Name: 使用类似人类单细胞的THP-1白血病细胞系，将巨噬细胞分化和极化成M2样表型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 了解如何使用THP-1单核细胞系在14天内分化和极化为M2样巨噬细胞。该标准化方案为研究肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤微环境中的抗炎作用提供了可重复的模型。

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路易斯维尔大学Price外科研究所由John W. Price和Barbara Thruston Atwood Price信托基金提供资金支持。资助方在研究设计与实施，以及数据的收集、管理、分析和解释过程中均未发挥任何作用。

注意：本方案所述步骤的概述见图1。购入人单核样白血病细胞系 THP-1，并通过短串联重复序列分析对 THP-1 细胞系进行鉴定。所有操作均需在无菌条件下进行。THP-1 单核细胞系以悬浮状态生长，不贴附于细胞培养表面。可通过将单核细胞诱导分化为类似巨噬细胞的细胞，使其获得贴壁能力，例如通过机械应力或使用佛波酯（PMA）进行特异性处理.
1. THP-1 类单核细胞的培养与维持
<ol>
	<li>设置计时器为 150 秒。从液氮中取出含有 THP-1 细胞系的冻存管（材料表），立即放入洁净的水浴（37 °C）中解冻。将冻存管放入水浴的同时启动计时器。在解冻过程中轻轻拧松管盖以释放内部积聚的压力，但确保管口不接触水，以避免污染。最佳解冻时间为 120–150 秒。持续解冻细胞悬液，直至管内仅剩约 4 mm 大小的冰晶，随后立即进入下一步操作。</li>
	<li>将细胞悬液的液相部分转移至含有 9 mL 预热（37 °C）培养基的 15 mL 离心管中（材料表）。然后，取 1 mL 预热的培养基-细胞悬液加入原 THP-1 冻存管中，再重新转移回 15 mL 离心管，以溶解残留的冰晶并冲洗冻存管，确保无细胞残留。</li>
	<li>使用 1000 µL 移液器轻轻吹打混匀细胞悬液。在离心过程中，取少量样品（约 10 µL）进行细胞活率计数（使用台盼蓝排除法）。将温热的细胞悬液在 37 °C 下以 200 × g 离心 7 分钟。</li>
	<li>完全去除上清液，用一定体积的预热培养基重悬细胞，使细胞密度达到 5 × 105/mL。轻轻混匀细胞悬液后，将 22 mL 体积转移至 T-75 细胞培养瓶（材料表）。将培养瓶直立放置于 37 °C、5% 二氧化碳（CO2）浓度的培养箱中培养。每 3–4 天更换一次培养基。</li>
</ol>
2. THP-1 细胞的接种及向 M0 巨噬细胞的分化
<ol>
	<li>准备含有相应细胞密度的生长培养基，以每平方厘米 3 x 10⁵ 个细胞的密度接种细胞5/mL/孔加入24孔细胞培养板（材料表）。轻轻混匀培养基，分装成每份26 mL，分别置于50 mL离心管中。每份26 mL培养基用于将细胞接种至相应的培养板中。</li>
	<li>将1 mL含细胞的培养基转移至24孔板的每个孔中。每次转移之间，通过上下轻柔吹打混合培养基。</li>
	<li>配制PMA储备液（将1 mg PMA溶解于100 µL二甲基亚砜（DMSO）中，得到约16 mM的PMA DMSO溶液），并在细胞处理前用冷的磷酸盐缓冲液（PBS）将其稀释至终工作浓度为10 ng/µL（材料表）。将溶液置于冰上，并立即使用，切勿再次冷冻。每孔加入 100 ng PMA。将每块细胞培养板放入培养箱中，不进行任何其他处理，孵育 72 h。</li>
	<li>72小时后，移除生长培养基，并更换为1 mL新鲜生长培养基。移液时避免枪头接触孔底。将细胞在培养箱中继续培养96小时。</li>
	<li>96小时后，重复步骤2.4（更换培养基），并让细胞再静置24小时。 
	&#8203;注意：M0 巨噬细胞现已准备好用于实验图2). 在将细胞用于后续实验处理之前，立即更换为仅含RPMI的培养基（材料表因为培养基添加剂可能会干扰后续添加的细胞处理试剂。如果需要获得M2样巨噬细胞，请继续进行第3节操作。</li>
</ol>
3. 将M0型巨噬细胞极化为M2样巨噬细胞
<ol>
	<li>配制IL-4和IL-13的储存液（将20 µg的IL-4或IL-13溶解于200 µL无核酸酶水中），并在细胞处理前立即用PBS稀释至终工作浓度为2 ng/µL。将溶液置于冰上，并立即使用。切勿再次冷冻。</li>
	<li>吸除培养基，更换为1 mL新鲜培养基。每孔加入20 ng白细胞介素4（IL-4）和20 ng白细胞介素13（IL-13）。将细胞在培养箱中孵育48小时。</li>
	<li>48小时后，重复步骤3.2。将细胞继续在培养箱中孵育另外48小时。</li>
	<li>吸除培养基，更换为1 mL新鲜培养基。将细胞在培养箱中孵育48小时。 
	注意：此时M2样巨噬细胞已可用于实验（图2）。在将细胞用于后续实验处理前，建议仅使用RPMI培养基进行换液（材料表），因为培养基中的添加剂可能产生干扰。</li>
</ol>
4. 用于流式细胞术的巨噬细胞解离与收获
注意：采用结合冷冲击和细胞刮擦的机械方法，从培养板上分离并收集极化巨噬细胞，用于流式细胞术。
<ol>
	<li>移除温热的细胞培养基，每孔加入1 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，不含钙和镁）与5%胎牛血清（FBS）的混合液。操作后立即将细胞培养板置于冰上孵育45分钟。注意：必须在移除温热培养基后才可将细胞板放至冰上，否则会显著降低细胞活力。仅在使用预冷的PBS/5% FBS混合液诱导冷休克后，才可将细胞保持在冰上。</li>
	<li>冰浴45分钟后，使用小型细胞刮刀（材料表）刮下细胞。将脱离的巨噬细胞轻轻转移至15 mL离心管中，并始终将离心管置于冰上，直至进行细胞染色。 
	注意：合并八孔的细胞以获得足够的细胞数量用于染色。</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+enhance+tumor-associated+macrophages+enrichment+and+suppress+NK+cells+function+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 273(2019).</li>
<li>Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+cancer+and+immune+cells%3A+Role+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).</li>
<li>Soncin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+creates+a+niche+for+the+self-renewal+of+tumor-promoting+macrophages+in+colon+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma.</a> Nature Communications. 9 (1), 582(2018).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+TAM+functions-it+takes+two+to+tango%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Biochemical+Societies+Journal%22%5BJournal%5D)">Metabolism and TAM functions-it takes two to tango.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).</li>
<li>Eum, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-promoting+macrophages+prevail+in+malignant+ascites+of+advanced+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).</li>
<li>Qian, B. Z., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+diversity+enhances+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis.</a> Cell. 141 (1), 39-51 (2010).</li>
