Name: 荧光激活神经元核负分选结合单核RNA测序研究海马神经源性生态位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 了解利用荧光激活核分选排除神经元并结合单核RNA测序分析小鼠齿状回低丰度细胞群体的方法。该技术可高效捕获神经干细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞，为研究成年海马神经发生机制提供高质量转录组数据。

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作者谨此感谢 Lachlan Harris 和 Piero Rigo 提供的技术支持，以及 Jason M. Uslaner 的帮助。&#160;以及 Ditte Lovatt 对手稿提供的反馈意见。本工作受到以下资助&#160;由英国医学研究理事会（MRC）的资助以及与默沙东（MSD）的前期竞争前研究合作支持，弗朗西斯·克里克研究所的经费来自英国癌症研究基金会（FC0010089）、英国医学研究理事会（FC0010089）、惠康基金会（FC0010089），以及FG获得的惠康基金会研究者奖（106187/Z/14/Z）。由于篇幅所限，未能讨论和引用许多作者的研究工作，我们对此表示歉意。

动物饲养和实验操作均按照弗朗西斯·克里克研究所的指南以及英国英国内政部的指南和法律法规进行。
<img alt="小鼠齿状回解剖过程示意图，显示组织解离、清洗、免疫染色和单核RNA测序。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64369/64369fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：从小鼠成年齿状回组织制备单核悬液，用于非神经元细胞群体的单核RNA测序。 流程图描述了本实验方案的主要步骤，包括小鼠齿状回的解剖、单核悬液的制备、NeuN免疫染色以及NeuN阴性细胞的流式分选（FANS），随后进行单核RNA测序（snRNA-seq）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64369/64369fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. DG 的分离（用时：15 分钟）
<ol>
	<li>配制细胞核分离介质1和2（NIM1和NIM2）、匀浆缓冲液（HB）以及洗涤介质（WM）（补充表1）。将所有缓冲液、培养基、试剂和工具置于冰上，待用时取出。在开始匀浆前至少1小时，将Dounce匀浆器（见材料表）放置于冰上预冷。 
	注意：NIM1可配制后在4 °C保存最多6个月。NIM2、HB和WM应现配现用。 
	警示：操作DTT、蛋白酶抑制剂和Triton X-100时需格外小心。这些化合物对皮肤和眼睛具有刺激性，急性毒性，并对水生环境有害。使用这些化学品时应佩戴防护手套、防护服及眼部和面部保护装置，操作后彻底洗手，并避免释放至环境中。</li>
	<li>按照英国内政部Schedule 1操作规程，通过颈椎脱位法处死一只22月龄雄性C57Bl/6J小鼠20。 
	注意：有关本研究使用22月龄小鼠的依据，请参见讨论部分。然而，本方案可在生命周期的任何年龄段实施。</li>
	<li>从小鼠尸体中解剖出脑组织，并转移至盛有冰浴1×PBS的10 cm培养皿中（图1）。将培养皿置于冰上。使用解剖刀去除小脑，并沿矢状轴将脑组织从两半球之间切开为两半。</li>
	<li>另取一个10 cm培养皿，加入冰浴PBS并置于冰上。将其中一半脑组织转移至该培养皿中。在体视显微镜下解剖出齿状回（DG），并重复此步骤以从另一半脑组织中获取第二个DG。 
