清醒小鼠小胶质细胞动力学和神经元活动的同时成像
August 23rd, 2022
在这里，我们描述了一种将腺相关病毒注射与颅窗植入相结合的方案，用于同时对清醒小鼠的小胶质细胞动力学和神经元活动进行成像。
我们的协议能够同时对清醒小鼠的小胶质细胞动力学和神经元活动进行成像。它可以广泛用于研究小胶质细胞的监视行为或与神经元的相互作用。这种方法的优点是，由于头部固定牢固，运动伪影不容易污染成像数据。
此外，以高帧率成像后的恢复使我们能够消除数据中的运动伪影。在这种方法中，AAV注射和颅窗植入手术在技术上要求很高。一开始失败是很常见的，所以请不要沮丧，多练习。
为了制备注射装置，将连接到26号汉密尔顿注射器的玻璃移液器通过管子放在立体定位仪器的移液器支架上。然后，将移液器支架从垂直轴向前倾斜 60 度。用液体石蜡填充玻璃移液器、注射器和连接管，并将注射器放在微量注射器上。
对麻醉小鼠进行镇痛并连接辅助耳杆。然后，将动物固定在立体定位仪器上，其背侧朝上。从手术部位去除毛发并对手术区域进行消毒后，沿中线在头皮上做一个两厘米长的切口，确保右侧初级视觉皮层上方的颅骨良好暴露。
使用镊子去除暴露的颅骨上的骨膜。在中线外侧 3 毫米和λ线前方 5 毫升的立体定位坐标上钻颅骨，以创建一个直径约为 0.5 毫米的小孔。然后，将一块大约两厘米乘两厘米的透明薄膜放在暴露的小鼠头骨上。
使用移液器将一微升AAV溶液液滴排出薄膜上。推进注射器。并将玻璃移液器尖端放入薄膜上的AAV溶液液滴中，轻轻拉动注射器以吸出AAV溶液。
接下来，将玻璃移液管通过颅骨中形成的孔从大脑表面插入 500 微米的深度。然后，使用微量注射器以每小时2微升的注射体积流速注入0.5微升AAV溶液。抽出针头并用生理盐水冲洗脑表面。
通过钻孔沿着头骨上的标记创建一个圆形凹槽。清洁碎屑以确保头骨的可见性，并涂抹盐水以防止钻孔过程中加热。用镊子轻轻按压中央颅骨。
如果垂直移动且阻力很小，则钻孔深度就足够了。当凹槽达到足够的深度时，将镊子的尖端插入中央颅骨碎片的底部。轻轻提起并取下它以露出大脑表面。
使用27号针，刺破并撕裂暴露的大脑表面边缘的硬脑膜。将镊子的尖端插入硬脑膜边缘的孔中，然后将其剥离以露出大脑表面。在盐水中逐个分散止血纤维后，将止血纤维沿着存在横断面硬脑膜的孔的边缘放置。
将颅窗放在暴露的脑表面，然后用即时胶将其粘附在头骨上，同时轻轻按压窗户。之后，在整个暴露的头骨上涂抹即时胶水。然后，小心地将头板连接到头骨上，将颅窗定位在头板方孔的中心。
一旦胶水充分硬化，将牙科水泥涂在暴露的头骨上，以加强头部和头刀片之间的连接。要安装定制的着色装置和用于视觉刺激的LCD监视器，请首先将镜头定位为聚焦在大脑表面，然后将该镜头位置设置为原始Z位置。保持XY坐标恒定并抬高物镜。
从物镜上取下鼠标和立体定位仪器。使用硅胶在顶板顶部安装遮阳装置，确保顶板和遮阳装置之间的空间密封良好。用蒸馏水填充遮阳装置。
然后，将鼠标与物镜下方的立体定位框架固定。小心地重置大脑表面的焦平面，检查物镜的深度。用黑色铝箔盖住物镜，以避免液晶显示器的光污染。
将 10 英寸 LCD 显示器设置在鼠标眼前 12.5 厘米处，以呈现视觉刺激。配置EGFP和R-CaMP的荧光提交收集滤光片，并将激发波长配置为1， 000纳米。采集空间分辨率为每像素 0.25 微米的图像。
找到可以同时对R-CaMP阳性神经元和EGFP阳性小胶质细胞进行成像的区域。在第 2、3 层中。以 30 赫兹的帧速率采集图像。
在图像采集的同时，以6个方向从0到150度，以30度的步长，在12个方向上向鼠标呈现漂移光栅视觉刺激。图像采集后，将鼠标从显微镜载物台上移开。从鼠标上拆下着色装置和立体定位仪器，然后将鼠标放回其主笼。
使用该协议，在八周龄转基因小鼠的初级视觉皮层中进行AAV注射和颅窗植入，然后在第2层，第3层对基于R-CaMP的神经活动和小胶质细胞动力学进行两次光子成像。将光栅视觉刺激呈现给小鼠，并使用钙迹线分析脊椎中的视觉反应。小胶质细胞过程显示出快速的动力学并在10秒内改变了它们的形态。
在12周龄转基因小鼠初级视觉皮层的第2层，第3层中使用双光子成像，在神经元中观察到R-CaMP，此处在洋红色中观察到。在小胶质细胞中观察到EGFP，呈绿色。还观察到EGFP和R-CaMP的个体信号。
成功的AAV注射对于该方法至关重要。AAV注射失败的主要原因是时钟玻璃移液器和组织损伤。小胶质细胞的监视行为和SNAP的小胶质细胞相互作用已被确定为在各种致病机制中普遍存在，如阿尔茨海默病。
我们的方法有利于专注于该领域的研究。
概述
本研究概述了一种将腺相关病毒（AAV）注射与颅骨窗植入相结合的协议，以实现在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态和神经元活动。该方法允许研究人员在最小化成像过程中的运动伪影的同时，调查小胶质细胞的监视行为及其与神经元的相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经影像学
- 神经生物学
背景
- 小胶质细胞在脑健康和疾病中起着至关重要的作用。
- 实时成像小胶质细胞动态对于理解其功能至关重要。
- AAV在神经科学应用中常用于传递遗传物质。
- 在清醒小鼠中固定头部可减少成像过程中的运动伪影。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来成像小胶质细胞和神经元相互作用。
- 增强对生理条件下小胶质细胞动态和神经元活动的理解。
- 最小化成像过程中由运动伪影引起的数据污染。
所用方法
- 该协议涉及在清醒小鼠的初级视觉皮层进行AAV注射和颅骨窗植入。
- 生物模型由表达荧光蛋白的转基因小鼠组成。
- 关键步骤包括用于注射的精确立体定位坐标和用于颅骨窗放置的手术程序。
- 成像使用30 Hz帧率的二光子显微镜进行。
- 分析神经元和小胶质细胞对视觉刺激的钙信号。
主要结果
- 观察到小胶质细胞突起的快速动态，形态在10秒内改变。
- 同时成像揭示了神经元活动和小胶质细胞动态对视觉刺激的反应。
- 该协议验证了AAV和颅骨窗在高质量成像中的有效性。
结论
- 该方法能够实时观察小胶质细胞和神经元相互作用，提供对脑动态的洞察。
- 该研究为理解小胶质细胞在神经元机制中的角色提供了宝贵的工具。
