利用人单核样THP-1白血病细胞系诱导巨噬细胞分化并极化为M2样表型

具有抗炎特性的肿瘤相关巨噬细胞与癌症的进展和不良预后相关。本方案旨在提供一种在14天内将THP-1类单核细胞分化并极化为M2样巨噬细胞的实验指南。目前尚无针对THP-1细胞抗炎性极化的标准化模型。

本方案采用适当的静息期和延长的极化过程，以生成一种独特的类似M2型巨噬细胞亚型。例如，在结肠癌中，肿瘤的发展以及组织重塑过程均受到抗炎型巨噬细胞的调控。在研究其功能的各项研究中，标准化地生成特定的类似M2型亚型可确保研究结果的可重复性。

首先将计时器设置为150秒。从液氮中取出含有THP-1细胞系的冻存管，立即将冻存管放入37摄氏度的洁净水浴中融化，冻存管一放入水浴中即开始计时。在解冻过程中，为释放因融化产生的压力，需松开管盖，但确保管口不接触水，以避免污染。

将细胞悬液解冻至冻存管中仅剩约 4 毫米大小的冰粒，立即进入下一步操作。将细胞悬液的液相部分转移至含有 9 毫升预热培养基的 15 毫升离心管中。然后取 1 毫升该预热培养基中的细胞悬液加入 THP-1 冻存管中，再倒回 15 毫升离心管，以溶解剩余的冰粒，并冲洗冻存管，确保无细胞残留。

用1 mL移液器轻轻吹打混匀悬浮液。取约10 µL样品，用台盼蓝计数细胞以检测活力。细胞质透明的细胞为活细胞，细胞质呈蓝色则表明细胞死亡。

计数的同时，在37摄氏度下以200 × g离心7分钟，使温热的细胞悬液沉淀。完全移除上清液，并将细胞重悬于生长培养基中，使细胞密度达到每毫升50万个细胞。轻轻混匀悬液，然后将22毫升悬液分别转移至每个T75细胞培养瓶中。

将培养瓶直立放置于37摄氏度、5%二氧化碳浓度的培养箱中，并每三至四天更换一次培养基。制备细胞悬液，以每毫升每孔300,000个细胞的密度接种至24孔细胞培养板中。轻轻混匀培养基，并在50毫升离心管中分装成每份26毫升的等分试样。

将一毫升含细胞的培养基转移至24孔板的每个孔中。在转移过程中，通过上下吹打轻轻混匀培养基。将新配制的PMA工作液置于冰上，并向每孔加入100纳克PMA。

将培养板放入培养箱中，无需进一步处理，孵育72小时。72小时后，移除生长培养基，并加入1毫升新鲜生长培养基，注意移液枪头不要接触孔底。然后将细胞在培养箱中继续静置培养96小时。

吸去培养基，加入1毫升新鲜培养基。每孔加入20纳克白细胞介素4和20纳克白细胞介素13。然后将细胞置于培养箱中静置培养48小时。

48小时后重复整个过程，并将细胞在培养箱中再静置48小时。移除生长培养基，替换为1毫升新鲜生长培养基，然后将细胞在培养箱中静置48小时。

从每个孔中移除温热的细胞培养基，替换为1毫升预冷的不含钙和镁的PBS与5%FBS的混合液。立即将细胞培养板置于冰上，孵育45分钟。冰上孵育45分钟后，使用小型细胞刮刀刮下细胞。

将分离的巨噬细胞轻柔地转移至预冷的含5%FBS的PBS中，置于冰上保存的15毫升离心管内。通过极化方法获得的巨噬细胞表达CD14以及CD11b标志物。单核细胞与巨噬细胞标志物CD14和CD11b在细胞中的表达率分别为70.9%和74.7%。

细胞表面M1样标志物CD80的表达水平较低，仅0.2%的细胞呈阳性，而M2样标志物CD206的表面表达水平较高，在62.6%的细胞中检测到。由于THP-1细胞在培养基中容易沉降至离心管底部，且易因机械应力而被激活，因此轻柔混匀和操作细胞至关重要。M2样巨噬细胞可被稳定诱导生成，并已通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术进行表征。

这是研究癌症发展或组织重塑中抗炎机制的基础。