	​注意：这些步骤（步骤1.2–1.4）改编自先前描述的方法21。此阶段应尽快操作，以保持细胞完整性。</li>
	<li>将两个DG组织转移至预冷的Dounce匀浆器中，并加入1 mL冷HB缓冲液。</li>
</ol>
2. 组织解离、单核分离及抗NeuN免疫染色（用时：2 h）
<ol>
	<li>使用松配合的“A”研杵在冰上轻轻研磨组织10次，随后使用紧配合的“B”研杵研磨15次。 
	注意：Dounce匀浆操作应在冰上进行，动作轻柔，以减少因摩擦产生的热量和泡沫。所有缓冲液和设备均需预先冷却，并在操作过程中保持在冰上。</li>
	<li>将匀浆液转移至预冷的15 mL离心管中；用1 mL冷HB缓冲液冲洗Dounce匀浆器，并将冲洗液合并至同一离心管中。向15 mL离心管中加入3 mL HB缓冲液，冰上孵育5分钟。轻轻倒置混匀2次。</li>
	<li>在50 mL离心管上方，用0.5 mL HB缓冲液预润湿70 µm滤网帽。将步骤2.2所得的细胞核悬液轻轻倾倒至细胞滤器中进行过滤。用0.5 mL HB缓冲液冲洗滤器。</li>
	<li>移除细胞滤器，将离心管在4 °C下以500 × g离心5分钟（使用摆动吊桶离心机）。弃去上清液。 
	注意：过滤匀浆液有助于减少碎片，这对后续的流式细胞术和单核RNA测序（snRNA-seq）步骤至关重要。</li>
	<li>使用P1000移液器将沉淀物轻轻重悬于4 mL HB缓冲液中。冰上孵育5分钟。在4 °C下以500 × g离心10分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于3 mL WM缓冲液中。</li>
	<li>在15 mL离心管上方，用0.5 mL WM缓冲液预润湿35 µm滤网帽。将步骤2.5所得的细胞核悬液通过细胞滤器过滤，使用P1000移液器每次轻轻移取0.5 mL。</li>
	<li>用0.5 mL WM缓冲液冲洗滤网帽，将离心管置于冰上。将滤液转移至新的15 mL离心管中，在4 °C下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于3 mL WM缓冲液中。</li>
	<li>在4 °C下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于1 mL WM缓冲液中，加入小鼠抗NeuN Alexa Fluor 488标记抗体（anti-NeuN-AF488，1:32,000）和1 µg/mL DAPI。避光冰上孵育45分钟。 
	注意：为优化分离细胞核的免疫染色效果，建议对抗体进行梯度稀释，以确定用于流式细胞分析和分选的最佳稀释比例。随后应运行足够的对照实验，确认染色条件最优。例如，使用AF488标记的抗NeuN抗体时，应设置阴性对照（即不加抗体，补充图1A）和阳性对照（即加入抗体染色，补充图1B），以评估未染色与染色群体的分离情况。初次使用AF488标记抗体时，建议运行AF488标记的同型对照，以评估染色特异性。若使用非标记的一抗，则可能需要额外设置仅加入二抗的对照，以评估二抗的非特异性结合。</li>
</ol>
3. 荧光激活细胞核分选（FANS）以排除神经元群体（耗时：45 分钟）
<ol>
	<li>将免疫染色后的细胞核悬液转移至5 mL离心管中，并置于冰上，直至开始流式细胞术实验。 
	注意：如果处理的组织样本大于两个小鼠齿状回（DG），可能需要进一步用WM缓冲液稀释，以避免因溶液中细胞核密度过高而导致流式细胞分选（FACS）堵塞。</li>
	<li>将样本在低速下涡旋震荡3秒，然后将试管放入FACS仪器中（参见 材料表). 
