一个主干环肽库作为潜在的抗寄生虫治疗微波辐射的发展
January 26th, 2016
概述了一种使用微波辐照合成环肽的简单通用方法。该程序能够合成具有不同构象集合的骨架环肽，同时保留侧链和药效团部分，因此可以筛选生物活性构象。
该程序的总体目标是使用微波照射开发具有构象多样性的聚焦骨架环肽模拟文库，用于新型抗寄生虫治疗。这种方法可以帮助开发专门针对蛋白质-蛋白质相互作用的新型工具。要开始此程序，请将 2.5 毫升所需的氨基酸、1 毫升活化剂和 0.5 毫升活化剂碱添加到聚丙烯小柱中。
将卡盒放入自动微波合成器中，让偶联反应在 25 瓦和 75 摄氏度下进行 300 秒。反应完成后，在室温下用 7 mL N， N-二甲基甲酰胺或 DMF 洗涤树脂 120 秒。重复上一步 5 次后，向聚丙烯小柱中加入 7 毫升 20% 哌啶的 DMF 溶液和 0.1 摩尔 1-羟基苯并三唑 （HOBt），并在 45 瓦和 75 摄氏度下孵育 30 秒。
完成后，排空反应混合物。接下来，向聚丙烯小柱中加入 7 毫升 20% 哌啶的 DMF 溶液和 0.1 摩尔 HOBt，并在 45 瓦和 75 摄氏度下孵育 180 秒。排空反应混合物后，在室温下用 7 mL DMF 洗涤树脂 120 秒。
然后，在室温下用 7 毫升二氯甲烷 （DCM） 洗涤树脂 120 秒。对于酸酐偶联，在室温下用 7 毫升 1-甲基-2-吡咯烷酮 （NMP） 洗涤树脂 120 秒。完成后，排空反应混合物。
重复上一步 3 次后，将 10 当量的相应酸酐溶解在 50 mL聚丙烯管中的 5 mL NMP 中。然后，向溶液中加入 1 当量的 4-二甲氨基吡啶 （DMAP） 和 10 当量的 N， N-二异丙基乙胺 （DIEA）。将此混合物添加到树脂中，并在 25 瓦和 75 摄氏度下孵育 300 秒。
用 NMP 洗涤树脂后，在室温下用 7 ml DMF 洗涤 120 秒。此时，将树脂转移到配有盖塞和旋塞的聚丙烯小柱中。用 DCM 洗涤树脂后，每 1 克树脂向聚丙烯小柱中加入 15 至 25 毫升 1% 三氟乙酸、5% 三异丙基硅烷和 94% DCM 的混合物。
将聚丙烯小柱放在摇床上，在室温下摇动 5 分钟。然后，通过施加真空将溶液从聚丙烯小柱中排出。重复上述步骤三次后，在室温下用 7 mL DCM 洗涤树脂 120 秒。
这些步骤非常重要，因为发现几种树脂中的三苯基保护基团在 DCM-三氟乙酸溶液中被部分裂解。去除甲基三苯基是一个缓慢的过程，需要多次洗涤。在 50 毫升聚丙烯管中，将 5 个当量的苯并三唑-1-ly-氧-tris-吡咯烷基磷酸铉溶解在 5 毫升二溴甲烷中。
然后，向溶液中加入 10 当量的 DIEA。将混合物添加到经过 DCM 冲洗的树脂中，并在 25 瓦和 75 摄氏度下孵育 300 秒。然后，在室温下用 7 mL DCM 洗涤填料 120 秒。
用 DCM 洗涤两次后，将树脂转移到聚丙烯小柱中，并用乙醚洗涤两次。在真空干燥器中，在室温下用氢氧化钾干燥树脂至少三小时。接下来，向每 1 克树脂中加入 10 毫升预冷的三氟乙酸裂解混合物。
将聚丙烯小柱放在摇床上，在室温下摇动 3 小时。然后，通过将树脂过滤到 50 mL聚丙烯管中来收集切割溶液。向试管中加入 35 毫升冷的乙醚。
在 4 摄氏度下以 1， 207 倍 g 离心 5 分钟。然后，倒出以太层。对于 Kaiser 测试，通过将 16.5 毫克氰化钾溶解在 25 毫升蒸馏水中来制备溶液 A。
用 49 毫升 peridine 稀释 1 毫升溶液。接下来，通过将 1 克茚三酮溶解在 20 毫升乙醇中来制备溶液 B。通过将 40 克苯酚溶解在 20 毫升乙醇中来制备溶液 C。
制备溶液后，将一些微珠从树脂转移到试管中。将每种溶液加入三滴管中，混合。最后，将试管放在加热块上以 110 摄氏度加热 5 分钟。
按照 FMOC、叔丁基实验步骤，在固体载体上使用自动微波合成仪合成骨架环肽。通过质谱分析产品，并使用 HPLC 测定其纯度。生物筛选显示，肽 pL1 对多诺瓦尼利什曼原虫具有活性，多诺瓦尼利什曼原虫是一种引起内脏利什曼病的寄生虫，是人类最严重的利什曼病。
与对照处理相比，肽 pL1 将寄生虫活力降低了 75%。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三到五天内完成。开发后，这项技术为各个领域的研究人员探索肽作为基础研究和治疗中的药理调节剂铺平了道路。
观看此视频后，您应该对如何开发具有构象多样性的重点模拟肽库以专门靶向蛋白质-蛋白质相互作用有很好的了解。不要忘记，使用三氟乙酸可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在通风良好的罩子中工作时佩戴护目镜、穿实验服和手套。
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概览
本文概述了一种使用微波辐射来合成环状肽的方法。该程序允许创建多样化的构型，同时保留侧链和药效团，有助于筛选生物活性构型。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 药物开发
背景
- 环状肽在药物开发中很重要。
- 微波辐射可以提高合成效率。
- 多样化的构型可以导致更好的生物活性。
- 靶向蛋白质-蛋白质相互作用对于治疗进展至关重要。
研究目的
- 开发具有构型多样性的环状肽模拟物库。
- 创建新型抗寄生虫治疗药物。
- 提供用于靶向特定蛋白质相互作用的工具。
使用的方法
- 在聚丙烯笔筒中制备氨基酸和活化剂。
- 在受控功率和温度下进行微波合成。
- 用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤树脂。
- 与哌里定和HOBt孵育以进行去保护。
主要结果
- 成功合成了具有不同构型的环状肽。
- 保留了侧链和药效团。
- 有潜力筛选生物活性构型。
- 为未来的治疗开发建立了方法。
结论
- 微波辅助方法对于环状肽合成是高效的。
- 多样化的构型增强了生物活性的潜力。
- 这种方法可以帮助开发靶向治疗药物。
常见问题
Executive Industry Relevance
Targeting parasite-specific protein-protein interactions (PPIs) with cyclic peptidomimetics offers a path to selective anti-parasitic therapeutics with improved bioavailability and metabolic stability. This microwave-assisted backbone cyclic peptide library approach enables rapid generation of conformational diversity for systematic screening, supporting early-stage target validation and lead identification in infectious disease programs. The method reduces synthesis time and increases library accessibility, facilitating hit-to-lead progression for neglected disease targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of parasite-specific PPI interfaces derived from conserved LACK scaffold regions absent in mammalian hosts.
- Operational Value: Supports rapid synthesis of focused peptidomimetic libraries using microwave irradiation to accelerate coupling and deprotection steps.
