Name: 使用3D体积视图图像检测和定量隧道纳米管 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: 学习使用三维体积视图图像检测和定量隧道纳米管的方法，通过共聚焦Z-stack成像技术识别F-肌动蛋白阳性结构。该技术有助于研究神经退行性疾病和癌症中的细胞间通讯机制。

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D.K.V 和 A.R 感谢印度马尼帕尔高等教育学院提供的 TMA Pai 奖学金。我们感谢印度科学与工程研究委员会（SERB-SRG，项目编号 #SRG/2021/001315）、印度医学研究委员会（项目编号 #5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I）以及印度马尼帕尔高等教育学院的院内基金。我们感谢印度贾瓦哈拉尔·尼赫鲁高级科学研究中心（JNCASR）的共聚焦成像平台，以及 B. Suma 在 JNCASR 提供的共聚焦显微镜技术支持。

注意：在 DMEM/F-12 培养基中培养的 SH-SY5Y 细胞，用 10 µM 视黄酸分化 7 天后，在 37 °C（5% CO2）条件下用 1 µM oAβ 寡聚体处理 2 小时。处理后，细胞用 Karnovsky 固定液固定，并用磷酸化 PAK1（Thr423）/PAK2（Thr402）抗体和 F-肌动蛋白结合性鬼笔环肽进行双重免疫荧光染色。随后，使用共聚焦激光扫描显微镜采集共聚焦 z 轴层扫图像。通过手动计数对隧道纳米管（TNTs）进行定量，并通过构建三维体积视图图像，根据其悬浮于两个细胞之间且不接触基质的特征，将其与其他神经突起/细胞突起区分开来（图 1）。
1. 细胞培养与分化
<ol>
	<li>在 DMEM/F12（Ham's）培养基中培养 SH-SY5Y 神经细胞，培养基配制比例为 1:1，添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素-新霉素混合液（PSN）。将细胞接种于 35 mm 成像培养皿中，培养皿中央设有 14 mm 孔，孔底固定有 #1.5 盖玻片。接种密度为 12,000 个细胞/cm2，实验在细胞融合度达到 60%–70% 时进行。</li>
	<li>使用 10 µM 视黄酸（RA）对细胞进行部分诱导分化，RA 来自 100 mM 储存液（将 5 mg RA 溶于 15 mL 二甲基亚砜 [DMSO] 中）。随后将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 7 天以完成分化，每 2 天更换一次培养基。 
	注意：需注意维持细胞融合度（60%–70%），包括未分化细胞和部分分化细胞。细胞密度可能影响细胞间隧道纳米管（TNTs）的形成。</li>
</ol>
2. 制备用于处理神经元细胞的β-淀粉样蛋白1-42寡聚体（oAβ）
<ol>
	<li>将 Aβ1-42 (1 mg) 溶解于 200 µL 的 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇中，并将溶液分成 20 份等分试样，每份含有 0.05 mg 肽。冷冻干燥后于 −20 °C 保存，以备后续使用。</li>
	<li>通过向 0.05 mg 冷冻干燥的肽中加入 2.2 µL DMSO，制备冷冻干燥 Aβ1-42 的储备液（5 mM）。为充分溶解肽，涡旋混合溶液，并在水浴超声仪中进行 2 分钟的超声处理。</li>
	<li>用 DMEM（pH 7.4）将储备液稀释至 100 µM 的浓度，涡旋混合以使肽转化为单体，随后在 4 °C 下孵育 24 小时，以获得 Aβ1-42 (oAβ) 的寡聚体12,21,22。</li>
	<li>在实验前通过透射电子显微镜成像对 oAβ 进行表征，方法如先前报道21,22。</li>
	<li>用 1 µM oAβ 处理部分分化的 SH-SY5Y 细胞。处理前移除培养基，并加入新鲜的无 FBS DMEM。换液后，将先前制备的 oAβ（100 µM）加入培养基中，使其终浓度为 1 µM。在 37 °C（5% CO2）条件下，用 1 µM oAβ 孵育细胞 2 小时。设置未处理细胞作为阴性对照。</li>
</ol>
3. 用于表征隧道纳米管的F-actin和活化型PAK1免疫染色
<ol>
	<li>使用磷酸化 PAK1（Thr423）/PAK2（Thr402）抗体和结合 F-肌动蛋白的鬼笔环肽（phalloidin）进行差异免疫染色。</li>
	<li>在固定前，用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤对照组和 oAβ 处理的细胞，每次 2 分钟，共洗 2 次。配制 Karnovsky 固定液：将 2% 甲醛固定剂和 2.5% 戊二醛溶解于 0.1 M 磷酸缓冲液（pH 7.2）中。然后，在成像培养皿中加入 Karnovsky 固定液（用量以刚好覆盖细胞为宜），于室温固定 45 分钟。</li>
