立体定向病毒注射和梯度指数晶状体植入术用于深部脑 体内 钙成像

Miniscope体内钙成像使研究人员能够检查自由行为动物深部大脑结构中数百个神经元的空间和时间协调活动。Miniscope体内钙成像具有许多优点，包括能够进行细胞类型特异性，大规模和纵向的记录。我们用于病毒注射和GRIN晶状体植入的手术方案与任何商业或定制单光子和双光子成像系统兼容，用于深部脑体内钙成像。

演示该程序的将是来自我实验室的研究生Rashmi Thapa。对麻醉小鼠剃光的手术区域进行消毒后，使用手术刀沿着中线穿过皮肤做一个两厘米的切口，以暴露颅骨的λ和胸骨。将0.5毫米牙钻毛刺定位到前后1.94毫米和内侧距前后0.5毫米的位置后，开始钻穿颅骨。

接下来，使用微型泵的控制面板将病毒加载到微升注射器中，并以每秒50纳升的流速抽出500纳升气泡，然后抽出800纳升病毒。将针头缓慢向下移入脑组织，到达背侧腹侧的目标Z坐标1.75毫米，然后略微向上移动到背腹侧1.65毫米的Z坐标。在控制面板上，设置微型泵以每分钟50纳升的流速注入500纳升病毒，然后点击"运行"按钮注射病毒。

注射结束后，将皮肤边缘对齐，并用4-0缝合线小心地关闭切口。在缝合区域涂抹抗生素软膏以防止感染。要植入梯度指数或GRIN镜片，请使用细剪刀切除从眼睛之间的前侧到λ后面的后侧的皮肤的1.5厘米高和1.5厘米基部的三角形区域。

彻底清洁和干燥颅骨后，将氰基丙烯酸酯涂抹在皮肤边缘，并将皮肤附着在头骨上。当氰基丙烯酸酯干燥五分钟后，将直径为1.2毫米的牙钻毛刺定位到前后1.94毫米的位置，内侧距前部距前部0.8毫米。钻穿头骨，然后使用30号针尖去除硬脑膜。

用45度角尖锐的镊子清洁所有骨屑。接下来，将一根27号手动抛光的钝端针连接到针架上，该针架与倾斜角度为10度的机械臂相连，并将针架的另一端连接到房屋真空系统。找到针尖，只需触摸布雷格玛，然后点击布雷格玛按钮将布雷格玛的Z坐标设置为零。

将输入 X 值设置为 0.8，将输入 Y 值设置为 1.94，将输入 Z 值设置为 1.0，然后单击"查找"按钮将针移动到颅骨上钻孔的顶部。将针尖居中到钻孔，然后将其降低到 Z 位置零。打开真空吸尘器，开始用人工脑脊液（ACSF）冲洗暴露的大脑区域，通过重力控制的导管系统连接到带有弯曲尖端的30号针头。

ACSF在通过0.2微米过滤器过滤时，用95%氧气和5%二氧化碳的气体混合物连续起泡。使用AutoStereota软件，脑组织的抽吸将在四轮中完成。对于第一轮抽吸，请确保 Z 值显示为零。

然后在 zStep 会话中，单击并检查第一行和第二行。将第一行的值设置为 0.2 和 1。将第二行的值设置为 0.15 和 4。

在模式会话中，将指针大小设置为 27 号和 1.2。设置调光 0.9。所有其他值将是默认值。

要开始吸气，请依次单击"非设置"、"保持零"和"开始"按钮。第一轮抽吸产生一个深度为0.8毫米，直径为1毫米的柱形口袋。在第三轮抽吸中，单击并检查 zStep 会话的第一行，并将第一行的值设置为 1.8 和 1。

在模式会话中，将指针大小设置为 27 号和 2.2。通过保持其他值与上一轮相同的值来开始愿望。第三轮抽吸后，柱袋的深度为1.8毫米。

最后一轮抽吸是清理积聚在口袋底部的血液。在 zStep 会话中将第一行的值设置为 1.6 和 1，并在开始吸气之前，在模式会话中将针尺寸设置为 27 号和 2.2 和 Dims 0.6。一旦口袋没有血液，停止真空，停止ACSF的灌溉，并将针头在Z坐标和中心前0.5毫米处向上移动。