	注意：（流式细胞仪设置）在实验开始前，需根据制造商的建议，使用校准微粒对分选仪器进行校准。使用微珠或微球对液滴延迟时间进行校准（参见 材料表）根据FACS模型。样品在 4 °C 纯度模式下进行。为减少收集体积，细胞核通过 70 µm 喷嘴在流式细胞仪推荐的压力下进行操作。细胞核被分选至1.5 mL低吸附管中（参见 材料清单) 含有 50 µL WM的收集管均用PBS + 5% BSA包被 4 °C 过夜孵育以降低细胞核粘附在管壁上的风险。</li>
	<li>为了获取染色后细胞核悬液样本的数据，需在DAPI-高度和DAPI-面积图中设置门控，以排除细胞碎片和聚集的细胞核图 2A）。此外，通过在对数侧向散射（SSC）-面积和对数前向散射（FCS）-面积图中设置门控，将单个细胞核与任何残留的DAPI染色聚集体或细胞碎片分离开来（图2B).</li>
	<li>设置抗NeuN-AF488和FSC-面积的门控，以分离NeuN-AF488阴性群体，如图所示 图2C.</li>
	<li>分析后，按照上述设门策略，将NeuN-AF488阴性群体分选至装有1.5 mL收集缓冲液的1.5 mL离心管中 50 µL 的WM。 
	注意：按照上述设门策略及成年小鼠脑组织中齿状回（DG）的分离解剖步骤，预期NeuN-AF488阴性群体约占单核总数的14%。</li>
</ol>
<img alt="流式细胞术和FACS分析细胞核、散点图、细胞类型UMAP图及数据图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64369/64369fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2齿状回非神经元细胞群体的分离与转录组分析 (A-C) 设门策略用于分离 NeuN-AF488 阴性单核并排除细胞碎片。A) FANS 点图显示一个代表性分离细胞核样本，展示用于选择 DAPI+ 细胞核并排除细胞碎片和聚集体的设门策略。B) 使用FSC-面积和SSC-面积进一步筛选相关单核。C) 设置 NeuN-AF488 的门控以排除阳性群体，并分选阴性单核。D良好的单细胞核悬液显微图像，其中碎片较少，高质量细胞核（圆形，黑色箭头）的比例高于低质量细胞核（白色箭头）。比例尺 = 50 µm, 10 µm （插图）。(E,F) 对22月龄C57BL/6J雄性小鼠DG组织分离的不同细胞群体进行snRNA-seq数据分析及特征鉴定。来自单细胞核表达谱的降维可视化图（UMAP图）展示了（E）非FACS分选细胞和（F) 经FACS分选的NeuN阴性细胞，按细胞类型着色。G) 饼图比较两个样本中鉴定出的细胞类型的频率。H测序样品的各项指标：细胞核数量、每个细胞核的基因中位数以及转录本数量。I) 小提琴图显示了两个样本中每种细胞类型检测到的基因和转录本数量的分布情况。Astr. = 星形胶质细胞，Olig. = 少突胶质细胞，Vasc. = 血管细胞，CRCs = Cajal-Retzius 细胞，Neur. = 神经元，Imm. = 免疫细胞，OPCs = 少突胶质细胞前体细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64369/64369fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
4. 制备单细胞核悬液以进行单细胞核RNA测序（用时：30分钟）
<ol>
	<li>分选后，向收集管中加入 1 mL 含 1% BSA 的 PBS，以收集管壁上的液滴，并在 4 °C 下以 500 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，保留 50 µL。 
	注意：请小心操作离心后的细胞核，因为可能难以观察到管底的沉淀。使用摆桶式离心机有助于在不破坏沉淀的情况下弃去上清液。</li>
	<li>轻轻吹打以重悬离心后的细胞核。将 5 µL 细胞核悬液加入含有 5 µL 台盼蓝的 0.5 mL 微量离心管中。 
	警告：台盼蓝对健康有害，可能致癌，并可能损害生育能力或胎儿。操作时需佩戴防护手套、防护服以及眼部和面部防护装置。在未阅读并理解所有安全注意事项前，请勿操作。</li>
	<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞悬液的浓度并评估其活力（参见 材料表）。按照第 5 步所述进行细胞核文库构建和测序。 
