Name: 一个官能二肽的固相合成使用“安全锁扣”方法论 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学习使用固相合成技术制备官能化BSP肽的方法，通过HMBA树脂负载保护氨基酸并进行多次偶联循环。该方法可实现约10%的分离产率，适用于平行合成和肽库构建。

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作者谨此感谢 Zachary Z. Brown 博士和 Jennifer Alleva 在该固相合成技术初期开发中的贡献，以及 Matthew F.L. Parker 提供的有益讨论。本工作由美国国防威胁降低局（DOD-DTRA）（项目编号 HDTRA1-09-1-0009）和由 Cephalon, Inc. 资助的 Horst Witzel 奖学金项目支持。

1. 实验准备
<ol>
 <li>固相合成反应的装置是一个聚丙烯过滤筒或玻璃反应器，通过聚丙烯管路连接至真空条件下的封闭式抽滤瓶，如图1所示。反应可通过磁力搅拌子搅拌，或通过向反应器中通入氮气鼓泡实现混合。</li>
 <li>建议使用连接至氩气钢瓶的气体分配系统，并配备干燥管和油封鼓泡器，以便在惰性气氛下进行反应，并可方便地从密闭容器中移除试剂。</li>
 <li>所有操作均应在通风橱中进行，并需佩戴适当的个人防护装备（安全眼镜、实验服和腈类手套）。</li>
</ol>
2. 将第一个双肽加载到树脂上
<ol>
 <li>将 114 mg HMBA-AM 树脂（载量 0.88 mmol/g，100 μmol）称取至 8 mL 反应瓶中，并加入磁力搅拌子。用橡胶塞密封反应瓶口，通入氩气至少 5 分钟以充分吹扫管路。</li>
 <li>同时，将 117.3 mg 化合物 1（见图 3，586.63 g/mol，2 当量）和 59.2 mg 1-(均三甲苯-2-磺酰基)-3-硝基-1,2,4-三唑（MSNT，296.0 g/mol，2 当量）称取至一个 15 mL 一次性离心管中，加入 2 mL 无水二氯甲烷（DCM）溶解。向溶液中加入 24 μL 1-甲基咪唑（NMI，80.81 mL/mol，3 当量），混合至完全溶解。</li>
 <li>用注射器将活化后的溶液转移至反应瓶中，在氩气氛围下搅拌过夜（约 10 小时）。</li>
 <li>取下橡胶塞，排空反应混合物。用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂 5 次，再用二甲基甲酰胺（DMF）洗涤 5 次。按照第 10.1 节所述进行“甲基红测试”，以评估树脂的载量程度。若甲基红测试中树脂仍呈红色，则应重复步骤 2.2 和 2.3。理想的测试结果为黄色，表明甲基红测试阴性；但由于下一步中所有残留的羟基将被封闭，因此轻微阳性结果（树脂呈浅橙色）也可接受。</li>
</ol>