<li>Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+dysfunction+and+early-onset+colorectal+cancer+-+how+macrophages+build+the+bridge%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge.</a> Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).</li>
<li>Bosshart, H., Heinzelmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THP-1+cells+as+a+model+for+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">THP-1 cells as a model for human monocytes.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438(2016).</li>
<li>The American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation">https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation</a> (2021).</li>
<li>Baxter, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+protocols+for+differentiation+of+THP-1+cells+to+macrophages+with+distinct+M%28IFNgamma%2BLPS%29%2C+M%28IL-4%29%2C+and+M%28IL-10%29+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes.</a> Journal of Immunological Methods. 478, 112721(2020).</li>
<li>Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1+and+M2+macrophages+derived+from+THP-1+cells+differentially+modulate+the+response+of+cancer+cells+to+etoposide%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide.</a> BMC Cancer. 15, 577(2015).</li>
<li>Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phorbol+12-myristate-13-acetate+differentiation+protocol+is+critical+to+the+interaction+of+THP-1+macrophages+with+Salmonella+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium.</a> PLoS One. 13 (3), 0193601(2018).</li>
<li>Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choice+of+phorbol+12-myristate+13-acetate+differentiation+protocol+influences+the+response+of+THP-1+macrophages+to+a+pro-inflammatory+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus.</a> Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6%2FSTAT3+pathway+intermediates+M1%2FM2+macrophage+polarization+during+the+development+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).</li>
<li>O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itaconate%3A+the+poster+child+of+metabolic+reprogramming+in+macrophage+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).</li>
<li>Luig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-induced+IL-6+functions+as+a+natural+brake+on+macrophages+and+limits+gn%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).</li>
<li>Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+macrophage+function+-+cyclic+tensile+force+inhibits+NLRP3+inflammasome-dependent+IL-1beta+secretion+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages.</a> Inflammation and Regeneration. 39, 3(2019).</li>
<li>Gatto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PMA-Induced+THP-1+Macrophage+Differentiation+is+Not+Impaired+by+Citrate-Coated+Platinum+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles.</a> Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).</li>
<li>Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li>
<li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668(2010).</li>
<li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+macrophage+M1-M2+polarization+balance+by+hypoxia+and+the+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 11097(2017).</li>
<li>Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mild+cold+shock+%2825+degrees+C%29+followed+by+warming+up+at+37+degrees+C+on+the+cellular+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response.</a> PLoS One. 8 (7), 69687(2013).</li>
<li>Kurashina, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-free+release+of+adhered+cells+from+standard+culture+dishes+using+intermittent+ultrasonic+traveling+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves.</a> Communications Biology. 2, 393(2019).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+murine+bone+marrow-derived+macrophages+for+nitric+oxide+and+redox+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology.</a> Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).</li>
</ol>