	注意：经评估适合测序的样品在显微镜下应呈现圆形且形态规则的细胞核，无细胞碎片（图 2D）。细胞核膜周围出现晕环或多个细胞核聚集是细胞核受损的表现，此类细胞悬液不应用于单核 RNA 测序（snRNA-seq）（图 2D）。测得的细胞核浓度应在 300–700 个细胞核/µL 范围内。</li>
</ol>
5. 文库制备与测序
注意：以下步骤的描述基于本研究中使用的内部测序平台（参见材料表）。因此，若使用不同的平台，某些设置可能会有所不同。此处仅描述关键步骤，每个参数应根据所选厂商提供的指导和方案进行确定，但在首次使用前需进行优化。在浓缩分选后的细胞核悬液后，应尽快进行文库制备，以避免RNA降解并确保测序结果的最优质量，这一点至关重要。
<ol>
	<li>将 7,000 至 10,000 个细胞核载入微流控单细胞芯片中。</li>
	<li>使用配套控制器及所选供应商提供的试剂，将载入的细胞核分配至纳升级液滴中。在每个液滴内裂解细胞核并进行RNA逆转录。 
	注意：在同一液滴中生成的所有cDNA共享相同的细胞条形码。</li>
	<li>根据所选供应商的指南构建snRNA-seq文库，并确保其与测序平台兼容。采用电泳、荧光定量或基于qPCR的方法检测最终文库的质量和浓度，并在适用情况下，于测序前等摩尔混合文库。</li>
	<li>按照生产商建议，对混合后的3ʹ基因表达文库进行变性并稀释。</li>
	<li>在下一代测序平台上进行双端、单索引或双索引测序，测序深度为每个细胞50,000对读段。</li>
</ol>

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<li>Moreno-Jimenez, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+hippocampal+neurogenesis+is+abundant+in+neurologically+healthy+subjects+and+drops+sharply+in+patients+with+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adult hippocampal neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer's disease.</a> Nature Medicine. 25 (4), 554-560 (2019).</li>
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SG、TL 和 SK 是位于美国新泽西州拉威的默克公司（Merck & Co., Inc.）旗下子公司默克雪兰诺有限责任公司（Merck Sharp & Dohme LLC）的员工，该公司在美国和加拿大以外地区称为 MSD。SG 持有美国新泽西州拉威的默克公司（Merck & Co., Inc.）的股份。

要成功实施本方案，齿状回（DG）的解剖是第一个关键步骤，需要一定的练习才能保持其完整，并尽量减少周围组织的污染。根据经验，熟练的研究人员能够迅速掌握从海马体中分离DG的技术，随后可进一步优化操作以提高解剖速度，从而提升组织的新鲜度，获得高质量的数据。同样地，在单个细胞核的制备与重悬过程中，必须确保不同实验条件之间的一致性，同时避免过度吹打，以免破坏核膜，释放出环境RNA，进而对测序结果造成偏差。除了前述制备高质量细胞核的建议外，在进行测序前还需考虑单细胞核悬液的浓度。根据制造商的指南，若细胞核浓度高于1,200 nuc/µL，则应进行稀释，因为过高的细胞核浓度会增加多重体（multiplets）形成的风险，影响后续的生物信息学分析。值得注意的是，细胞核浓度低于500 nuc/µL的样本可能因成本问题而不值得测序。建议咨询经验丰富的流式细胞分选（FACS）使用者，以设置合适的门控策略，并在不同样本及生物学重复间保持参数设置的一致性。同样，RNA测序文库的制备也需要经过一定培训才能获得高质量结果，大多数供应商均提供完善的技术支持以高效实现这一目标。本研究仅使用新鲜组织验证了该方法；然而，FANS也已被成功应用于冷冻组织25。因此可以合理推测，本方案也可用于冷冻组织，仅需进行少量优化即可。