3. 第一个双肽的脱保护及同时进行的树脂封端
<ol>
 <li>向反应容器中加入 1 mL DCM，然后在 30 秒内逐滴加入 1 mL 33% 溴化氢的乙酸溶液（出现冒泡现象），搅拌 15 分钟。排液后用 DCM 洗涤树脂（5 次），再重复此过程一次。</li>
 <li>用 DCM 洗涤树脂（5 次），然后用 DMF 洗涤（5 次）。用 5% v/v N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）的 DMF 溶液洗涤树脂两次以中和，再用 DCM（5 次）和 DMF（5 次）洗涤。进行第 10.1 和 10.2 节中所述的“甲基红试验”和“氯醌试验”。甲基红试验结果应为阴性，氯醌试验结果应为阳性。</li>
</ol>
4. 偶联Boc/tBu保护的功能化双氨基酸
<ol>
 <li>通过用无水二氯甲烷（DCM）冲洗三次，向含有树脂的反应容器中重新引入惰性气氛，然后安装橡胶隔膜和氩气管线。加入1-2 mL无水DCM，搅拌30秒，随后排空容器直至氩气管线的鼓泡器开始上升，以此对容器进行吹扫和清洗。此步骤至少重复一次。</li>
 <li>在氩气氛围下，于火焰干燥的试管中配制0.15 M功能化双氨基酸（3当量）与245 mg 1-羟基-7-氮杂苯并三唑（HOAt，136.11 g/mol，18当量）溶于2 mL 2:1 DCM:DMF的溶液。加入47 μL二异丙基碳二亚胺（DIC，156.6 mL/mol，3当量），搅拌90分钟。</li>
 <li>将35 μL N,N-二异丙基乙胺（DIPEA，174.19 mL/mol，2当量）溶于666 μL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）后加入树脂中，搅拌5分钟。</li>
 <li>用注射器将预活化的双氨基酸溶液转移至反应容器中，持续搅拌过夜。</li>
 <li>排空反应混合物，并在氩气氛围下用无水DCM洗涤两次。</li>
 <li>为促进二酮哌嗪环的闭环反应，加入4 mL含0.25 M HOAt（136.11 g/mol，10当量）和DIC（156.6 mL/mol，10当量）的1:1 DCM:DMF溶液，在氩气氛围下搅拌1小时。</li>
 <li>移除橡胶隔膜，排空反应混合物。依次用DCM（5次）和DMF（5次）洗涤树脂。如需要，可进行第10.2节所述的“氯醌试验”。</li>
</ol>
5. 脱除 Boc/tBu 保护的官能化双氨基酸的保护基
<ol>
 <li>向反应容器中加入 2 mL 95:5 的三氟乙酸（TFA）: 三异丙基硅烷（TIPS）溶液，搅拌反应 1 小时。用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂约 30 秒（5 次），然后重复此过程一次。</li>
 <li>用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂（5 次），再用 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤（5 次）。用 5% v/v 的 N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）DMF 溶液洗涤两次以中和树脂，随后再次用二氯甲烷（DCM）洗涤（5 次）和 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤（5 次）。如需要，可进行第 10.2 节中所述的“氯萘试验”。</li>
</ol>
6. 根据需要重复步骤 4 和 5，以合成目标双肽。
7. 双肽脯氨酸末端的功能化
<ol>
 <li>生长中的双肽的脯氨酸末端可通过二酮哌嗪独立或同时进行酰化。此外，该末端也可保留保护基团，后续再行裂解，从而得到游离氨基酸。如需评估偶联效率，可进行第10.2节中所述的“氯醌试验”。</li>
</ol>
8. 双肽季铵末端的Fmoc脱保护与酰化
<ol>
 <li>加入2 mL含20%哌啶的DMF溶液，混合反应20分钟。抽干后用DMF洗涤树脂（5次），再重复此过程一次。</li>
 <li>用DCM洗涤树脂（5次），然后用DMF洗涤（5次）。</li>
 <li>在2 mL N-甲基吡咯烷酮（NMP）中配制0.15 M氨基酸（3当量）溶液，加入114 mg 2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU，380.2 g/mol，3当量）和104.5 μL N,N-二异丙基乙胺（DIPEA，174.19 mL/mol，6当量），充分混合。将该溶液加入反应容器中，搅拌反应6小时。</li>
 <li>用DCM洗涤树脂（5次），然后用DMF洗涤（5次）。</li>
</ol>
9. 从树脂结合的氨基酸上脱除Boc基团并从树脂上裂解
<ol>
 <li>向反应容器中加入 2 mL 1:1 的 TFA:DCM 溶液，搅拌 30 分钟。滤出溶液，并用 DCM 洗涤树脂（5 次），然后重复此过程一次。</li>
 <li>用 DCM 洗涤树脂并排干 30 秒（5 次），再用 DMF 洗涤并排干（5 次）。</li>
 <li>加入 2 mL 含 10% DIPEA 的无水 DMF 溶液，搅拌 24–48 小时。</li>
 <li>将反应混合物收集至预先称重的圆底烧瓶中。取 30 μL 该溶液转移至含有 450 μL THF 的 LC-MS 小瓶中，送样进行分析。用额外的 DMF 份量洗涤树脂，并将洗涤液收集至圆底烧瓶中，然后在减压下除去溶剂。</li>
</ol>