作者声明不存在潜在的利益冲突。

本方案在14天内对THP-1类单核细胞进行分化和极化，通过在各步骤间设置充足的静置期并进行长时间处理，可获得具有明显M2样表型的巨噬细胞。
本实验方案中有若干步骤至关重要。THP-1 单核细胞的倍增时间约为 26 小时。细胞传代时的密度可为 9 × 105/mL，每次传代应以 3 × 105/mL 的密度接种。传代时无需完全更换已使用的（旧的）培养基——仅补充 50% 的新鲜培养基实际上可促进细胞更快生长，因为条件培养基中的生长因子有助于增强细胞增殖。然而，不完全更换培养基会增加污染风险，因此该操作仅应在新培养细胞的前几次传代中进行。准确计数细胞对于维持适当的培养密度以及评估细胞复苏后的活力至关重要。正确复苏后的细胞中，死细胞比例不应超过 15%。
将细胞接种到培养板中时，需要对细胞悬液进行轻柔但充分的混匀，以确保每个孔中的细胞密度一致。在将细胞接种到培养板之前，应先准备好分装样品，以保证含细胞的培养基体积得到充分混匀。由于培养基中的THP-1单核细胞容易沉降到离心管底部，因此在转移...

肿瘤相关巨噬细胞（TAM）及其在慢性炎症、癌症发生和肿瘤发展中的作用是近年来研究的重要靶点1,2。被募集到发育中肿瘤组织微环境中的外周血单核细胞可分化为巨噬细胞，并可极化为两种主要亚型的巨噬细胞3。经典活化的巨噬细胞代表主要具有促炎特性的M1样表型，而替代性活化的M2样亚型则主要表现出抗炎特性4。巨噬细胞可根据其细胞代谢在上述两种主要表型之间动态转换，其中间亚型兼具促炎和抗炎特征5。TAM包含这两种表型的异质性群体。然而，在多种癌症中，M2样巨噬细胞尤其与促进肿瘤的功能及不良预后相关6,7,8。
巨噬细胞的功能特征及其在肿瘤微环境内与其他细胞的相互作用十分复杂，且在持续进展的肿瘤发展过程中难以准确捕捉。细胞系可提供具有稳定存活能力的均质细胞群体，有助于阐明特定的细胞内及细胞间作用机制。单核细胞样 THP-1 细胞系是原代人单核细胞的合理模型系统9。该细胞系源自一名一岁急性单核细胞白血病患儿的外周血，属自发永生化细胞系9,10。已有多个研究报道了 THP-1 细胞的分化与极化过程，并采用了多种不同的诱导方法11,12,13,14。巨噬细胞被激活并极化为 M1 样表型后，会触发一种代偿性抗炎反弹机制，通过炎症性巨噬细胞产生的细胞因子（如白细胞介素 6（IL-6）或衣康酸）促进向 M2 样表型转化15,16。该机制可能作为一种负反馈调节，以抑制细胞激活后过度的炎症反应17。然而，单核细胞及 THP-1 单核样细胞向抗炎性 M2 样表型分化与极化的过程本身也会伴随促炎性刺激，需加以克服。机械性应激（如更换培养基以补充营养）18可引发促炎性细胞因子反应，此外，添加化学诱导物（如佛波醇&#160;12-十四烷酸十三酯乙酸酯（PMA））诱导 THP-1 细胞分化时，亦可诱导肿瘤坏死因子 α（TNFα）、白细胞介素 1β（IL-1β）或 IL-6 的产生19。PMA 所引发的细胞因子表达谱改变可能干扰甚至阻碍后续巨噬细胞的极化过程20。如先前报道，在 PMA 处理后设置适当的静息期，有助于降低此类炎症反应，从而促进细胞向明确的 M2 样表型极化21。
本方案展示了一种在14天内将THP-1类单核细胞分化并极化为M2样表型巨噬细胞的方法。