	<li>固定后的细胞用孵育缓冲液洗涤 2 次，每次 2 分钟。配制 20× 孵育缓冲液：将 0.1 g 皂苷溶解于 5 mL 胎牛血清（FBS）中，再用 95 mL 的 1× PBS 稀释至 1×。</li>
	<li>固定后，在孵育缓冲液中按 1:250 稀释比例加入抗磷酸化 PAK1 的一抗，于 4 °C 黑暗湿盒中孵育过夜。</li>
	<li>次日，经过 24 小时孵育后，用孵育缓冲液洗涤细胞 2 次，每次 2 分钟；然后加入 Alexa Fluor 488 标记的二抗（1:1,000 稀释）和 Phalloidin 555（1:1,000 稀释）。在黑暗湿盒中室温孵育 1.5 小时。</li>
	<li>孵育结束后，用孵育缓冲液洗涤细胞 2 次，每次 2 分钟。加入 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行细胞核染色（1:2,000 稀释），室温避光孵育 5 至 10 分钟。</li>
	<li>配制 DABCO 封片剂：将 25 mg DABCO 溶解于 90% 甘油和 10% 1× PBS 混合液中。为充分溶解，使用分光纯级稀盐酸（用水稀释 1:20）调节 pH 至 8.6，并将溶液置于摇床上持续混匀。</li>
	<li>作为抗荧光淬灭剂，直接将 DABCO 封片剂滴加至底部带有盖玻片的成像培养皿中。静置至少 1–2 小时后，直接进行共聚焦显微成像。 
	注意：无需使用任何粘合剂固定盖玻片。</li>
</ol>
4. 通过F-actin和β-III微管蛋白免疫染色区分隧道纳米管与神经突
<ol>
	<li>使用 β-III 微管蛋白抗体和 F-肌动蛋白结合性毒蕈肽（phalloidin）进行差异免疫染色。</li>
	<li>在加入卡诺夫斯基固定液之前，用 1× PBS 将经 oAβ 处理的细胞洗涤 2 次。室温下孵育 45 分钟，再用孵育缓冲液洗涤细胞 2 次，每次 2 分钟。</li>
	<li>固定后，在孵育缓冲液中按 1:250 稀释抗 β-III 微管蛋白（TUBb3）抗体，于 4 °C 在避光湿盒中过夜孵育。</li>
	<li>次日，用孵育缓冲液洗涤细胞 2 次（每次 2 分钟），然后在同一培养皿中同时加入与 Alexa Fluor 488 偶联的二抗（1:1,000 稀释）和 Phalloidin 555（1:1,000 稀释），于室温避光湿盒中孵育 1.5 小时。</li>
	<li>用孵育缓冲液洗涤细胞 2 次，再加入核染料 DAPI（1:2,000 稀释），室温避光孵育 5–10 分钟。</li>
	<li>如上所述，在封片剂中加入抗淬灭剂 DABCO，成像前静置 2 小时。</li>
</ol>
5. 共聚焦显微镜成像
<ol>
	<li>为鉴定隧道纳米管（TNTs），使用共聚焦激光扫描显微镜对免疫染色的细胞采集z轴层扫图像。采用40x/1.40油镜微分干涉差（DIC）物镜，并结合DAPI、异硫氰酸荧光素（FITC）和四甲基罗丹明（TRITC）滤光片组进行成像。</li>
	<li>首先，在共聚焦软件中依次点击Track 1、Track 2和Track 3窗口中的所需激光器，以选择通道。然后点击Track 1窗口下方的T-PMT选项，以便在荧光通道下同时采集微分干涉差（DIC）图像。 
	注意：DIC图像由标记为T-PMT的不同探测器采集。</li>
	<li>选择软件中的采集选项卡，点击Z-stack选项，等待窗口弹出。随后点击live scan，将培养皿底部的细胞调至清晰对焦，并将该图像设为第一层。接着向上调焦至细胞最顶端，将该图像设为最后一层。停止实时扫描，并点击optimal选项旁的数值，以固定各层之间的步进大小。步进大小根据细胞厚度决定切片数量和层间间隔。 
	注意：步进大小应依据奈奎斯特采样定理（Nyquist sampling）设定，以确保采集足够多的切片且相邻层之间无间隙。奈奎斯特采样基于所用物镜及光源波长确定23。</li>
	<li>使用405 nm、488 nm和561 nm激光器，依次采集DAPI、FITC和TRITC三个通道的图像，像素驻留时间（pixel dwell time）设为1.02 µs。同时在荧光通道下采集DIC通道图像，以观察细胞边界。</li>
	<li>采集一组图像堆栈，其x轴和y轴尺寸分别为224.92 µm&#160;和224.92 µm，每个像素大小为220 nm2，z轴缩放（z-scaling）为415 nm。</li>
	<li>从细胞底部到顶部采集多个z轴层扫图像（15–22层）。在培养皿的随机视野中至少采集10幅图像，总计获得约200–300个细胞。</li>
	<li>离线分析所采集的图像，通过三维体积视图分析鉴定隧道纳米管（TNTs）。</li>
</ol>