本方案的开发特别针对一个下游应用，即研究海马神经发生微环境中除神经元以外的其他细胞群体。事实上，越来越多的证据表明，衰老过程中成年海马神经发生（AHN）功能受损可能与微环境中的周围细胞有关1,2,3,9。特别是星形胶质细胞和少突胶质细胞被认为是调节AHN的关键因素；然而，通过从齿状回（DG）中分离这些细胞并结合RNA测序所获得的结果存在不一致，使得利用该技术验证这一假说具有挑战性1,17。采用FACS分选NeuN阴性细胞核的方法，相较于未进行FACS分选的样本，能够更有效地富集星形胶质细胞和少突胶质细胞，从而实现更高质量的生物信息学分析。该方案适用于全生命周期各个年龄段，本文展示的老年动物组织代表性数据证明了该方法在研究衰老相关海马神经发生微环境方面的稳健性。为了拓展本方法的应用范围并适应不同的生物学问题，需要考虑的是，可尝试其他神经元核膜抗原，并对这些标志物的最佳验证抗体进行充分的滴定测试。例如，在研究DG中神经干细胞（NSCs）向神经元分化的进程时，某些细胞类型（如2型细胞或成神经细胞）开始表达NeuN（补充图3），因此需要选择其他抗原以特异性地研究这些细胞类型。相反，在本研究中，经过NeuN阴性FACS分选后仍检测到部分神经元，可能是由于这些细胞群体中NeuN表达水平极低或不表达（例如皮层 Cajal-Retzius 神经元19）。此外，已有报道显示NeuN在少突胶质细胞的某些亚群中也有表达26，若研究目标为这些亚群，则可能导致结果偏差。因此，在开始使用FANS技术时，对抗原的选择必须谨慎，以避免非特异性地纳入或排除某些细胞群体，从而影响对特定生物学问题的准确回答。与此一致的是，也建议在利用本方案验证或否定某一假设之前，通过正交实验（如免疫组织化学或RNA-scope）对每项测序结果进行进一步验证。最后，FANS步骤还可进一步优化，例如使用多种抗体并结合更精细的分选策略，以排除和/或富集目标细胞群体。
最终，本方案中描述的技术在用于其他物种时可能存在某些局限性。例如，在啮齿类动物中，神经发生微环境的边界非常明确，增殖性和静息态的神经干细胞（NSCs）或新生神经元被严格限制在齿状回（DG）的特定亚区域之内；但在其他物种中，海马体神经发生微环境应如何界定仍不明确。事实上，在非人灵长类动物和人类中，增殖性细胞并非排列在DG的一个连续区域内，而是分散分布在DG周围，甚至可能存在于杏仁核中7。因此，在其他物种中分离和获取比DG更广泛的脑区，可能会影响本方案的应用。特别是组织制备过程中的解离和吹打步骤，在处理较大组织样本时需要进行优化27,28。在生物信息学分析方面，实验室饲养的近交系啮齿类动物具有高度均一且注释完善的基因组，而人类基因组具有较高的遗传变异性，同时缺乏足够数量的细胞标志物以清晰区分不同的细胞群体（例如NSCs与星形胶质细胞），这使得数据分析需要进行大量归一化处理，当识别出较小的细胞簇时，可能导致不同的分析结论7,11。在这种情况下，细胞富集可能仍然是更优选择，或应与其他策略联合使用以提高分析效能。
尽管如此，目前的方法能够用于研究那些虽尚未被充分关注但可能在成年海马神经发生（AHN）调控中发挥重要作用的细胞群体。这一方法尤其适用于星形胶质细胞群体的研究，因为这类细胞在神经退行性疾病的起始和进展过程中起着核心作用29,30。本研究证明，仅通过排除齿状回（DG）中绝大多数神经元，即可简单地识别并分析星形胶质细胞及其他稀有细胞群体的特征。采用其他不同方法的研究尚未能从相同范围的细胞群体中实现类似水平的细胞核回收效率5,11,17。此外，本研究结果表明，利用该方法无需对该细胞群体进行特异性富集，即可成功分离出神经干细胞（NSC）簇15。
总之，遵循并改进该方法将有助于推进对海马神经发生微环境在调节成人海马神经发生（AHN）中的情境作用所存在的未解问题的研究。特别是，该方法可为与AHN调控相关的细胞群体在衰老和疾病大脑中的基因表达水平提供新的见解9，支持鉴定神经干细胞（NSCs）潜在异质性1，或阐明血管系统在AHN中的作用。最终，该方法可被调整应用于其他具有类似科学问题和挑战的成体干细胞微环境研究。

成年期海马神经元的持续生成，也称为成年海马神经发生（Adult Hippocampal Neurogenesis, AHN），与学习、记忆获取/清除以及模式分离等认知功能相关，并且似乎是延缓衰老及神经退行性疾病中认知功能衰退的重要保护机制1,2,3。啮齿类动物一直是研究AHN的首选模型，常用方法包括免疫细胞化学和下一代测序（next-generation sequencing, NGS）技术。然而，这些研究结果向其他物种的转化仍存在争议。事实上，尽管在大多数物种中均观察到AHN现象，但其在整个生命周期中的持续程度，特别是在人类中的情况4,5,6,7,8，仍经常受到质疑。