10. 双肽的纯化
<ol>
 <li>将粗品双肽溶于最小量的二甲基亚砜（100–250 μL）中，转移至HPLC小瓶内插管。将内插管放入配备XTerra Prep MS C18 5 μm 7.8×150 mm色谱柱和100 μL进样环的半制备型HPLC系统（Hewlett Packard 1100系列）自动进样器中。</li>
 <li>使用水-乙腈（含0.1%甲酸）梯度程序（5–95%乙腈，30分钟内）对样品进行多次50 μL进样，并在274 nm处监测。将产物峰收集至预先称重的一次性离心管中，使用冷冻干燥机冻干。首次运行时应谨慎操作，因为与分析型LCMS相比，通常会观察到峰保留时间的轻微偏移。</li>
</ol>

11. 评估方法
<ol>
 <li>甲基红试验7：用一次性移液管取约1 mg干燥树脂，冲洗至4 mL反应瓶中。加入含有20 mg甲基红、50 μL N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）和5 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP）的无水二氯甲烷（DCM）溶液500 μL，搅拌5–10分钟。排干溶液，并用DCM洗涤树脂，直至滤液无色。阳性结果为树脂珠粒保持橙色或红色。</li>
 <li>氯醌试验12：用一次性移液管将约1 mg干燥树脂转移至小样品瓶中。加入0.8 mM氯醌的DMF溶液和2%乙醛的DMF溶液各3滴，室温下静置5–10分钟。阳性结果为树脂珠粒变为蓝色或紫色。</li>
 <li>活化陷阱试验：合成过程中产生的活化化合物可通过将少量活化溶液（5–10 μL）转移至含有50 μL吡咯烷的液相色谱-质谱（LC-MS）样品瓶中进行评估。手动混匀数秒（溶液应变为黄色），然后用450 μL四氢呋喃（THF）稀释，并送样进行LC-MS分析。</li>
 <li>分析型LC-MS：采用配备Waters Xterra MS C18 3.5 μm 4.6 mm × 150 mm色谱柱的HP 1200系列LC-MS系统，通过在30分钟内使用含0.1%甲酸的水-乙腈梯度（5%–95%乙腈）对最终产物和活化中间体进行分析。</li>
</ol>
12. 代表性结果
提供了粗产物（图4）和纯化产物（图5）的液相色谱-质谱（LCMS）图谱示例。采用上述方法进行纯化，预期收率约为10%。
<img alt="真空过滤装置示意图；反应容器、磁力搅拌器、收集瓶、阀门。" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 固相合成实验装置示意图。
<img alt="含有季铵和脯氨酸末端的化学结构、分子图、肽键研究。" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 双氨基酸/双肽的相关命名法。
<img alt="多肽合成示意图，显示化学反应序列，展示合成步骤及所用试剂。" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 总体合成路线。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="274 nm 处的色谱 LC-MS 紫外吸收图谱，粗产物三聚体分析，保留时间图，mAU 标度。" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4a"> 
图 4a. 粗产物在 274 nm 处的高效液相色谱图。
<img alt="质谱图、粗产物分析、m/z 峰、分子结构、丰度数据" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4b"> 
图 4b. 粗产物峰的质谱图。
<img alt="纯化三聚体的液相质谱紫外吸收迹线（274 nm）；色谱图、保留时间、峰分析" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5a"> 
图 5a. 纯化产物在 274 nm 处的高效液相色谱迹线。
<img alt="用于肽分析的质谱图，显示质荷比峰、丰度和分子量。" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5b"> 
图 5b. 纯化产物峰的质谱图。