- Predictive Value: Facilitates systematic screening of backbone cyclic peptides with varied ring sizes to identify bioactive conformations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates conformationally diverse cyclic peptide libraries suitable for high-throughput screening against parasite PPI targets.
- Operational Value: Produces peptides with retained side chains and pharmacophoric moieties, ensuring structural integrity for reliable assay readouts.
- Scalability: Enables library synthesis in 3–5 days, supporting iterative screening campaigns and structure-activity relationship (SAR) exploration.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Peptide pL1 demonstrated 75% reduction in Leishmania donovani viability, providing proof-of-concept for antiparasitic activity.
- Translational Continuity: Links target validation through PPI disruption to phenotypic screening in a clinically relevant parasite strain.
- De-risking: Early efficacy data supports prioritization of cyclic peptidomimetics for further optimization and preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, enabling target validation through PPI interference, feeding into lead identification via conformational screening, and supporting preclinical progression through demonstrated antiparasitic activity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of parasite-specific PPIs by generating conformationally constrained peptidomimetics from evolutionarily divergent sequences.
- Screening: Delivers standardized, soluble cyclic peptides suitable for biochemical or cellular assays measuring target engagement or parasite viability.
- Analytics: Relies on mass spectrometry and HPLC for identity and purity confirmation, enabling quantitative batch-to-batch consistency.
- Translational Research: Connects molecular design to phenotypic outcomes in Leishmania, supporting biomarker-aligned advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Microwave-assisted solid-phase synthesis platform is adaptable to other target classes, enabling cross-project library generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by enabling selective disruption of parasite PPIs with conformationally defined peptidomimetics.
- Operational Value: Microwave irradiation reduces synthesis cycle times, improves coupling efficiency, and increases library throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early efficacy signals (e.g., 75% parasite viability reduction) before significant investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiparasitic candidates based on target specificity and mechanistic de-risking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in solid-phase peptide synthesis and microwave synthesizer operation.
- Needs access to automated microwave synthesizer, HPLC, and mass spectrometry for purification and analysis.
- Demands standardized washing and deprotection protocols to ensure resin integrity and peptide fidelity.
- Must account for safe handling of trifluoroacetic acid and piperidine mixtures during cleavage and deprotection steps.
- Library diversity is constrained by amino acid solubility and coupling efficiency, requiring optimization per sequence.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:27
Fmoc-protected Amino Acid Coupling
2:03
Anhydride/Acid Coupling
3:01
N-methyltrityl (Mtt) Protecting Group Deprotection
4:18
Cyclization of the Linear Peptide
4:57
Cleavage and Deprotection of Side-chain Groups
6:04
Kaiser (Ninhydrin) Test
7:01
Results: Synthesis of Cyclic Peptides Using Microwave Irradiation
7:45
Conclusion