迄今为止，已证实多种内在和外在信号通路可调节成年海马神经发生（AHN）1然而，细胞间通讯对成体神经发生（AHN）的影响才刚刚开始被揭示9这可能首先归因于目前所知的细胞标志物特异性不足，无法进行 体内 利用基因修饰动物进行分析。事实上，许多研究依赖于在多种细胞类型中表达的标志物，例如双皮质素或胶质纤维酸性蛋白（GFAP）1第二，成年海马神经微环境的复杂性及其高度的细胞多样性10 为每种细胞类型进行特征分析带来了技术上的挑战。这种情况在生物信息学分析中尤为突出，因为在不同细胞群体（如NSCs或胶质细胞）的分析流程中常使用存在重叠的细胞标记物，导致在评估AHN时得出有争议的结论。7,11第三，神经元数量庞大，严重影响了对较为稀少的细胞群体（如星形胶质细胞、少突胶质细胞或室管膜细胞）的研究，尽管这些细胞在成年神经发生精细调控中的作用正日益凸显9这些局限性共同影响了将啮齿类动物研究结果外推至其他物种的能力。这一问题因难以重现 体外 复杂的组织，例如海马神经发生微环境，以及在涉及人体组织的研究中，获取高质量组织存在诸多障碍，同时缺乏标准化的组织处理方案12,13因此，开发新方法以分析齿状回（DG）中的细胞群体并鉴定新的细胞标志物至关重要，这将最终有助于更深入地理解各类细胞在成年海马神经发生（AHN）调控中的不同作用。
为实现这一目标，单细胞（sc）和单细胞核（sn）分离结合RNA测序技术已成为研究齿状回（DG）等复杂组织的关键手段14。因此，已有多种细胞富集策略被用于从小鼠成年海马生态位中分离单细胞，主要目的是研究神经干细胞（NSCs）15,16。一项富集DG中非神经元细胞的有趣策略是通过测序GluR1/Cd24双阴性单细胞实现的，该方法共获得1,408个测序细胞，但在生物信息学分析后并未在星形胶质细胞与神经干细胞之间形成明显的聚类17。这可能是由于单细胞制备过程中所需的剧烈酶消化处理损伤了细胞完整性和RNA。为克服这一技术难题，已开发出多种采用单细胞核分离的方法，这些方法尤其适用于结构复杂的组织11,18。然而，DG内乃至更广泛的海马-内嗅系统中神经元占主导地位，导致在研究这些脑区全部细胞群体时产生采样偏差。此外，单细胞文库制备时可上样细胞数量有限，进一步加剧了测序单细胞核数据分析流程中主要细胞群体的过度代表。事实上，在分析中通常仅对大型神经元簇进行注释和分析，而其他细胞群体则可能被低估或遗漏5,11。
为了克服这些偏差，并能够分析小鼠齿状回（DG）中除神经元以外的其他细胞类型，本研究采用基于荧光激活细胞核分选（Fluorescence Activated Nuclei Sorting, FANS）18 的方法，通过阴性筛选标记神经元核抗原（NeuN，亦称为 Rbfox3）的单个细胞核，排除大多数神经元群体。选择该抗原是基于文献中将 NeuN 描述为一种可靠的神经元标志物19，以及本方法需使用核蛋白的必要性。将 NeuN 阴性的 FACS 分选细胞用于在 10x Genomics 平台上进行 RNA 测序。结果表明，排除表达 NeuN 的细胞可实现对胶质细胞及稀有细胞群体进行细胞类型特异、高质量的转录组学分析。

<table><tbody><tr><td>0.5 ml 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>10.00&amp;micro;m Flouresbrite YG 羧基微球</td><td>Polysciences</td><td>15700-10</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 聚丙烯离心管</td><td>康宁</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>2 把无菌杜蒙特 #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9564-10MG</td><td></td></tr><tr><td>4150 TapeStation 系统</td><td>安捷伦</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 圆底高透明度聚丙烯带盖离心管</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞滤网 snap 盖</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 聚丙烯离心管</td><td>康宁</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m细胞滤筛</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>8 峰 SPHERO Rainbow 校准微粒</td><td>BD 