清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

本方案能够实现对清醒小鼠中微胶质细胞动态和神经元活动的同步成像，可广泛应用于研究微胶质细胞的监视行为或其与神经元的相互作用。该方法的优势在于，由于头部固定牢固，运动伪影不易污染成像数据。

此外，高帧率成像后的图像重建使我们能够消除数据中的运动伪影。该方法中的AAV注射和颅窗植入手术在技术上要求较高。初学者常会遇到失败，请不要气馁，应多加练习。

为准备注射装置，将一根通过导管连接至26号Hamilton注射器的玻璃移液管放置在体视定位仪的移液管架上。然后，将移液管架从垂直轴向前倾斜60度。用液体石蜡填充玻璃移液管、注射器及连接导管，并将注射器安装至微量注射仪上。

对麻醉后的小鼠给予镇痛处理，并安装辅助耳杆。随后将动物固定于立体定位仪上，使其背部朝上。剪除手术区域的毛发并消毒手术部位后，沿中线在头皮做一处长约两厘米的切口，确保充分暴露右侧初级视皮层上方的颅骨。

使用镊子去除暴露颅骨上的骨膜。在立体定位坐标处钻孔，位置为中线外侧3毫米、人字缝前方5毫米，钻出一个直径约0.5毫米的小孔。然后，将一块大小约为2厘米×2厘米的透明薄膜放置在小鼠暴露的颅骨上。

使用移液器将一微升 AAV 溶液液滴排到薄膜上。推进注射器，将玻璃移液管尖端插入薄膜上的 AAV 溶液液滴中，轻轻拉动注射器以吸取 AAV 溶液。

接下来，通过颅骨上创建的孔洞，将玻璃移液管插入至脑表面以下500微米深度。然后，使用微注射器以每小时2微升的注射体积流速注入0.5微升AAV溶液。注射完成后撤出针头，并用生理盐水冲洗脑表面。

沿颅骨上的标记处钻出环形沟槽。清除碎屑以确保颅骨清晰可见，并滴加生理盐水以防止钻孔过程中过热。用镊子轻轻按压颅骨中央。

如果钻孔深度足够，钻头应能垂直移动且阻力很小。当沟槽达到足够深度时，将镊子尖端插入颅骨中央碎片的底部，轻轻抬起并移除该碎片，以暴露脑表面。

使用27号针头，在暴露的脑表面边缘刺破并撕开硬脑膜。将镊子尖端插入硬脑膜边缘所形成的孔中，剥离硬脑膜以暴露脑表面。将止血纤维逐根在生理盐水中散开后，沿硬脑膜断端存在的孔洞边缘放置止血纤维。

将颅窗放置在暴露的脑表面，然后在轻轻按压颅窗的同时，使用瞬干胶将其粘附到颅骨上。随后，将瞬干胶涂抹在整个暴露的颅骨表面。接着，小心地将头固定板贴附到颅骨上，使颅窗位于头固定板方孔的中央。

待胶水充分固化后，在暴露的颅骨上涂抹牙科水泥，以加强头部与头固定片之间的连接。安装自制的遮光装置和用于视觉刺激的液晶显示器时，首先调整透镜位置，使其聚焦于脑表面，然后将此透镜位置设定为初始Z位置。保持XY坐标不变，提升物镜。

将小鼠和立体定位仪从物镜下移开。使用硅胶将遮光装置固定在头板顶部，确保头板与遮光装置之间的空间密封良好。向遮光装置中注入蒸馏水。

然后，将小鼠固定在立体定位仪框架下，并置于物镜下方。仔细调整焦平面至脑表面，检查物镜的深度。用黑色铝箔覆盖物镜，以避免LCD显示器的光线干扰。

将一台10英寸的LCD显示器设置在小鼠眼睛前方12.5厘米处，用于呈现视觉刺激。配置用于EGFP和R-CaMP的荧光信号采集滤光片，并将激发波长设为1,000纳米。以每像素0.25微米的空间分辨率采集图像。

找到可同时成像 R-CaMP 阳性神经元和 EGFP 阳性小胶质细胞的成像区域。在第 2 层和第 3 层，以 30 赫兹的帧率采集图像。

在进行图像采集的同时，向小鼠呈现漂移光栅视觉刺激，共12个方向、6种方位，角度从0度到150度，以30度为步长。图像采集完成后，将小鼠从显微镜载物台上取下，拆除小鼠身上的遮光装置和立体定位仪，并将小鼠放回其饲养笼中。

采用本方案，对一只八周龄的转基因小鼠初级视皮层进行 AAV 注射和颅窗植入，随后利用基于 R-CaMP 的双光子成像技术，观察第 2 层和第 3 层神经元活动及小胶质细胞动态。向小鼠呈现光栅视觉刺激，并通过钙信号轨迹分析树突棘中的视觉反应。小胶质细胞突起表现出快速动态变化，可在 10 秒内改变其形态。

在一只12周大的转基因小鼠初级视皮层第2层和第3层中，通过双光子成像观察到神经元中的R-CaMP（图中呈洋红色）。小胶质细胞中的EGFP呈绿色。EGFP和R-CaMP的单个信号也被分别观察到。

成功的AAV注射对该方法至关重要。AAV注射失败的主要原因包括钟表玻璃毛细管和组织损伤。小胶质细胞的监视行为及其与SNAP的小胶质细胞相互作用已被证实广泛存在于多种致病机制中，例如阿尔茨海默病。

我们的方法对该领域的研究具有积极意义。