一个官能二肽的固相合成使用“安全锁扣”方法论
2012年5月15日
高效固相多肽合成的官能双肽三聚体，利用“安全赶上”HMBA树脂裂解过程的描述。
以下实验的总体目标是使用固相技术合成功能化的 BSP 肽。这是通过将受保护的 BIS 氨基酸加载到羟乙基苯甲酸树脂上来实现的。然后重复深度保护偶联循环以连接功能化的 bis 氨基酸，这一过程可延长 BIS 肽并显示所需的功能。
最后，第一个 bis 氨基酸被 α 氨基酸修饰，以便通过形成 DI Keto 吡嗪从树脂上裂解 BIS 肽。根据液相色谱质谱分析，获得的结果表明，成功合成了具有良好粗纯度的功能化 BSP 肽，分离得率一致，约为 10%。该技术的意义延伸到 bis 肽的平行和文库合成，因为 BIS 肽组装在固体树脂上，这比溶液中的反应更容易作，并且副产物很容易通过过滤去除。
这种方法的视觉演示至关重要，因为许多步骤都很难学习，因为有许多重要的细节是必要的，以确保所有反应都尽可能接近完成。对于固相合成，没有办法纯化中间体。因此，为了获得清洁的最终产品，必须尽可能地推动每个反应。
我们建议创建一个实验程序清单以避免混淆，因为这些步骤本质上是重复的。该方案从第一个 BSP 肽的加载、第一个 BSP 肽的保护开始，并同时进行填料加帽。首先，将 114 毫克 H-M-B-A-A 填料称量到 8 mL 反应容器中，并加入磁力搅拌棒，从而加载第一个 BSP 肽。
用橡胶隔膜盖住容器顶部，并用 Argonne 吹扫试管至少 5 分钟。同时，按照书面方案中的说明制备活化的 BIS 氨基酸溶液。在本视频中，通过注射器将溶液转移到反应容器中，第二天在 Argonne 下搅拌过夜，去除隔膜并排空反应混合物。
向树脂中加入大约 2 毫升的氯甲烷来清洗树脂。搅拌 30 秒到一分钟，然后沥干。用 DCM 重复此过程 4 次，然后用二甲基甲酰胺洗涤树脂 5 次。
为了对第一个双氨基酸进行深度保护，同时进行填料加帽，请向反应容器中缓慢添加 2 毫升 33% 溴化氢乙酸溶液和 DCM。沥干树脂并在 DCM 中清洗 5 次后，搅拌 15 分钟。再次重复 D 保护序列。
接下来，在 DCM 中洗涤树脂 5 次，然后在 DMF 中洗涤 5 次，用 5% 体积的 D-I-P-E-A 在 DMF 中的溶液洗涤两次来中和树脂。然后用 DCM 洗涤 5 次，再用 DMF 洗涤 5 次。现在可以进行受保护的官能化双氨基酸的偶联。
首先，通过用无水 DCM 洗涤 3 次，将惰性气氛重新引入含有树脂的反应容器中。然后连接隔垫和氩气管路，加入 1 至 2 毫升无水 DCM 并搅拌 30 秒，清洗容器。然后排空容器，直到 argonne 管线起泡器开始上升。
至少再重复一次此过程。接下来，在 Argonne 气氛下，在火焰干燥的试管中制备官能化双氨基酸的溶液。加入 47 微升 DIC 并搅拌 90 分钟。
然后在树脂中加入 35 μL 的 D-I-P-E-A 和 666 μL 水合 DMF，再搅拌 5 分钟。通过注射器将预活化的 BIS 氨基酸溶液转移到容器中，并在第二天搅拌过夜。排干反应混合物，并在氩气下用无水 DCM 洗涤两次。
该程序中的一个关键步骤是 biz 氨基酸偶联。为了确保 di 酮哌嗪环闭合，我们使用额外的活化剂采用更长的反应时间。为了促进 di 酮吡嗪的闭合，加入 HOAT 和 DIC 溶液，在氩气下搅拌 1 小时。
接下来，去除隔膜并排空反应混合物。用 DCM 洗涤树脂 5 次，用 DMF 洗涤 5 次。本节介绍功能化 BIS 氨基酸的深度保护、F moc 的深度保护和第一个 BIS 氨基酸的酰化。
为了对受保护的官能化双氨基酸进行深度保护，向反应容器中缓慢加入 2 毫升 TFA 和 TIPS 溶液，排干后搅拌 1 小时，用 DCM 洗涤树脂约 30 秒，然后沥干，重复 DCM 洗涤 5 次。然后在 A-D-C-M-D-M-F 洗涤后重复整个 Deep Protection 填料洗涤程序。用 5% 体积体积的 D-I-P-E-A 在 DMF 溶液中洗涤两次，中和树脂。
然后进行另一次 D-C-M-D-M-F 洗涤。从这里开始，BIS 肽可以与其他官能化的 BIS 氨基酸一起延伸，或在领先的氮羧酸上官能化，或两者兼而有之。为了去保护 FM 组，加入 2 mL 的 20% 哌类帕立定溶液，溶于 DMF 中，混合反应物 20 分钟。
排干并在 DMF 中洗涤树脂 5 次。在再次洗涤树脂后再次重复此过程。A 通过将制备好的氨基酸溶液添加到反应容器中来分离第一个双氨基酸，最后一步搅拌 6 小时。
用 DCM 洗涤树脂 5 次，用 DMF 洗涤 5 次。该方案的最后一部分包括从树脂结合的氨基酸中去除 Bach 基团并从树脂中切割。首先，向反应容器中加入 2 毫升一对一 T-F-A-D-C-M 溶液，搅拌 30 分钟。
在 DCM 中沥干并清洗树脂 5 次。然后再次重复此过程。清洗并排干树脂 30 秒，用 DCM 清洗 5 次，用 DMF 清洗 5 次。
接下来，加入 2 毫升 10% D-I-P-E-A 的无水 DMF 溶液，搅拌 24 至 48 小时。最后，将反应混合物收集到预先称重的圆底烧瓶中。将 30 μL 此溶液转移到 LC MS 文件中的 450 μL Tetra Hydro FU 中，并提交分析。
用额外的 DMF 等分试样洗涤树脂，并收集到圆底培养瓶中。以下方法可用于监测整个合成过程中的树脂化学转化。要检测游离羟基，请先通过一次性移液器去除大约 1 毫克的干树脂，进行甲基红测试。
冲洗到 4 mL 反应容器中。加入文中制备的甲基红溶液，搅拌 5 至 10 分钟。用 DCM 将树脂沥干并洗涤 5 次橙色或红色树脂珠表明存在游离羟基。
该测试可用于评估第一个双氨基酸和填料加帽步骤的负载。为了检测辅助方法，通过一次性移液器将大约 1 毫克的干树脂转移到一个小样品瓶中进行氯醛测试。在 DMF 溶液中加入 3 滴 0.8 毫摩尔氯醛，在 DMF 溶液中加入 2% 酸醛。