生物科学</td><td>RCP-30-5A</td><td></td></tr><tr><td>Accudrop 珠子</td><td>BD 生物科学</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-30R 离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>抗 NeuN 抗体，克隆株 A60，Alexa Fluor 488 标记</td><td>Millipore</td><td>MAB377X</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;BD FACSAria Fusion 流式细胞仪</td><td>BD 生物科学</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter MoFlo XDP</td><td>贝克曼库尔特</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>铬控制器</td><td>10x Genomics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM 单细胞 3' 试剂盒 v3.1</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000121；PN-1000120；PN-1000213</td><td></td></tr><tr><td>BSA 7.5%</td><td>Gibco</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 组织研磨器套装：研钵、松配合杵（A）和紧配合杵（B）</td><td>KIMBLE</td><td>D8938-1SET</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf管 Protein LoBind 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30108116</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Halt蛋白酶抑制剂，100倍浓度</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 4000 测序系统</td><td>Illumina</td><td>N/A</td><td>测序配置：28-8-0-91</td></tr><tr><td>KCl</td><td>任何化学品供应商</td><td></td><td>实验室自制</td></tr><tr><td>LUNA-FX7 自动细胞计数仪</td><td>Logos Biosystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>任何化学品供应商</td><td></td><td>实验室自制</td></tr><tr><td>N&amp;deg;10 把带防护的无菌一次性手术刀</td><td>Swann-Morton</td><td>6601</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>无菌学生手术剪一对</td><td>Fine Science Tools</td><td>91401-12</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>任何化学试剂供应商</td><td></td><td>实验室制备</td></tr><tr><td>RNase 抑制剂 40 U &amp;micro;l-1</td><td>Ambion</td><td>AM2684</td><td></td></tr><tr><td>RNasin 40 U &amp;micro;l-1</td><td>Promega</td><td>N211A</td><td></td></tr><tr><td>无菌培养皿</td><td>康宁</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲液，pH 8.0</td><td>任何化学试剂供应商</td><td></td><td>实验室自制</td></tr><tr><td>Triton X-100 10% (v/v)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr></tbody></table>