- 未来的应用可能包括研究各种干预对小胶质细胞和神经元活动的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice enables direct interrogation of neuroimmune interactions at single-cell resolution. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early CNS target validation, especially for neuroinflammatory and neurodegenerative disease models. Integrating real-time glial-neuronal readouts advances portfolio decisions by clarifying pathway engagement and functional outcomes in translationally relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of microglia-neuron interactions under physiological and stimulated conditions.
- Supports functional target validation by linking immune cell dynamics to neuronal activity in vivo.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroinflammatory and synaptic plasticity hypotheses.
- Improves predictive confidence for CNS target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Establishes validated in vivo imaging systems for quantitative assessment of neuronal and microglial responses.
- Provides reproducible, motion-artifact-minimized datasets for downstream analysis and screening.
- Enables standardization of visual stimulus protocols and imaging parameters for assay development.
- Supports reliable evaluation of compound effects on neuroimmune interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant neuroimmune mechanisms observed in human CNS disorders.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking dynamic cellular responses.
- Supports risk-adjusted advancement of neuroinflammation and synaptic modulation programs.
- Provides translational biomarker candidates based on real-time cellular activity patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven testing of neuroimmune interactions in awake, behaving mice.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial surveillance and neuron-glia signaling in response to peripheral and central stimuli.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible imaging outputs suitable for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Provides high-resolution calcium traces and morphological data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant mechanisms and biomarker development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable in vivo imaging platform adaptable to diverse CNS targets and interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows and minimizes motion artifacts for reproducible data.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of neuroimmune programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS assets based on functional in vivo evidence.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in stereotaxic surgery, AAV delivery, and cranial window implantation.
- Demands access to two-photon microscopy and advanced imaging infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of imaging protocols and data analysis.
- Adaptable to various brain regions and transgenic models with protocol optimization.
- Initial technical failure rates may be high; proficiency improves with practice and experience.