6. 分析共聚焦z轴层扫图像以识别和定量膜纳米管（TNTs）
<ol>
	<li>在 Fiji 软件中打开以 .czi 数据格式保存的共聚焦图像进行分析。</li>
	<li>选择 Hyperstack 选项以查看图像的每个 z 层切片和通道。查找 z 层切片和通道的 hyperstack，它们将显示在同一个窗口中，如 图 2 所示。滚动通道（由红色和绿色箭头指示）和 z 层切片（由蓝色箭头指示）的滚动条，以选择特定感兴趣通道的精确层切片。 
	注意：在固定细胞中，由于悬浮的 TNTs 或膜样通道位于表面之上，这些结构在 z 层切片的较低部分不可见。然而，在固定细胞中，神经突起位于表面，在 z 层切片的较低部分（z = 0 到 2）可被检测到。识别步骤参见 图 2。</li>
	<li>如 图 2 所示，首先通过滚动通道条选择 F-肌动蛋白染色的通道（由红色箭头指示），然后手动滚动 z 层切片（由蓝色箭头指示），逐层查看每一层。将出现在 z 层切片较低部分、靠近成像培养皿表面（z = 2）且似乎连接细胞的 F-肌动蛋白染色结构识别为神经突起（由白色箭头指示）。 
	注意：大多数神经突起易于识别，因其呈现为延伸的突起结构（由粉色箭头指示）。</li>
	<li>通过将 z 层切片向顶部滚动（从 z = 4 开始，如 图 2 所示，由黄色箭头指示），识别 F-肌动蛋白阳性、悬浮于细胞之间的 TNTs。观察 z 层切片较低部分靠近表面的神经突起，并注意随着 z 层切片向顶部滚动（在 z = 6 处，如 图 2 所示），这些神经突起逐渐消失（神经突起不再清晰可见）。</li>
	<li>通过分析 z 层切片中通道的悬浮特性，类似地识别磷酸化 PAK1（phospho-PAK1）阳性的 TNTs。由于 phospho-PAK1 染色弱于 F-肌动蛋白染色，应在 z = 4（微弱可见）和 z = 6（明显可见）处寻找 phospho-PAK1 染色的 TNTs。</li>
	<li>进一步观察 DIC 图像，以确认 F-肌动蛋白和 phospho-PAK1 染色的 TNT 结构是细胞之间的膜样通道（图 3）。此外，合并 F-肌动蛋白（红色）和 phospho-PAK1（绿色）通道，以验证所识别的 TNTs 为 F-肌动蛋白与 phospho-PAK1 共染色的结构（图 3）。</li>
	<li>为定量分析 TNTs，需手动计数总细胞数和已识别的 TNTs 数量，并将结果以百分比形式表示。</li>
	<li>为从 z 层切片图像中区分 F-肌动蛋白阳性 TNTs 与 β-III 微管蛋白（TUBb3）阳性、类似 TNT 的悬浮通道，合并 F-肌动蛋白（红色）和 TUBb3（绿色）通道（图 4），然后分析合并图像的 z 层切片。
	<ol>
		<li>寻找仅由 F-肌动蛋白染色的 TNTs，其在 z = 3 处微弱可见，在 z = 6 和 z = 9 处明显可见（黄色箭头）。类似地，在 z = 6 和 z = 9 处识别 F-肌动蛋白与 β-III 微管蛋白（TUBb3）双阳性、类似 TNT 的悬浮通道（青色箭头）。从 z 层切片的较低部分识别其他 F-肌动蛋白和 β-III 微管蛋白染色的非悬浮突起结构（白色箭头）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Fiji 中的 line 工具测量 TNTs 的直径。通过点击 分析 | 设置比例尺（Analyze | Set Scale） 验证测量尺度，使 &#34;像素距离&#34; 从 .czi 图像中自动设定。在 xy 平面上测量 TNTs 的直径。 
	注意：大多数直径介于 1 像素至 4 像素之间（即 220–880 nm）；每个像素为 220 nm。有关 z 层切片共聚焦图像分析流程的总结，请参见 图 5。</li>
</ol>
7. 对 z 轴堆叠图像进行三维重建以表征膜纳米管（TNTs）
<ol>
	<li>在 Fiji 中使用volume viewer插件，该插件支持三维切片和基于阈值的三维可视化（图6）。</li>
	<li>将z轴堆栈图像拆分为各个通道，然后裁剪单通道（F-肌动蛋白通道）的z轴堆栈图像，利用3D重建视图一次突出显示一条或两条隧道纳米管（TNT）或神经突。启用volume view插件以查看xy、yz和xz平面。</li>
	<li>在xy平面中固定一条单独的TNT或神经突（图6A中的白色箭头表示神经突；图6B中的黄色箭头表示TNT），并标记xz（红色）和yz（绿色）轴的横截面。在xz和yz平面中观察位于xz平面底部的神经突（白色箭头，图6A），以及位于上层z堆栈中的TNT（黄色箭头，图6B）。</li>
	<li>选择单个TNT或神经突，在xz平面中重建三维体积视图（图6C、D）。在三维重建中，观察位于z平面底部的神经突（白色箭头，图6C），而TNT表现为悬浮结构，连接两个细胞且不接触底部z平面（黄色箭头，图6D）。</li>
</ol>