<ol><li>Atherton, E., Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtherton%2C+E+%22Solid+Phase+Peptide+Synthesis%3A+A+Practical+Approach%22">Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (1989).</li>
<li>Brown, Z. Z., Alleva, J., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-Phase+Synthesis+of+Functionalized+Bis-Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Solid-Phase Synthesis of Functionalized Bis-Peptides.</a> Biopolymers. 96, 578-585 (2010).</li>
<li>Schafmeister, C. E., Brown, Z. Z., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape-Programmable+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Shape-Programmable Macromolecules.</a> Acc. Chem. Res. 41, 1387-1398 (2008).</li>
<li>Brown, Z. Z., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Hexa-+and+Pentasubstituted+Diketopiperazines+from+Sterically+Hindered+Amino+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Let%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Hexa- and Pentasubstituted Diketopiperazines from Sterically Hindered Amino Acids.</a> Org. Let. 12, 1436-1439 (2010).</li>
<li>Nielson, J., Lyngso, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+Solid-Phase+Synthesis+of+Balanol+Analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Tet.+Lett%22%5BJournal%5D)">Combinatorial Solid-Phase Synthesis of Balanol Analogues.</a> Tet. Lett. 37, 8439-8442 (1996).</li>
<li>Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Method+for+Anchoring+Fmoc-Amino+Acids+to+Hydroxyl-Functionalized+Solid+Supports%5BTitle%5D)+AND+%22Tet.+Lett%22%5BJournal%5D)">An Efficient Method for Anchoring Fmoc-Amino Acids to Hydroxyl-Functionalized Solid Supports.</a> Tet. Lett. 31, 1701-1704 (1990).</li>
<li>Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Colorimetric+Test+for+Detection+of+Hydroxyl+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tet.+Lett%22%5BJournal%5D)">A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis.</a> Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).</li>
<li>Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+Functional+Groups+into+Peptides+via+N-Alkylation%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation.</a> Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).</li>
<li>Plas, S. E. V. ander, Van Hoeck, E., Lynen, F., Sandra, P., Madder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+New+SPE+Material+for+EDCs%3A+Fully+Automated+Synthesis+of+a+Library+of+Tripodal+Receptors+Followed+by+Fast+Screening+by+Affinity+LC%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward a New SPE Material for EDCs: Fully Automated Synthesis of a Library of Tripodal Receptors Followed by Fast Screening by Affinity LC.</a> Eur. J. Org. Chem. 11, 1796-1805 (2009).</li>
<li>Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+Test+for+Detection+of+Free+Terminal+Amino+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis+of+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides.</a> Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).</li>
<li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChan%2C+WC+%22Fmoc+Solid+Phase+Peptide+Synthesis%3A+A+Practical+Approach%22">Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (2000).</li>
<li>Vojkovsky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Secondary+Amines+on+Solid-Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Peptide+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of Secondary Amines on Solid-Phase.</a> Peptide Research. 71, 236-237 (1995).</li>
</ol>

本文的制作和免费访问由美国国防威胁降低局赞助。

本文介绍的合成方法提供了一种利用常见的固相多肽合成技术，从双氨基酸构筑单元合成功能化双肽的途径。这些“Pro4”构筑单元从反式-4-羟基脯氨酸3出发的单体合成具有高度可放大性，已成功在600 mmol（234 g）规模上完成至乙内酰脲阶段（未发表）。一旦获得单体，采用固相技术相较于当前的溶液相方法4可更快速地合成双肽，因其无需进行反应后处理和中间体纯化。
固相合成中的主要挑战在于反应进程的诊断与问题排查，因为中间产物无法被分离出来。这促使了多种比色检测方法的发展，包括用于鉴定树脂上是否暴露有游离胺基（Kaiser试验10）或游离羟基（甲基红试验7）的方法。然而，由于在我们的固相合成中几乎 exclusively 使用仲胺或连接于季碳上的胺基，常用的 Kaiser 试验10通常不适用。在 HMBA 树脂上进行评估的其他方法包括使用肼等亲核试剂进行小规模裂解试验11、通过紫外-可见光谱法监测 Fmoc 基团的定量脱除1,11，以及捕获并分析进入的活化化合物。
固相合成中的另一个常被忽视的问题是操作人员需要重复执行的合成步骤。鉴于此，作者强烈建议在进行任何手动固相多肽合成时，使用电子表格或检查清单。
与常见的α-氨基酸相比，使用双肽（bis-peptides）进行固相合成的难点包括：由于空间位阻可能导致更难的偶联反应、需要在树脂上进行二酮哌嗪环化以及同时脱保护（Boc/tBu；Cbz/tBu）。另一个难点在于，与更常规的方法相比，采用这种“安全捕获”（safety catch）方法时难以实现从树脂上的定量释放。考虑到这些因素，进一步优化该方法是完全可能的，目前我们课题组正在进行相关工作，以改进本文所介绍的方法。