让我们在室温下静置 5 到 10 分钟。在这种情况下，蓝色或紫色树脂珠表明树脂结合化合物上存在游离的二级手段。为了确认活化效率，执行活化捕集试验，可以通过将 5 至 10 μL 活化溶液转移到含有 50 μL 青碱的液相色谱质谱瓶中来评估合成过程中的活化化合物。
几秒钟后，溶液应变为黄色，然后用 450 μL tetra hydro uran 稀释并提交进行 lc MS 分析。最终产品和活化中间体可以使用配备 C 18 反相色谱柱和含 0.1% 甲酸的水乙酰腈溶剂系统的 LCM S 系统进行评估。这条 L-C-M-S-U-V 轨迹提供了粗品良好纯度的一个例子。
在 21.3 分钟处发现的谱图中的主峰具有与预期产物质量一致的掩模。这可以在粗品的质谱图中可视化，峰显示与质量相对应的主峰，加上钠离子的质量，以及质量减去 IV DDE 保护基团的质量。这里显示的是纯化光谱的 LCMS UV 迹线，在 21.3 分钟处显示出非常纯净的产物，质谱证实了该纯化特里尔峰的身份。
看完这个视频，你应该对开发后如何使用Solid Face技术合成功能化双肽有了很好的了解。这项技术为商业肽领域的研究人员铺平了道路，一旦掌握，就可以探索蛋白质-蛋白质相互作用和催化中的应用。如果作得当，该技术可以在 4 到 5 天内合成功能化的 biz 肽三聚体。
尝试此程序时，请务必记住将磁珠浸入反应溶液中，并按照此程序洗涤。可以执行其他方法，如平行或文库合成，以回答其他问题，例如立体化学或替代功能对蛋白质结合或催化活性的影响。不要忘记，使用有机试剂可能非常危险，在执行此程序时应始终采取预防措施，例如使用适当的个人安全设备和通风橱。
概览
本文描述了使用HMBA树脂的安全陷阱切割方法进行功能化双肽三聚体的固相肽合成。该过程涉及多个偶联循环以实现所需的肽功能。
关键研究组成部分
科学领域
- 肽合成
- 固相技术
- 生物化学
背景
- 固相肽合成允许更容易地操纵反应。
- 副产品可以通过过滤有效地去除。
- 理解每个反应步骤的细节对成功至关重要。
- 检查表可以帮助管理程序的重复性。
研究目的
- 使用固相技术合成功能化的BSP肽。
- 展示安全陷阱切割程序的效率。
- 探索双肽并行和库合成的影响。
使用的方法
- 将保护的BIS氨基酸加载到羟乙基苯甲酸树脂上。
- 进行深保护偶联循环以延长肽链。
- 使用DI酮吡嗪形成从树脂上切割。
- 采用液相色谱质谱法进行产率分析。
主要结果
- 成功合成了具有良好粗纯度的功能化BSP肽。
- 实现了约10%的一致分离产率。
- 该方法允许对固体树脂进行有效操作。
- 视觉演示增强了对复杂步骤的理解。
结论
- 固相合成方法对双肽生产有效。
- 每一步的细节关注对高质量结果至关重要。
- 该技术在肽合成中具有更广泛应用的潜力。
常见问题
Executive Industry Relevance
Solid-phase synthesis of functionalized bis-peptides enables efficient assembly of complex peptide architectures for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The safety catch cleavage method provides controlled release, supporting reproducible synthesis of bis-peptide libraries for screening applications. This approach reduces synthetic burden and improves throughput for lead identification campaigns targeting protein-protein interactions or catalytic functions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of bis-peptide scaffolds to validate therapeutic hypotheses through predictable spatial positioning of functional groups.
- Operational Value: Supports de-risking of target engagement studies by providing access to structurally defined bis-peptide variants.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified bis-peptide libraries suitable for quantitative binding or activity assays in drug discovery.
- Operational Value: Facilitates parallel synthesis on solid resin, improving scalability and reducing purification burden compared to solution-phase methods.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables exploration of structure-activity relationships in bis-peptides for modulating protein-protein interactions or enzymatic function.