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<li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

过去二十年中，许多研究人员一直致力于理解并表征隧道纳米管（TNTs）的结构18。由于缺乏特异性标记物，研究进展受到阻碍，因此迫切需要一种便捷、标准化的方法，用于识别、表征和定量TNTs。TNTs被定义为基于F-肌动蛋白的膜性通道，悬浮于两个细胞之间。研究表明，β-微管蛋白阳性、末端封闭的发育中神经突起可在两个远距离细胞之间延伸，并呈现出类似TNT的结构12,13。因此，TNTs通过仅表达肌动蛋白、且作为悬浮于两个远距离细胞之间的膜性通道这一特征，与神经突起及其他类TNT结构相区分。研究人员在成像前固定过程中常常难以获得完整的TNT结构24。为解决这一问题，我们采用含2.5%戊二醛的改良固定液（Karnovsky固定液）对本实验方案中使用的SH-SY5Y神经细胞进行固定25。
每个免疫组织化学/免疫细胞化学实验的关键步骤都是样...

隧道纳米管（TNTs）是基于F-肌动蛋白的、主要为开放末端的膜性通道，在细胞间物质和细胞器的转运中发挥重要作用1TNTs 的独特特征在于它们能够在不与基质接触的情况下连接相邻细胞，其长度超过 10–300 µm，直径在 50 nm 至 1 µm 之间。2,3. 膜纳米管是瞬态结构，其寿命从几分钟到数小时不等。膜纳米管最初在PC12神经细胞中被发现1；随后，大量研究证实了它们存在于多种细胞类型中 体外 和 体内4,5多项研究揭示了隧道纳米管（TNTs）在多种疾病模型中的病理学意义，例如神经退行性疾病、癌症和病毒感染6,7,8.
多项研究已在不同的细胞系统中证实了隧道纳米管（TNTs）的结构异质性9。这些差异主要基于细胞骨架组成、形成机制以及所转移的货物类型10。通常认为，存在于两个相邻细胞之间、开放末端且富含F-肌动蛋白的膜连续结构，能够转移细胞器，属于隧道纳米管（TNTs）的范畴11。然而，由于TNTs在形成过程中存在不明确性或多样性，导致难以开发出特异性的TNT标记物。因此，使用常规检测方法难以识别TNT结构，并难以区分开放末端与封闭末端的膜纳米管突起12。不过，TNTs作为F-肌动蛋白介导的膜突起悬浮于两个细胞之间的特征，相对更容易通过常规成像技术进行识别和验证。其他基于肌动蛋白的细胞突起，如丝状伪足和背侧丝状伪足，无法在两个相隔较远的细胞之间形成悬浮连接，尤其是在细胞固定后更是如此。值得注意的是，那些封闭末端、具有电耦合特性且正在发育的神经突起，常被称为类似TNT的结构13。
已知F-actin在隧道纳米管（TNT）的形成中发挥重要作用，多项研究表明，F-actin抑制剂细胞松弛素D可抑制TNT的形成14,15。相反，微管抑制剂对TNT的形成没有影响16。过去二十年间，已有大量报道揭示TNT在病理传播、肿瘤耐药及治疗中的重要作用17。因此，对更优的TNT表征技术的需求始终存在。
由于缺乏特异性的隧道纳米管（TNT）标记物，且其形态和细胞骨架组成具有多样性，因此难以建立一种统一的表征方法。一些研究已采用自动图像检测和TNT定量技术18,19。然而，与自动图像分析相比，当前的三维体积手动分析方法在TNT的检测与定量方面具有多项优势。通常情况下，经过训练的人眼比自动图像检测方法更容易识别这些悬浮的纳米结构。此外，对于缺乏算法专业知识的实验室而言，自动检测方法可能难以实施。由于该方法具有较高的精确性和可重复性，因此可被广大研究人员广泛采用。
在最近的一项研究中，我们发现寡聚态Aβ可促进神经元细胞中隧道纳米管（TNTs）的生成 通过 一种由PAK1介导的、依赖肌动蛋白的内吞机制12.oAβ诱导的隧道纳米管（TNTs）也表达活化的PAK1（即磷酸化PAK1）。我们开发了一种三维体积成像重建方法，用于区分由oAβ诱导、经F-actin和磷酸化PAK1免疫染色标记的隧道纳米管。β-III微管蛋白阳性的发育中神经突起常呈现出类似隧道纳米管的悬浮结构20因此，我们进一步将基于F-actin的隧道纳米管（TNTs）与β-III微管蛋白阳性的神经突以及其他类似TNT的突起区分开来。通过三维体积视图图像，可根据其悬于基质之上并连接两个相邻细胞的特征来识别TNTs。本文描述了利用共聚焦z轴层扫图像对含肌动蛋白的膜通道或TNTs进行识别与检测，并最终通过三维体积视图重建图像对所识别结构进行人工定量分析。该方法无法区分真正具有开放末端的TNTs与末端闭合的类似TNT结构；但该方法有助于在 体外 在平面基质上的二维细胞培养。然而，该方法易于实施和重复，可广泛用于基于肌动蛋白的隧道纳米管（TNTs）的精确量化，并将其与神经突起及β-微管蛋白阳性的TNT样结构区分开来。