<table><tbody><tr><td>HMBA-Am 树脂</td><td>Novabiochem, EMD Millipore</td><td>855018</td><td></td></tr><tr><td>MSNT</td><td>Novabiochem, EMD Millipore</td><td>851011</td><td></td></tr><tr><td>NMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>336092</td><td>有毒，腐蚀性</td></tr><tr><td>DCM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&quot; target=&quot;_blank">D65100&lt;/a&gt;</td><td>致癌性</td></tr><tr><td>无水 DCM</td><td>Acros Organics</td><td>34846</td><td>致癌性</td></tr><tr><td>33% 溴化氢乙酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>248630</td><td>有毒，腐蚀性，开启时产生烟雾</td></tr><tr><td>DIPEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387649</td><td>易燃，有毒，腐蚀性</td></tr><tr><td>DMF</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC27960</td><td>易燃，有毒</td></tr><tr><td>无水 DMF</td><td>Acros Organics</td><td>34843</td><td>易燃，有毒</td></tr><tr><td>HOAt</td><td>GenScript</td><td>C01568</td><td></td></tr><tr><td>DIC</td><td>Acros Organics</td><td>BP590</td><td>易燃，有毒，腐蚀性</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>有毒，腐蚀性</td></tr><tr><td>TIPS</td><td>Acros Organics</td><td>21492</td><td>易燃，有毒</td></tr><tr><td>哌啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>104094</td><td>易燃，有毒，腐蚀性</td></tr><tr><td>HATU</td><td>GenScript</td><td>C01566</td><td>有毒</td></tr><tr><td>NMP</td><td>Acros Organics</td><td>36438</td><td>有毒</td></tr><tr><td>DMAP</td><td>Novabiochem, EMD Millipore</td><td>851055</td><td>有毒</td></tr><tr><td>甲基红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>250198</td><td></td></tr><tr><td>THF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td>易燃，有毒，可形成过氧化物</td></tr><tr><td>吡咯烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P73803</td><td>易燃，有毒，腐蚀性</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Fisher Scientific</td><td>D1281</td><td></td></tr><tr><td>SPPS 反应容器</td><td>Grace</td><td>211108</td><td></td></tr><tr><td>LCMS</td><td>Agilent Technologies</td><td>1200 系列</td><td></td></tr><tr><td>半制备型液相色谱</td><td>Hewlett-Packard</td><td>1100 系列</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Labconco Corp.</td><td>7934027</td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>Buchi</td><td>R-210 系列</td><td></td></tr><tr><td>氩气</td><td>Airgas</td><td>AR PP300CT</td><td></td></tr></tbody></table>

采用“安全捕获”法固相合成功能化双肽

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

1962年，R.B. Merrifield 发表了首个采用固相多肽合成法高效合成多肽的新途径。该技术在时间和劳动成本方面迅速显示出优于其液相前体方法的优势。在过去五十年中，关于固相载体性质、所用保护基团以及偶联方法的不断改进，进一步提升了Merrifield原始体系的实用性。如今，最常用的多肽合成方法主要包括由R.C. Sheppard开创的Boc保护基与碱/亲核试剂可裂解树脂策略，或Fmoc保护基与酸可裂解树脂策略1。
受 Merrifield 固相合成策略的启发，我们开发了一种用于组装功能化双肽的 Boc/叔丁基固相合成策略2，本文对此进行了描述。与溶液相方法相比，固相合成不仅如 Merrifield1所述在时间和劳动方面具有优势，而且更便于双肽库的合成。我们在此展示的合成方法包含一个最终裂解步骤，采用两步“安全捕获”机制，通过二酮哌嗪的形成将功能化双肽从树脂上释放出来。
双肽是一类刚性的螺环梯状双氨基酸低聚物，其功能基团的排列方式具有可预测性和可设计性，由单体单元的类型、立体化学性质以及各单体之间的连接方式所控制。每个双氨基酸均为立体化学纯的环状骨架结构，包含两个氨基酸（即带有α-氨基的羧酸）3,4。本实验室目前正在研究功能化双肽在催化、蛋白质-蛋白质相互作用以及纳米材料等多个领域的潜在应用。