<table><tbody><tr><td>0.4% 台盼蓝</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>152-5061</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>USA Scientific, Ocala, USA</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>&amp;nbsp;89130-898</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L TipOne 移液器吸头</td><td>USA Scientific, Ocala, USA</td><td>1111-2821</td><td></td></tr><tr><td>15 mL&amp;nbsp; 离心管</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;L TipOne 移液器吸头</td><td>USA Scientific, Ocala, USA</td><td>1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L TipOne 移液器吸头</td><td>USA Scientific, Ocala, USA</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 血清移液管</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>&amp;nbsp;89130-900</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>&amp;nbsp;89130-896</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>89039-662</td><td></td></tr><tr><td>Accutase 溶液 500 mL</td><td>Sigma, St. Louis, USA</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液（100 倍浓度），稳定型</td><td>Sigma, St. Louis, USA</td><td>A5955-100 mL</td><td>每毫升含 10,000 单位青霉素、10 mg 链霉素和 25 &amp;mu;g 两性霉素 B，经无菌过滤，BioReagent 级，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>Binder CO2 培养箱</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>C170-ULE3</td><td></td></tr><tr><td>CytoOne T-75 cm 带滤膜盖培养瓶</td><td>USA Scientific, Ocala, USA</td><td>CC7682-4875</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma, St. Louis, USA</td><td>D8537-500 mL</td><td>应使用不含氯化钙和氯化镁的 PBS，因为两者均可改变巨噬细胞极化状态</td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5804 R（制冷型）</td><td>Eppendorf, Enfield, USA</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（70%）</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>-</td><td>流式细胞仪使用 CellQuest 软件（BD Biosciences）操作</td></tr><tr><td>Falcon 24 孔板</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>ATCC, Manassas, USA</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>FITC 小鼠抗人 CD14 抗体</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>555397</td><td>流式细胞术，髓系细胞标志物（100 次检测）</td></tr><tr><td>FITC 小鼠抗人 CD80 抗体</td><td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td><td>557226</td><td>流式细胞术，M1 标志物（100 次检测）</td></tr><tr><td>FITC 小鼠 IgG1 &amp;kappa; 同型对照抗体</td><td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td><td>555748</td><td>流式细胞术，CD80 同型对照（100 次检测）</td></tr><tr><td>FITC 小鼠 IgG2a, &amp;kappa; 同型对照抗体</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>553456</td><td>流式细胞术，CD14 同型对照（100 次检测）</td></tr><tr><td>人源 BD Fc 封闭抗体</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>564220</td><td>流式细胞术，Fc 封闭（0.25 mg）</td></tr><tr><td>人白细胞介素 13（IL-13）</td><td>R&amp;D, Minneapolis, USA</td><td>IL-771-10 &amp;mu;g</td><td></td></tr><tr><td>人白细胞介素 4（IL-4）</td><td>R&amp;D, Minneapolis, USA</td><td>SRP3093-20 &amp;mu;g</td><td></td></tr><tr><td>Labconco 生物安全柜（Delta 系列 36212/36213）</td><td>Labconco, Kansas City, USA</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺溶液，200 mM</td><td>ATCC, Manassas, USA</td><td>30-2214</td><td></td></tr><tr><td>来自大肠杆菌 O111:B4 的脂多糖（LPS）</td><td>Sigma, St. Louis, USA</td><td>L2630-100 mg</td><td></td></tr><tr><td>小型细胞刮刀</td><td>Biotium, Fremont, USA</td><td>22003</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>02-671-5</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS100 倒置显微镜</td><td>Nikon, Melville, USA</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Invitrogen, Carlsbad, USA</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Olympus RH-2 光学显微镜</td><td>Microscope Central, Feasterville, USA</td><td>40888</td><td></td></tr><tr><td>P10 可调移液器 - Gilson</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>76180-014</td><td></td></tr><tr><td>P1000 可调移液器 - Gilson</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>76177-990</td><td></td></tr><tr><td>P200 可调移液器 - Gilson</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>76177-988</td><td></td></tr><tr><td>PE 小鼠抗人 CD11b 抗体</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>555388</td><td>流式细胞术，髓系细胞标志物（100 次检测）</td></tr><tr><td>PE 小鼠 IgG1, &amp;kappa; 同型对照抗体</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>555749</td><td>流式细胞术，CD11b 同型对照（100 次检测）</td></tr><tr><td>PE-Cy 5 小鼠抗人 CD206 抗体</td><td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td><td>551136</td><td>流式细胞术，M2 标志物（100 次检测）</td></tr><tr><td>PE-Cy 5 小鼠 IgG1 &amp;kappa; 同型对照抗体</td><td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td><td>555750</td><td>流式细胞术，CD206 同型对照（100 次检测）</td></tr><tr><td>佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯（PMA）</td><td>Sigma, St. Louis, USA</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Powerpette Plus 移液器</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>75856-448</td><td></td></tr><tr><td>Precision 水浴锅（型号 183）</td><td>Precision Scientific, Chicago, USA</td><td>66551</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>ATCC, Manassas, USA</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 细胞系，美国模式培养物集存库（ATCC）</td><td>ATCC, Manassas, USA</td><td>TIB-202</td><td></td></tr></tbody></table>