<table><tbody><tr><td>35 mm 培养皿，内含 14 mm 直径的 #1.5 盖玻片材质小室</td><td>Cellvis</td><td>D35-14-1.5-N</td><td>用于接种细胞以进行染色实验的成像培养皿</td></tr><tr><td>A&amp;beta; &lt;sub&gt;(1-42)&lt;/sub&gt; 1 mg</td><td>AnaSpec</td><td>#64129</td><td>用于处理细胞的β-淀粉样蛋白寡聚体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG（H+L）</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td>磷酸化PAK1的二抗</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>赛默飞世尔科技（MSC Advantage）</td><td>51025411</td><td>在细胞培养过程中提供无菌条件</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技公司（Heraeus Hera Cell 240）</td><td>51026556</td><td>用于在体温或接近体温条件下培养细胞</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>ZEISS（卡尔·蔡司）</td><td>LSM 880</td><td>能够以超分辨率生成大尺寸样本的三维图像</td></tr><tr><td>DABCO [1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷]</td><td>默克</td><td>8034560100</td><td>抗淬灭剂</td></tr><tr><td>DAPI（4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚)</td><td>Sigma</td><td>D9542-1MG</td><td>核染剂</td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>用于制备 100 μM 的 A&amp;beta; (1-42)</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;DMEM/F12（DMEM与Ham&amp;rsquo;s F12</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td>SH-SY5Y细胞培养基</td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）细胞培养级</td><td>冷冻纯化</td><td>CP-100</td><td>用于溶解视黄酸的细胞培养级溶剂</td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）分子生物学级</td><td>Himedia</td><td>MB058</td><td>用作冻干A的溶解剂之一&amp;beta; (1-42)</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>&amp;nbsp;培养基主要添加剂（美国来源）</td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林固定液（10%）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT5014-120ML</td><td>Karnovsky固定液中的组分</td></tr><tr><td>戊二醛（I 级，25% 水溶液）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td>Karnovsky固定液中的组分</td></tr><tr><td>HFIP（1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇）溶液</td><td>TCI</td><td>H024</td><td>用于溶解 A&amp;beta; (1-42) 1 mg</td></tr><tr><td>图像处理/分析软件：FIJI（ImageJ）</td><td>美国国立卫生研究院（NIH）</td><td></td><td>用于处理和分析图像，并利用其名为的插件区分TNTs与神经突 &quot;体积查看器&quot;.</td></tr><tr><td>冻干机</td><td>克里斯特，阿尔法</td><td>2.4 LDplus</td><td>0.05 mg 的 A 等分试样&amp;beta; (1-42) 可在 -20 保存 &amp;deg;冻干后仅含 C</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-新霉素混合液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15640055</td><td>抗生素混合物</td></tr><tr><td>鬼笔环肽-iFlor 555</td><td>Abcam</td><td>ab176756</td><td>F-肌动蛋白结合染色</td></tr><tr><td>磷酸化-PAK1（Thr423）/PAK2（Thr402）[兔]</td><td>CST</td><td>#2601</td><td>一抗</td></tr><tr><td>多克隆抗体抗微管蛋白 β3（TUBb3）</td><td>云克隆</td><td>PAE711Hu01</td><td>一抗</td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>分化试剂</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>默克</td><td>8047-15-2</td><td>免疫染色中孵育缓冲液所用的去垢剂</td></tr><tr><td>水浴超声波清洗器（四分之一加仑，带排水阀加热器）</td><td>超声波清洗机</td><td>3.0 L/3.2</td><td>用于溶解 A 的超声波破碎仪&amp;beta; (1-42) 储液，在制备100时加入DMSO后 &amp;micro;M A&amp;beta; (1-42)</td></tr><tr><td>ZEN 显微成像软件</td><td>ZEISS（卡尔·蔡司）</td><td></td><td>具有智能自动化的共聚焦显微镜成像软件</td></tr></tbody></table>