本文描述了一种利用HMBA树脂上“安全捕获”裂解方法高效固相合成功能化双肽三聚体的方案。

1962年，R.B. Merrifield 发表了首个采用固相多肽合成法高效制备多肽的实验方案。这一……

以下实验的总体目标是利用固相技术合成一种功能化的BSP肽。该目标通过将带有保护基的BIS氨基酸加载到羟乙基苯甲酸树脂上实现。随后重复进行深度保护的偶联循环，以连接功能化BIS氨基酸，该过程可延长BIS肽链并呈现所需的功能特性。最后，通过α-氨基酸对第一个双氨基酸进行修饰，以通过双酮哌嗪的形成将BIS肽从树脂上裂解下来。实验结果表明，功能化的BSP肽已成功合成，粗品纯度良好，分离产率稳定，约为10%（基于液相色谱-质谱分析）。该技术的应用前景包括双肽的平行合成与文库构建，因为BIS肽是在固相树脂上组装的，相比溶液中的反应更易于操作，且副产物可通过过滤轻松去除。该方法的可视化演示至关重要，因为许多步骤难以掌握，需要大量关键细节来确保所有反应尽可能接近完全。在固相合成中，无法对中间产物进行纯化，因此为了获得纯净的最终产物，每一步反应都必须尽可能进行彻底。我们建议创建一份实验操作清单，以避免因步骤重复而产生混淆。本方案首先加载第一个 BSP 肽，随后保护第一个 BSP 肽并同时对树脂进行封端。开始时，称取 114 毫克 H-M-B-A-A 树脂放入一个 8 毫升反应容器中，并加入一个磁力搅拌子，以加载第一个 BSP 肽。用橡胶隔垫封住容器顶部，并用氩气吹扫管内至少五分钟。在此期间，按照书面实验方案中的描述制备活化的 BIS 氨基酸溶液。随本视频操作，用注射器将溶液转移至反应容器中，并在氩气氛围下搅拌过夜。次日，取下隔垫并排出反应混合物。向树脂中加入约两毫升氯甲烷，洗涤树脂。搅拌30秒至1分钟，然后排干。用二氯甲烷重复此过程四次，再用二甲基甲酰胺洗涤树脂五次。为了对第一个双氨基氨基酸进行深度保护并同时缓慢封闭树脂，向反应容器中缓慢加入2 mL含33%溴化氢的乙酸和二氯甲烷溶液。排干后用二氯甲烷洗涤树脂五次，随后继续搅拌15分钟。再重复一次D保护步骤。接下来，用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂5次，随后用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤5次；再用体积分数为5%的N,N-二异丙基乙胺（D-I-P-E-A）的DMF溶液洗涤树脂2次以中和树脂。然后再次用DCM洗涤5次，再用DMF洗涤5次。此时可进行保护的功能化双氨基酸的偶联反应。首先，通过用无水二氯甲烷（DCM）洗涤三次，向含有树脂的反应容器中重新引入惰性气氛。然后安装橡胶隔膜，连接氩气管线，加入一至二毫升无水 DCM 进行冲洗并搅拌 30 秒。随后排空容器，直至氩气管线的鼓泡器开始上升。至少重复此过程一次。接下来，在氩气氛围下，于火焰干燥的试管中制备功能化双氨基酸溶液。加入 47 µL 的 DIC，并搅拌 90 分钟。然后将35 µL的D-I-P-E-A加入666 µL无水DMF中，混匀后加入树脂，再搅拌5分钟。通过注射器将预先活化的BIS氨基酸溶液转移至反应容器中，次日继续搅拌过夜。反应结束后，排出反应混合物，并在氩气保护下用无水DCM洗涤两次。该实验流程中的关键步骤是双氨基酸偶联。为确保二酮哌嗪环的闭合，我们采用更长的反应时间并加入额外的活化试剂。为促进二酮哌嗪环的闭合，加入 HOAT 和 DIC 溶液，在氩气保护下搅拌反应一小时。接下来，移除隔膜并排出反应混合物。用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂五次，再用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤五次。本部分涵盖功能化BIS氨基酸的深度保护、Fmoc的深度保护以及第一个BIS氨基酸的酰化反应。为了对受保护的功能化双氨基酸进行彻底脱保护，缓慢向反应容器中加入2毫升TFA与TIPS的溶液，排液后搅拌反应1小时。用DCM洗涤树脂约30秒，然后排液，重复此DCM洗涤步骤共5次。随后按照A-D-C-M-D-M-F洗涤顺序，重复整个彻底脱保护树脂洗涤流程。