利用人单核样thp-1白血病细胞系诱导巨噬细胞分化并极化为m2样表型

Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line

肿瘤相关巨噬细胞（TAM）可根据外部刺激改变其表达谱和细胞因子谱。这种显著的可塑性使TAM能够适应肿瘤微环境中的持续变化。巨噬细胞可表现出主要促炎（M1样）或抗炎（M2样）的特性，并可在这两种主要状态之间持续转换。在肿瘤微环境中，M2样巨噬细胞与多种癌症的疾病进展和不良预后相关。目前有多种不同的方法用于诱导THP-1细胞的分化与极化，以研究细胞内及细胞间机制，以及TAM在肿瘤微环境中的作用。然而，尚无公认的利用THP-1细胞系诱导M2样巨噬细胞极化的模型，且不同研究中特定体外刺激所导致的巨噬细胞表达谱和细胞因子谱结果存在差异。本实验方案提供了一套详细的操作流程，可在14天内将THP-1类单核细胞分化为M0巨噬细胞，并进一步极化为M2样表型。我们通过光学显微镜展示了THP-1类单核细胞、分化后的巨噬细胞以及极化后的M2样巨噬细胞的形态学变化。该模型为研究TAM的抗炎效应及其与肿瘤微环境中其他细胞群体相互作用的细胞系模型奠定了基础。

通过流式细胞术检测分化簇（CD）标志物 CD14、CD11b、CD80（M1样标志物）和 CD206（M2样标志物），对M2样巨噬细胞进行表征，并验证M2极化状态。流式细胞术染色操作按照试剂生产商说明书进行。巨噬细胞用含5%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS/5% FBS）洗涤，随后与Fcγ受体阻断剂孵育，以避免非特异性结合。细胞在4 °C条件下，分别与FITC标记的鼠抗人CD14和CD80抗体、PE标记的鼠抗人CD11b抗体、PE串联染料标记的鼠抗人CD206抗体以及同型对照IgG（材料表）孵育30分钟。随后进行四色流式细胞分析及荧光定量检测。根据前向散射光和侧向散射光排除细胞碎片，对细胞进行设门分析。
单核细胞和巨噬细胞标志物 CD14 和 CD11b 分别在 70.9% 和 74.7% 的细胞中表达（图 3）。细胞对 M1 样标志物 CD80 几乎无阳性表达（0.2%），而 62.6% 的细胞表面高表达 M2 样标志物 CD206（图 4</st...