利用三维体积视图图像检测与定量隧道纳米管

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

近期研究发现，细胞能够进行直接的长距离细胞间物质传递 通过 纳米尺度的肌动蛋白-膜通道，即 &#34;隧道纳米管&#34; （膜纳米管）。膜纳米管被定义为开放末端、由脂质双层包裹的膜性突起结构，直径介于50 nm至1 µm之间，可在相邻细胞间形成连续性连接。膜纳米管最初在神经元细胞中被发现，但后续研究证实其存在于多种细胞类型及疾病中，如神经退行性疾病、病毒感染和癌症。一些研究也将相邻细胞间封闭末端、电耦合的膜纳米结构称为膜纳米管或膜纳米管样结构。
从膜连续性的角度阐明终点时的超微结构在技术上具有挑战性。此外，由于缺乏特异性标记物，使用传统方法对细胞间通讯进行研究，尤其是在鉴定隧道纳米管（TNTs）方面，也面临困难。TNTs 主要被定义为基于 F-肌动蛋白的、开放性膜突起结构。然而，一个主要局限在于，F-肌动蛋白存在于所有类型的细胞突起中，因此难以将 TNTs 与其他突起结构区分开来。基于 F-肌动蛋白的 TNTs 的一个显著特征是，这些结构悬浮于两个细胞之间，且不与基质接触。因此，可通过其是否悬浮于细胞之间，方便地区分出清晰的经 F-肌动蛋白染色的 TNTs 与其他突起结构，例如丝状伪足和神经突。
我们最近的研究表明，寡聚化淀粉样蛋白-β的内化1-42 (oAβ) 通过 肌动蛋白依赖性内吞作用可激活p21活化激酶1（PAK1），进而介导富含F-肌动蛋白且共表达磷酸化PAK1的隧道纳米管（TNTs）在SH-SY5Y神经元细胞间的形成。本方案概述了一种三维体积分析方法，用于识别和表征经寡聚化β-淀粉样蛋白（oAβ）处理的神经元细胞中，由F-肌动蛋白与磷酸化PAK1免疫染色标记的膜突起所捕获的z轴层扫图像中的TNTs。此外，通过F-肌动蛋白与β-III微管蛋白免疫染色的膜通道，可将TNTs与正在发育的神经突及神经元突起区分开来。

本研究通过共聚焦显微镜z轴层扫图像构建三维体积视图，鉴定并表征SH-SY5Y神经细胞中由oAβ诱导形成的膜纳米管（图1）。细胞经F-actin与磷酸化PAK1双免疫荧光染色后，对染色细胞的共聚焦z轴层扫图像进行分析以识别膜纳米管（图2）。进一步分析微分干涉相差（DIC）图像，验证F-actin和磷酸化PAK1染色的膜纳米管结构确为细胞间的膜性通道（图3）。此外，细胞还进行了F-actin与β-III微管蛋白的双免疫染色（图4）。通过该染色方法，可将同时表达F-actin与β-III微管蛋白的类膜纳米管结构与仅表达F-actin的膜纳米管区分开来（图4）。通过构建三维体积视图图像，依据其悬浮于两个细胞之间且不接触培养基底的特征，将共表达磷酸化PAK1（即活化PAK1）与F-actin的膜纳米管与其他神经突起或细胞突起区分开来（<strong c...

隧道纳米管（TNTs）主要是由F-肌动蛋白构成的、两端开放的膜性纳米管结构，可连接相邻细胞，介导细胞间通讯。TNTs区别于其他细胞突起的显著特征是这些纳米管悬浮于细胞之间。本文通过构建共聚焦z轴层扫图像的三维体积视图，对隧道纳米管进行表征。

