供了一个定量框架，用于测量单个前体细胞及其子代细胞的增殖行为、细胞产出及谱系关系。...

利用双标记嵌合体分析技术（MADM）对发育中大脑皮层进行谱系追踪与克隆分析

新近发现的疾病相关基因在神经精神障碍发病机制中的作用仍不明确。一种改良的双侧子宫内电穿孔技术可实现将基因转入大量神经元群体中，并可用于研究基因表达变化对社交行为的因果影响。...

利用双侧子宫内电穿孔技术研究基因对啮齿类动物行为影响的实验流程

在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。许多基因参与了这一过程。本方案介绍了对迁移中的神经元和胶质前体细胞进行活细胞延时成像的技术。...

胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

了解利用重组腺相关病毒在小鼠产后脑发育中进行基因功能分析的方法。通过向新生小鼠脑内注射病毒，实现马赛克基因失活和稀疏神经元标记，结合免疫荧光显微镜成像，为神经回路发育研究提供重要框架。

利用基于病毒的Cre重组技术对小鼠出生后脑发育中基因功能进行嵌合体分析

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