将无菌的1毫米GRIN镜片放入脑组织口袋中。接下来，在刮刀的帮助下，将融化的琼脂糖涂抹在GRIN晶状体和脑组织之间的间隙中。琼脂糖形成凝胶后，使用微刀片除去多余的琼脂糖。

将牙科水泥粉和催化剂液体在预冷的混合孔中混合，并在颅骨上涂上一层自固化的粘合剂树脂水泥，首先包围GRIN镜片，然后覆盖整个暴露的颅骨。在干净的塑料井中，将牙科水泥粉和黑炭与液体混合，在第一层牙科水泥的顶部涂上一层薄薄的混合物。让它硬化五分钟。

将Miniscope连接到电缆，然后打开定制开发的软件NuView。在 NuView 中，单击硬件，选中 LED1，然后单击"流"按钮以查看实时图像。要停止直播，请单击"停止"按钮。

接下来，将Miniscope固定到定制的Miniscope握持臂中。在电动控制器的帮助下，将Miniscope定位在裸露的GRIN镜头的正上方，使其平行于镜头表面。慢慢地将迷你瞄准镜朝向GRIN镜头，并调整其Z位置，直到找到最佳焦距平面。

在Miniscope底座周围涂上第一层牙科水泥，而不改变Miniscope的位置。水泥硬化后，轻轻取下固定臂，使Miniscope可以独立站在鼠标头上。在底座周围涂上第二层牙科水泥以填充所有间隙，确保间隙中没有LED光泄漏。

让牙齿水泥变硬。用异氟醚短暂麻醉鼠标后，在取下保护帽之前，用小螺丝刀拧松底座中的锁定螺钉，并用丙酮浸泡的棉签清洁GRIN镜片的表面。将Miniscope连接到电缆并启动NuView软件，以开始识别最佳焦平面，方法是在钝镊子的帮助下稍微收紧或松开，从而调整Miniscope相对于底座的位置。

确定最佳焦平面后，拧紧锁定螺钉，然后断开电缆并将鼠标放回其主固定架中。打开行为摄像头软件，通过实时流功能查看鼠标行为竞技场。手动调整顶部相机的焦点。

选择触发频闪并选中启用/禁用触发器，然后单击"录制"按钮。然后使用"浏览"选择保存行为记录的位置。选择所需的图像格式。

将鼠标靠近竞技场，并将Miniscope连接到连接到数据采集系统的电缆。然后将鼠标放在竞技场的中心。在行为摄像头软件中，单击"开始录制"。

在NuView中，选中LED1，单击"捕获"，然后单击触发按钮开始录制。这允许同时记录钙成像和小鼠行为。点击 停止 后 3， 000 帧并保存文件。

记录完成后，用异氟醚短暂麻醉小鼠，从底座上取下Miniscope并将保护帽放在底座上，然后将鼠标放回其主笼中。来自次优体内钙成像的细胞图谱包含一些活动神经元，而来自成功成像的细胞图包括聚焦区域中的数百个活动神经元。在不成功的体内钙成像的典型例子中，观察到该区域是黑暗的，并且包含少于五个活跃的神经元，或者该区域是明亮的但没有活跃的神经元。

在代表性分析中，显示了来自连续体内钙成像记录的最大投影荧光细胞图和钙瞬变。对实验小鼠内侧PFC中GCaMP6f表达和GRIN晶状体植入的尸检评估表明，GCaMP6f表达并且GRIN晶状体被精确地植入所需的大脑区域。为了获得良好的钙成像，有必要在植入GRIN晶状体之前确保出血完全停止并且视野中没有血凝块。

该技术可用于研究不同人脑疾病的小鼠模型中的神经回路变化，并测试候选药物是否可以使改变的回路正常化。