M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAM）与肿瘤进展及癌症患者的不良预后相关。本方案提供了一份详细指南，可在14天内可重复地将THP-1类单核细胞分化并极化为M2样巨噬细胞。该模型为研究肿瘤微环境中TAM的抗炎作用奠定了基础。

利用人单核样THP-1白血病细胞系诱导巨噬细胞分化并极化为M2样表型

肿瘤相关巨噬细胞（TAM）可根据外部刺激改变其表达模式和细胞因子谱。这种显著的可塑性使TAM……

具有抗炎特性的肿瘤相关巨噬细胞与癌症的进展和不良预后相关。本方案旨在提供一种在14天内将THP-1类单核细胞分化并极化为M2样巨噬细胞的实验指南。目前尚无针对THP-1细胞抗炎性极化的标准化模型。本方案采用适当的静息期和延长的极化过程，以生成一种独特的类似M2型巨噬细胞亚型。例如，在结肠癌中，肿瘤的发展以及组织重塑过程均受到抗炎型巨噬细胞的调控。在研究其功能的各项研究中，标准化地生成特定的类似M2型亚型可确保研究结果的可重复性。首先将计时器设置为150秒。从液氮中取出含有THP-1细胞系的冻存管，立即将冻存管放入37摄氏度的洁净水浴中融化，冻存管一放入水浴中即开始计时。在解冻过程中，为释放因融化产生的压力，需松开管盖，但确保管口不接触水，以避免污染。将细胞悬液解冻至冻存管中仅剩约 4 毫米大小的冰粒，立即进入下一步操作。将细胞悬液的液相部分转移至含有 9 毫升预热培养基的 15 毫升离心管中。然后取 1 毫升该预热培养基中的细胞悬液加入 THP-1 冻存管中，再倒回 15 毫升离心管，以溶解剩余的冰粒，并冲洗冻存管，确保无细胞残留。用1 mL移液器轻轻吹打混匀悬浮液。取约10 µL样品，用台盼蓝计数细胞以检测活力。细胞质透明的细胞为活细胞，细胞质呈蓝色则表明细胞死亡。计数的同时，在37摄氏度下以200 × g离心7分钟，使温热的细胞悬液沉淀。完全移除上清液，并将细胞重悬于生长培养基中，使细胞密度达到每毫升50万个细胞。轻轻混匀悬液，然后将22毫升悬液分别转移至每个T75细胞培养瓶中。将培养瓶直立放置于37摄氏度、5%二氧化碳浓度的培养箱中，并每三至四天更换一次培养基。制备细胞悬液，以每毫升每孔300,000个细胞的密度接种至24孔细胞培养板中。轻轻混匀培养基，并在50毫升离心管中分装成每份26毫升的等分试样。将一毫升含细胞的培养基转移至24孔板的每个孔中。在转移过程中，通过上下吹打轻轻混匀培养基。将新配制的PMA工作液置于冰上，并向每孔加入100纳克PMA。将培养板放入培养箱中，无需进一步处理，孵育72小时。72小时后，移除生长培养基，并加入1毫升新鲜生长培养基，注意移液枪头不要接触孔底。然后将细胞在培养箱中继续静置培养96小时。吸去培养基，加入1毫升新鲜培养基。每孔加入20纳克白细胞介素4和20纳克白细胞介素13。然后将细胞置于培养箱中静置培养48小时。48小时后重复整个过程，并将细胞在培养箱中再静置48小时。移除生长培养基，替换为1毫升新鲜生长培养基，然后将细胞在培养箱中静置48小时。从每个孔中移除温热的细胞培养基，替换为1毫升预冷的不含钙和镁的PBS与5%FBS的混合液。立即将细胞培养板置于冰上，孵育45分钟。冰上孵育45分钟后，使用小型细胞刮刀刮下细胞。将分离的巨噬细胞轻柔地转移至预冷的含5%FBS的PBS中，置于冰上保存的15毫升离心管内。通过极化方法获得的巨噬细胞表达CD14以及CD11b标志物。单核细胞与巨噬细胞标志物CD14和CD11b在细胞中的表达率分别为70.9%和74.7%。细胞表面M1样标志物CD80的表达水平较低，仅0.2%的细胞呈阳性，而M2样标志物CD206的表面表达水平较高，在62.6%的细胞中检测到。由于THP-1细胞在培养基中容易沉降至离心管底部，且易因机械应力而被激活，因此轻柔混匀和操作细胞至关重要。M2样巨噬细胞可被稳定诱导生成，并已通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术进行表征。这是研究癌症发展或组织重塑中抗炎机制的基础。