近期研究发现，细胞可通过纳米级的肌动蛋白-膜样导管进行直接的长距离细胞间物质转运，即……

由于缺乏特异性的隧道纳米管标记物，该领域的研究进展受到限制，目前迫切需要一种能够识别、表征和定量隧道纳米管的方法。自动检测方法在缺乏开发算法或修改现有算法的专业知识的情况下难以实施，而我们的人工方法则更易于操作且具有更高的精确度。通过隧道纳米管实现的远距离细胞间物质转移，在多种疾病模型中均有体现，包括神经退行性疾病、病毒传播以及癌症。因此，研究隧道纳米管及其在发病机制中的作用具有重要意义。在染色过程中，隧道纳米管可能会断裂。应避免使用盖玻片和载玻片封片，而改用玻璃底成像培养皿。改良的固定方案有助于保持隧道纳米管的完整性。演示该实验操作的是来自Sangeeta NAF实验室的博士研究生Deepak KV。首先，在固定前用PBS将对照组和寡聚A-beta处理的细胞洗涤两次，每次两分钟。使用2%甲醛固定液和2.5%戊二醛溶于pH 7.2的0.1摩尔磷酸盐缓冲液中配制Karnovsky固定液。然后在成像培养皿中加入Karnovsky固定液，在室温下固定细胞45分钟。通过将0.1克皂苷溶解于5毫升胎牛血清（FBS）中，再加入95毫升磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，配制孵育缓冲液。然后用孵育缓冲液洗涤固定后的细胞，每次两分钟，共洗涤两次。固定后，在孵育缓冲液中按1:250的比例加入针对磷酸化PAK1的一抗，在4摄氏度的避光湿润孵育盒中孵育过夜。孵育24小时后的次日，用孵育缓冲液再次洗涤细胞两次，每次两分钟。然后加入与 Alexa Fluor 488 和 Phalloidin 555 偶联的二抗。将细胞在室温下于避光湿润环境中孵育 1.5 小时。孵育结束后，用孵育缓冲液洗涤细胞两次，每次两分钟。通过加入1:2000稀释的DAPI对细胞核进行染色，并在室温避光条件下孵育5至10分钟。使用25毫克DABCO溶于90%甘油和10% PBS中配制DABCO封片剂。为充分溶解，使用光谱纯级稀盐酸调节pH至8.6，并将溶液置于摇床上持续混匀。作为抗淬灭剂，将DABCO封片剂直接加到成像培养皿中，该培养皿底部含有盖玻片。静置至少一至两小时后，直接进行共聚焦成像。为鉴定隧道纳米管，使用共聚焦激光扫描显微镜对免疫染色细胞采集Z轴层扫图像：首先在共聚焦软件的“track one”、“track two”和“track three”窗口中选择相应的通道，并依次点击所需的激光器。在轨道一窗口下方点击 TPMT 选项，以荧光通道获取微分干涉差图像。选择软件中的采集选项卡，点击 Z 叠层选项卡，并等待窗口打开。然后点击实时扫描，以聚焦培养皿底部的细胞。选择该聚焦图像作为第一个图像层，然后向上调焦至细胞最顶端，将该位置选为最后一个图像层。停止实时扫描，点击“Optimal”标签旁的数值，以确定图像层的步进大小，该设置将根据细胞厚度决定切片数量和间隔。使用405纳米、488纳米和561纳米激光，依次采集DAPI、FITC和TRITC三个通道的图像，像素驻留时间为1.02微秒。使用荧光通道结合微分干涉差（DIC）通道拍摄图像，以观察细胞边界。在 Fiji 软件中打开以 czi 数据格式保存的共聚焦图像进行分析。选择“Hyperstack”选项以查看图像的每个 Z 层切片和通道。滚动通道和Z轴堆栈滚动条，以选择特定通道的精确堆栈。然后通过滚动通道条，首先选择F-肌动蛋白染色通道，并手动滚动Z轴堆栈，逐个查看每一层。在Z轴堆栈的较低部分，寻找可见的、接近成像培养皿表面（Z值等于2）且似乎连接细胞的F-肌动蛋白染色结构，将其识别为神经突。通过从 Z 等于 4 的位置向上滚动 Z 层切片，识别富含 F-肌动蛋白的悬浮细胞间通道，即隧道纳米管。在 Z 层切片靠近底部接近表面的区域寻找神经突起，并观察随着 Z 层切片向上滚动至 Z 等于 6 时，神经突起逐渐消失的现象。通过分析 Z 层切片中通道的悬浮特征，以类似识别 F-肌动蛋白阳性隧道纳米管的方法，识别磷酸化 PAK1 阳性的隧道纳米管。由于磷酸化PAK1染色弱于F-actin染色，应在Z=4和Z=6处寻找磷酸化PAK1染色的膜纳米管结构。此外，观察DIC图像以确认F-actin和磷酸化PAK1染色的膜纳米管结构是细胞间的膜性通道。同时，合并F-actin与磷酸化PAK1通道，以验证所识别的膜纳米管为F-actin与磷酸化PAK1共染色的结构。为了定量分析隧道纳米管，需手动计数总细胞数量以及已识别的隧道纳米管数量，并将结果以百分比形式表示。为了从Z轴层扫图像中区分出富含F-肌动蛋白和βIII微管蛋白阳性的、类似悬浮导管的隧道纳米管，应合并F-肌动蛋白与βIII微管蛋白的荧光通道，随后分析合并后图像的Z轴层扫数据。寻找仅由F-肌动蛋白染色的隧道纳米管，这类结构在Z=3时微弱可见，而在Z=6和Z=9时则明显清晰。类似地，鉴定 F-actin 和 beta III 微管蛋白双阳性、在 Z=6 和 Z=9 处呈悬浮状的隧道纳米管样结构。从 Z 层切片的下部区域鉴定其他被 F-actin 和 beta III 微管蛋白染色的非悬浮突起结构。使用 Fiji 中的线条工具测量隧道纳米管的直径。通过点击“分析”然后设置比例尺，以确保像素距离能从 czi 图像中自动设定，从而验证测量尺度的准确性。在 XY 平面上测量隧道纳米管的直径。使用 Fiji 中的 Volume Viewer 插件（该插件支持三维重新切片及基于阈值的三维可视化），将 Z 轴层叠图像拆分为各个独立的通道。随后裁剪单通道的 Z 轴层叠图像，利用三维重建视图一次突出显示一条或两条隧道纳米管或神经突。在 XY 平面上固定一条隧道纳米管或神经突，并标记 XZ 和 YZ 轴的横截面。在 XZ 和 YZ 平面上观察位于 XZ 平面底部的神经突，以及在上层 Z 层切片中的隧道纳米管。选择单个隧道纳米管或神经突，以重建 XZ 平面上的三维体积视图。在三维重建图像中，观察位于 Z 平面底部的神经突，以及呈悬空结构的隧道纳米管，这些隧道纳米管连接两个细胞但不接触底部的 Z 平面。通过分析F-actin和磷酸化PAK1免疫染色细胞的共聚焦Z轴层扫图像，鉴定隧道纳米管。此外，分析微分干涉相差（DIC）图像以确认F-actin和磷酸化PAK1染色的隧道纳米管结构为细胞间的膜性通道。对细胞进行F-actin与β III微管蛋白的双重免疫染色，从而区分仅F-actin阳性的隧道纳米管与F-actin及β III微管蛋白双阳性的类隧道纳米管样膜性通道。通过构建三维体积视图图像，可根据隧道状纳米管悬浮于两个细胞之间且不接触基质的特征，将其与其它神经突起的细胞突起区分开来。正确选择固定剂至关重要，因为样品固定不充分可能导致目标蛋白迅速发生蛋白水解降解，并降低特异性免疫反应性。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用3D体积视图图像检测和定量隧道纳米管

