炎症性半月酶诱导的人单核细胞来源巨噬细胞邻近性的可视化

该协议描述了从人血液样本中获取单核细胞来源巨噬细胞（MDM）的工作流程，一种在不损害细胞活力和行为的情况下将炎症半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）报告基因有效引入人MDM的简单方法，以及一种基于成像的方法来测量活细胞中的炎症半胱天冬酶活化。

该协议具有重要意义，因为它可用于在特定疾病状态下的活细胞中分子水平上可视化和询问炎症半胱天冬酶途径。该技术的主要优点是它可用于鉴定原代免疫细胞中炎症半胱天冬酶活化复合物的成分，要求和定位。通过微小的优化，该方法可以适应其他原代细胞和通过寡聚化激活的一系列蛋白质，并且其适用性不仅限于微观方法。

首先，在10厘米培养皿上从完全分化的巨噬细胞中吸取培养基，并用温热的血清游离RPMI-1640培养基洗涤细胞单层，完全除去所有培养基。通过每10厘米培养皿中加入两毫升0.25%温胰蛋白酶- EDTA溶液来收获细胞。用P-1000微量移液管轻轻地将胰蛋白酶-EDTA上下移液到整个培养皿上，然后将悬浮液转移到含有5毫升温完全培养基的15毫升锥形管中。

在明场显微镜下检查细胞脱落，并在需要时再次分离。吸出培养基并将细胞重悬于10毫升预热至37摄氏度的1X无菌PBS中。然后取20微升等分试样，使用血细胞计数器确定细胞数。

每次转染10至5个细胞，取1至2次，并将其放入15毫升管中。将最终体积为15毫升，预热的1X无菌PBS。吸出PBS，并以250×g离心一次，持续一分钟。

使用P-200微量移液管从细胞沉淀中除去任何残留的PBS。每次转染服用1.5毫升无菌微管，并在烟罩中加入适当的报告质粒和半胱天冬酶BiFC质粒。将移液器站、设备、吸头、电穿孔管和移液器放在无菌层流罩中。

连接并打开核体测量设备。在显示的启动屏幕中输入事务参数。按"电压"，输入 1000，然后按"完成"将其设置为 1000 伏。

按"宽度"，输入 40，然后按"完成"将脉冲设置为 40 毫秒。最后，按脉冲，输入 2，然后按完成将电脉冲数设置为 2。取其中一个电穿孔管，并在室温下用三毫升电解缓冲液E填充。

将电穿孔管插入移液器站上的移液器支架中，确保管子侧面的电极朝内，并且在插入管子时听到咔嗒声。取细胞沉淀，向第五个细胞中加入10微升预热的重悬R缓冲液，每次1至2次10次，并与P-20微量移液管轻轻混合。向每个转染管中加入10微升细胞悬浮液，并与P-20微量移液管轻轻混合。

通过按下按钮到第二个停止点将吸头插入移液器，确保夹具完全拾取吸头中活塞的安装杆。接下来，按下移液器上的按钮到第一个停止点，然后浸入第一个含有细胞或质粒DNA混合物的管中以吸出样品。将带有样品的移液器非常小心地插入移液器支架中，确保移液器卡住并正确放置。

在触摸屏上按"开始"，然后等待电脉冲发出。从工作站中缓慢取出移液器，然后通过缓慢按下按钮到第一个停止处，立即将横切的细胞悬浮液与预热的无抗生素培养基一起加入相应的孔中。用横切细胞轻轻摇动板，并在加湿的组织培养箱中孵育一到三个小时，然后向每个孔中加入200微升预热的培养基。

将培养皿放入培养箱中，等待至少24小时的基因表达。第二天，使用落射荧光显微镜检查细胞活力和转染效率。用P-1000微量移液管小心地从细胞中取出培养基，并在孔的侧面加入500微升的刺激溶液。

要运行未经处理的控制孔，请添加没有刺激的成像介质。要使用落射荧光或共聚焦显微镜观察细胞，请按照说明打开显微镜和荧光光源。选择10倍或20倍物镜，并将培养皿放在显微镜载物台上。

使用目镜在568纳米滤光片下找到细胞。并专注于表达报告基因红细胞的细胞。计算视野中的所有红细胞。

在同一视野中，更改为 488 或 512 过滤器，计算同样为绿色的红色单元格的数量。计数至少100个至少三个字段的红色单元格。计算每个视野中金星阳性横切细胞的百分比，并平均每个治疗孔的结果百分比，以获得标准偏差。

要使用落射荧光或共聚焦显微镜对细胞进行成像，请在计算机屏幕上可视化由相机获取的细胞的实时图像。使用操纵杆控制和对焦轮微调单元的焦点和位置。设置512纳米或488纳米和568纳米激光器的百分比激光功率和曝光时间，以使图像中的信号看起来良好而不会饱和。

打开实时捕获并检查生成的图像，确保在两个通道的显示直方图中，每个楼层都可以看到不同的峰值。在可视化细胞的实时图像时，拍摄一个场的多个代表性图像，该场包含一个或多个细胞，这些细胞表达板中每个孔的mCherry或dsRedmito报告基因。与GM-CSF一起孵育七天的选定的CD-14阳性单核细胞在分化期间显示出细胞形态的变化，从球形悬浮细胞到旋转和完全附着，最后，在完全分化时到更多的扩散细胞。

用半胱天冬酶BiFC对VC和VN以及报告质粒dsRedmito横切分化完全分化的细胞，用于标记横切细胞。未经处理的细胞没有金星荧光。在尼日利亚红素处理的细胞中，半胱天冬酶-1 BiFC以单一的点状物出现，具有ASC斑点的典型形状。

Venus阳性MDM的定量显示，在LPS加nigericin治疗组中，半胱天冬酶-1 BiFC的百分比最高。在半胱天冬酶-1、4 和 5 亲 BiFC 对的质粒滴定中，金星阳性细胞的比例最高分别来自 400、500 和 1，000 纳克横切质粒。在横断术后24小时用细胞场的20倍物镜获得的共聚焦图像表明，未经处理的横切细胞是有活力的，因为线粒体是完整的。

用血红素治疗后，半胱天冬酶-1复合物表现为类似于尼日利亚霉素诱导的单个绿色点。请记住，在分化、转染和治疗过程中避免苛刻的条件和对细胞的过度操作，因为它会导致自发活化和高背景水平的半胱天冬酶活化。