macrophage-differentiation-polarization-into-an-m2-like-phenotype

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用类似人类单细胞的THP-1白血病细胞系，将巨噬细胞分化和极化成M2样表型

在本视频中，我们演示了一种诱导外周血来源的单核细胞分化并极化为M1或M2型巨噬细胞的方法。使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、脂多糖和干扰素-γ孵育可获得促炎性的M1型巨噬细胞，而使用巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4孵育则可诱导产生抗炎性的M2型巨噬细胞。...

单核细胞来源细胞向类巨噬细胞的分化与极化

本文描述了一种简便易行的自适应方法 体外...

利用骨髓来源巨噬细胞研究巨噬细胞极化

单核细胞来源的巨噬细胞是先天免疫系统的重要细胞。本文介绍了一种易于使用的 体外...

一个 体外 研究人类巨噬细胞分化与极性异质性的模型

我们介绍一种简单高效的生成人巨噬细胞的方案。通过双密度梯度离心法处理血沉棕黄层，分离单核细胞，随后在特氟龙涂层细胞培养袋中将其分化为巨噬细胞。该方法可最大化巨噬细胞产量，并便于后续实验的细胞收获。...

通过双梯度离心法分离人单核细胞及其在特氟龙涂层细胞培养袋中向巨噬细胞的分化

双梯度离心法，人单核细胞，巨噬细胞分化，特氟龙涂层培养袋，细胞培养，外周血单个核细胞，Ficoll密度梯度，Percoll梯度，单核细胞分离，巨噬细胞

本文介绍了一种巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导分化的人单核细胞来源巨噬细胞的细胞培养方案。该方案采用单核细胞的冷冻保存，并将其大规模分化为巨噬细胞。随后，收获的巨噬细胞可根据实验需求以特定的细胞密度接种至培养孔中进行后续实验。...

集落刺激因子培养分化的人单核细胞来源巨噬细胞

我们提出了一种获取人类巨噬细胞蛋白质组特征的方案，并将其应用于研究低氧环境对巨噬细胞极化的影响。...

低氧环境下人巨噬细胞极化的蛋白质组学分析

本方案提供了一种研究结核分枝杆菌（Mycobacterium...

结核分枝杆菌感染后人单核细胞来源的M1和M2极化细胞的制备及流式细胞术分析

本文介绍了一种评估植入物表面免疫调节潜力的详细实验方案 体外旨在提高现有实验方案的可靠性和可重复性，并推动进一步研究。通过使用人外周血单核细胞来源的巨噬细胞，检测其在钛材料表面培养时的分泌性细胞因子谱、mRNA表达及细胞表面标志物，以研究巨噬细胞的极化状态。...

在植入物表面极化并表征人单核细胞来源的M1与M2型巨噬细胞

单核细胞和巨噬细胞是具有高度可塑性和可重编程性的免疫细胞，在健康与疾病中发挥关键作用。它们通过启动特定的分化程序和表型，感知并响应多种多样的刺激。我们已建立了一种标准化的 体外...

人源单核细胞来源巨噬细胞的重编程模型 体外 检测方法

我们对现有的单核细胞-单层试验（MMA）进行了改进并更新了方法，该试验利用巨噬细胞帮助更好地预测输血医学和免疫学中红细胞同种抗体的临床相关性。该试验被命名为单核细胞-巨噬细胞试验（M-MA）。...

利用单核-巨噬细胞试验预测红细胞抗体的临床意义

了解如何使用THP-1单核细胞系在14天内分化和极化为M2样巨噬细胞。该标准化方案为研究肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤微环境中的抗炎作用提供了可重复的模型。

利用人单核样THP-1白血病细胞系诱导巨噬细胞分化并极化为M2样表型

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