我们在欧洲同步辐射设施（ESRF）利用同步辐射X射线断层扫描技术，以0.7µm的像素分辨率无创地获取三维断层扫描数据集。通过体渲染软件，可在无需组织学切片的情况下，以自然状态重建内部结构，避免了由组织学切片所导致的人工假象。...

使用同步辐射X射线断层扫描实现亚微米分辨率的非侵入式三维可视化

我们介绍了制备垂直排列碳纳米管（CNT）图案化微结构的方法，并将其用作模具来制造具有有序纳米级表面形貌的聚合物微结构。通过将溶剂冷凝到基底上，使碳纳米管阵列致密化，显著提高了其堆积密度，并实现了三维结构的自导向成型。...

3D碳纳米管微结构的制备、致密化与复制模塑

本研究的主要目的是监测碳纳米管（CNTs）的细胞摄取及其最终的胞吐过程。基于这一视角，我们提出了一种独特的方法，利用多光谱成像流式细胞术，能够在数量具有统计学意义的细胞中对碳纳米管进行定量和定位分析。...

利用多光谱成像流式细胞术对细胞内碳纳米管的定位与相对定量分析

本方案采用三维（3D）成像与分析技术，用于可视化并定量神经特异性线粒体。该技术适用于其他利用一种荧光信号从另一种荧光信号中分离出特定数据子集的情况。...

三维成像与分析人表皮内神经纤维中的线粒体

介绍了一种从土壤中原位获取的X射线计算机断层扫描数据中获得根系结构可视化与定量信息的方法。...

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本文介绍了一种利用专为X射线计算机断层扫描设计的X射线特异性染色方法，对微观组织结构进行三维可视化的实验方案。...

利用X射线特异性染色法与纳米级计算机断层扫描对软组织样本进行三维成像

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用于组织工程应用的人类皮肤细胞中隧道纳米管的标准化检测方法

螯虾腿部的开肌因其在肌肉表型、突触生理学及可塑性研究中的历史重要性和实验多样性而被广泛采用。...

小龙虾开肌神经肌肉接头的历史视角与生理学演示

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使用微量生物分光光度计测定核酸和蛋白质的浓度

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利用高分辨率熔解分析结合PCR进行斑马鱼快速高效基因分型

学习使用三维体积视图图像检测和定量隧道纳米管的方法，通过共聚焦Z-stack成像技术识别F-肌动蛋白阳性结构。该技术有助于研究神经退行性疾病和癌症中的细胞间通讯机制。

利用三维体积视图图像检测与定量隧道纳米管

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