- Operational Value: Supports preclinical continuity by delivering consistent material for efficacy and mechanistic studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows for lead identification, where bis-peptide synthesis enables hypothesis testing and pathway clarification prior to optimization.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by providing defined bis-peptide tools to probe target function and interaction networks.
- Screening: Delivers assay-ready bis-peptide libraries with consistent purity for high-throughput or format-flexible screening campaigns.
- Analytics: LC-MS monitoring enables quantitative assessment of coupling efficiency and cleavage success, informing go/no-go decisions in library synthesis.
- Translational Research: Connects discovery-stage bis-peptide generation to preclinical evaluation through reliable, scalable production.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for bis-peptide library generation across multiple targets or modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through access to conformationally constrained bis-peptide scaffolds.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via solid-phase handling and filtration-based byproduct removal.
- Strategic Value: Improved capital efficiency in lead identification by enabling parallel synthesis and reducing failure rates from impure intermediates.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of bis-peptide candidates based on quantifiable purity and yield data from LC-MS analysis.
Implementation Considerations
- Expertise in peptide synthesis, protecting group strategies, and resin handling is required.
- Instrumentation includes inert atmosphere capability, syringes, and LC-MS systems for monitoring.
- Standardization across teams depends on consistent execution of protection, coupling, and cleavage steps.
- Adaptation to other bis-amino acid systems may require optimization of coupling agents and cleavage conditions.
- Practical limitations include the need for anhydrous conditions and careful monitoring to drive reactions to completion due to lack of intermediate purification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:55
Loading of First Bis-Peptide, Deprotection of First Bis-Peptide, and Simultaneous Resin Capping
3:43
Coupling Tert-butyl Carbamate (Boc)/tert-butyl Ester(tBu)-protected Functionalized Bis-Amino Acid
5:21
Deprotection of Boc/tBu-protected Functionalized Bis-Amino Acid, Deprotection of Fmoc, and Acylation of the First Bis-Amino Acid
6:55
Removal of the Boc Group from the Resin Bound Amino Acid and Cleavage from the Resin
7:56
Assessment Methods
9:51
Results: Analysis by Liquid Chromatography and Mass Spectroscopy
10:36
Conclusion
