结合神经元荧光激活核负向分选与单核RNA测序研究海马神经发生微环境

通过负向FACS分选排除神经元的策略，能够对低丰度细胞群体（如神经干细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞）获得高质量的RNA测序结果，从而研究它们在成年海马神经发生调控中的作用。利用该方法，可在FACS设门过程中灵活调整抗体的选择，使本方案在探究与齿状回相关的多种生物学问题时具有高度的通用性。该方法主要用于研究成年海马神经发生微环境。

然而，该方法也可轻松适用于研究其他干细胞微环境。本实验操作将由弗朗西斯·克里克研究所的博士后培训研究员 Sara Ahmed de Prado 演示。首先，将安乐死小鼠解剖所得的脑组织转移至一个盛有冰冻 PBS 的 10 厘米培养皿中。

然后将培养皿置于冰上，沿矢状轴将脑组织切成两半。使用解剖刀去除小脑。将其中一半脑组织转移至另一个置于冰上的10厘米培养皿中，该培养皿内含有冰冷的PBS。

使用双目解剖镜分离齿状回（dentate gyrus，DG），并重复此步骤以获取脑部另一半的第二个DG。将两个DG转移至预冷的Dounce匀浆器中，加入1毫升冰冷的匀浆缓冲液（homogenization buffer，HB）。先用松头A型研杵匀浆10次，再用紧头B型研杵匀浆15次。将匀浆液转移至预冷的15毫升离心管中。

用1毫升冷的HB缓冲液冲洗Dounce匀浆器，并将冲洗液收集至同一管中。向15毫升离心管中加入3毫升HB缓冲液，冰上孵育5分钟。轻轻倒置试管两次，混匀该细胞核悬液。

取0.5毫升HB缓冲液，预润湿置于50毫升离心管上方的70微米细胞筛网帽，随后过滤细胞核悬液，并用0.5毫升HB缓冲液冲洗细胞筛网。接着，移除细胞筛网，将离心管置于水平转子离心机中，在4摄氏度下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。使用P1000移液器将沉淀物轻轻重悬于4毫升HB缓冲液中。

冰上孵育5分钟后，在4摄氏度下以500 × g离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于3毫升洗涤培养基中。取0.5毫升洗涤培养基预湿置于50毫升试管上的35微米滤筛帽。

然后使用P1000移液器每次吸取0.5毫升悬液，将细胞核悬液过滤。用0.5毫升洗涤液冲洗滤网盖后，将试管置于冰上。将滤液转移至新的15毫升离心管中，在4°C、500 × g条件下离心5分钟。

弃去上清液，将沉淀重悬于 3 毫升洗涤液中。再次进行离心，然后将沉淀重悬于 1 毫升含有小鼠抗 NeuN 抗体（Alexa Fluor 488 标记）、1 微克/毫升 DAPI 的洗涤液中。将反应体系置于冰上避光孵育 45 分钟。

对于荧光激活的细胞核分选（FANS），将免疫染色的细胞核悬液转移至一个5毫升的试管中，并在冰上放置直至开始流式细胞术操作。在将试管放入FACS仪器之前，以低强度涡旋振荡样品3秒。为获取染色细胞核悬液的数据，需在DAPI-height和DAPI-area上设置门控，以排除细胞碎片和聚集的细胞核。

然后在对数侧向散射（SSC）区域和对数前向散射（FSC）区域设置门控，以将单个细胞核与其余DAPI染色的聚集体或细胞碎片分离开。接着通过设置抗NeuN-AF488抗体和FSC区域的门控，分离NeuN-AF488阴性细胞群。分析完成后，按照门控策略将抗NeuN-AF488阴性细胞群分选至含有50 µL洗涤液的1.5 mL收集管中。

分选完成后，向收集管中加入1毫升含1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS），以收集管壁上的液滴，并在4摄氏度下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，保留50微升溶液用于重悬已离心的细胞核。在0.5毫升微量离心管中，将5微升细胞核悬液与5微升台盼蓝混合。

在进行文库构建和细胞核测序之前，使用自动细胞计数仪测定单细胞悬液的浓度并评估其活力。生物信息学聚类分析显示，在海马齿状回（DG）中，无论是否采用FANS方法，均能清晰区分出对应于已知细胞类型的细胞核群。在未经过FACS分选的样本中，大部分高质量测序的细胞核为神经元，占比达84.9%。

它由三类神经元组成，表明齿状回中最具有代表性的细胞群体可能是颗粒神经元、其他兴奋性神经元以及抑制性神经元。在未进行FACS分选的样本中，鉴定出的非神经元细胞簇主要由11.1%的胶质细胞类型构成，包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和少突胶质前体细胞，3.3%的免疫细胞，以及0.6%的 Cajal-Retzius 细胞。在通过FANS排除NeuN阳性群体后，胶质细胞簇变得尤为显著，占总细胞核的81.3%。

对于每个细胞核测序深度为 50,000 条 reads 的样本，非 FACS 分选样本中每个细胞核检测到 25,010 个基因，NeuN 阴性的 FANS 样本中每个细胞核检测到 1,665.5 个基因，证实了单细胞核转录组测序具有高质量，且 FACS 分选不会损伤细胞核，不影响后续的 snRNA-seq 分析。在非 FACS 分选样本中，神经元比例较高，其转录活性也更高，每个细胞核平均检测到 2,660 个基因和 6,170 条转录本，而非神经元细胞类型的平均转录活性为每个细胞核 1,090 个基因和 1,785 条转录本。在使用本方案获得数据后，建议考虑采用一些新的正交方法，如空间转录组学或体内研究，以验证所获得的发现。