用5%（体积/体积）的D-I-P-E-A DMF溶液洗涤树脂两次，以中和树脂。然后进行另一次D-C-M-D-M-F洗涤。此后，可通过其他官能化的双氨基酸对BIS肽进行延伸，或对前端氮原子上的羧酸进行官能化，或同时进行两种操作。为脱除FM保护基团，加入2 mL含20%哌啶的DMF溶液，混合反应20分钟。用 DMF 将树脂洗涤五次，然后排干。再额外洗涤一次树脂后，重复此过程一次。最后一步，将制备好的氨基酸溶液加入反应容器中，搅拌六小时，以分离第一个双氨基酸。用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂五次，再用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤五次。本实验方案的最后步骤包括从树脂上脱除Bach基团以及将氨基酸从树脂上裂解下来。首先，向反应容器中加入2毫升体积比为1:1的三氟乙酸-二氯甲烷（TFA-DCM）溶液，搅拌30分钟。用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂并排干，重复5次。然后重复此过程一次。分别用二氯甲烷（DCM）和N,N-二甲基甲酰胺（DMF）各洗涤并排干30秒，每种溶剂各洗5次。接下来，加入2毫升无水DMF中10% D-I-P-E-A的溶液，搅拌24至48小时。最后，将反应混合物收集至预先称重的圆底烧瓶中。取30微升该溶液转移至液相色谱-质谱（LC-MS）样品瓶中的450微升四氢呋喃（Tetra Hydro FU）中，并提交进行分析。用额外等份的DMF洗涤树脂，并收集至圆底烧瓶中。在合成过程中，可采用以下方法监测树脂上的化学反应。为检测游离羟基，可进行甲基红试验：首先用一次性移液管取约1毫克干燥树脂。冲洗后转入一个4毫升的反应容器中。加入按文中所述方法配制的甲基红溶液，搅拌5至10分钟。抽干并用二氯甲烷洗涤树脂5次。若树脂珠呈橙色或红色，表明存在游离羟基。该检测可用于评估首个双氨基酸加载及树脂封端步骤的效果。为检测是否存在仲胺，可通过一次性移液器取约一毫克干燥树脂转移至小玻璃瓶中，进行氯醛试验。加入三滴0.8毫摩尔的氯醛DMF溶液和三滴2%的酸醛DMF溶液。然后在室温下静置5到10分钟。在此情况下，蓝色或紫色的树脂珠表明树脂结合的化合物上存在游离的仲胺基团。为确认活化效率，可在合成过程中进行活化捕获测试：将5到10微升活化溶液转移至含有50微升正丙胺的液相色谱-质谱小瓶中，手动混匀，以评估活化化合物的情况。溶液应变为黄色，持续数秒，然后加入450 µL四氢呋喃稀释，并进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析。最终产物和活化中间体可通过配备C18反相柱以及含0.1%甲酸的水-乙腈溶剂系统的LC-MS系统进行检测。该LC-MS-UV色谱图展示了粗产物高纯度的一个示例。在21.3分钟处观察到的色谱主峰，其质谱显示的质量与预期产物质量一致。在粗产物的质谱图中可清楚看到这一现象，该峰显示出多个主要离子峰，分别对应于产物分子量本身、产物分子量加钠离子的质量，以及产物分子量减去IV型DDE保护基团质量的离子峰。此处展示的是纯化后产物的液相色谱-质谱（LCMS）紫外吸收图谱，显示在21.3分钟处得到一个纯度很高的产物峰，其质谱图进一步确证了该纯化三肽峰的结构身份。观看本视频后，您应能充分理解如何在双肽合成技术发展之后，运用固相合成法来制备功能化双肽。掌握该技术后，研究人员可在双肽领域探索其在蛋白质-蛋白质相互作用及催化反应中的应用。若操作得当，该方法可在四到五天内实现功能化双肽三聚体的合成。进行该实验操作时，务必始终注意保持磁珠浸没在反应液及洗涤液中。此外，还可采用平行合成或文库合成等其他方法，以探究立体化学结构或不同官能团对蛋白质结合能力或催化活性的影响。切记，使用有机试剂可能具有极高危险性，因此在操作过程中必须采取相应防护措施，例如佩戴适当的个人防护装备并在通风橱中进行实验。

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