结合神经元荧光激活核负向分选与单核rna测序研究海马神经发生微环境

Fluorescence-Activated Nuclei Negative Sorting of Neurons Combined with Single Nuclei RNA Sequencing to Study the Hippocampal Neurogenic Niche

成年海马神经发生（AHN）在大量研究中已得到充分验证，其过程包括齿状回颗粒下区（SGZ）内增殖性和静息态神经干细胞（NSCs）的终生维持，以及这些细胞分化为新生神经元并最终成为颗粒细胞层中颗粒细胞的过程。利用基因修饰动物（尤其是啮齿类动物）是研究调控 AHN 的信号通路以及分析构成海马神经发生微环境中各类细胞功能的有力工具。为实现后者，结合单细胞核分离与下一代测序的技术已在 AHN 领域产生重要影响，可用于鉴定各细胞群体的基因表达特征。然而，仍需进一步优化这些技术，以实现对 DG 中稀有细胞群体的表型分析。本文介绍一种利用荧光激活细胞核分选（FANS）的方法，通过对新鲜解剖获取的 DG 组织分离得到的单细胞核悬液，选择 NeuN 抗原无染色的细胞核，排除大多数神经元群体，从而进行单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq）。该方法有望成为深入研究 AHN 过程中细胞间调控机制以及跨物种发现新细胞标志物和作用机制的重要步骤。

本文所述方案介绍了一种制备来自齿状回（DG）的非神经元单细胞核悬液以进行单核RNA测序（snRNA-seq）的方法。无论是否使用荧光激活核分选（FANS），生物信息学聚类均显示出对应于DG内已知细胞类型的清晰分离的细胞核群（图2E，F）。在未经FACS分选的样本中，所测序的高质量细胞核主要由三类神经元组成（占该样本总细胞核的84.9%，图2E，G，H）。这一结果符合预期，因为DG中占比最高的细胞群体为颗粒神经元、其他兴奋性神经元（标记为兴奋性神经元）以及抑制性神经元10。所鉴定出的非神经元聚类主要由胶质细胞类型（11.1%）构成，包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和少突胶质前体细胞（OPCs）、免疫细胞（3.3%）以及 Cajal-Retzius 细胞（0.6%）。当通过FANS排除NeuN阳性细胞群（即NeuN阴性FACS分选样本；图2F，G，H）时，胶质细胞聚类成为主导（占81.3%）。分离出更多的胶质细胞核有助于更精细地区分那些在未使用FANS时会聚集成同一簇的不同细胞群体。事实上，在对表达于神经干细胞（NSCs）或星形胶质细胞中的特定基因进行重新聚类和分析后，可区分出四个亚群（补充&#160;图2A,B）。通过观察更特异的细胞标记物并评估各细胞类型间的基因表达水平，发现一小群NSCs与主要的星形胶质细胞群体分离，表现为Hopx和Notch2表达较高，而Aldh1a1和Aqp4几乎无表达（补充&#160;图2C）。然而，由于星形胶质细胞与NSCs之间存在基因表达的重叠，仍需进一步分析以精确描绘和鉴定不同细胞亚型。此外，在NeuN阴性FANS样本中还检测到额外的血管细胞聚类（2.3%），交叉验证其特异性标记物表达后确认其包含内皮细胞、周细胞和血管软脑膜细胞（数据未显示）。
根据所选建库测序方案的指导，无论是否使用FANS，均获得了高质量的表达谱。对于每个细胞核测序50,000条reads的样本，在过滤掉低质量细胞核后，未进行FACS分选的样本平均每细胞核检测到2,510个基因（5,578个转录本，图2H），NeuN阴性FANS样本平均每细胞核检测到1,665.5个基因（3,508个转录本）（图2H，I）。这些指标证实，本方案生成的单细胞核转录组谱质量较高，可与采用不同方法的研究相媲美22,23，且FACS分选过程不会损害细胞核，从而不影响后续的snRNA-seq分析。值得注意的是，两个样本间每细胞核检测到的基因数和转录本数的差异并非源于数据质量较低，而是由于未进行FACS分选的样本中神经元比例较高（84.9%，而NeuN阴性FANS样本中为1.7%），神经元的转录活性高于所有非神经元细胞类型的平均转录活性（在未进行FACS分选的样本中，神经元为每细胞核2,660个基因和6,170个转录本；非神经元细胞类型平均为每细胞核1,090个基因和1,785个转录本，图2I）。
综合这些代表性结果表明，利用FANS分选NeuN阴性细胞核是从新鲜解剖的脑组织中分离低丰度细胞类型并对其进行高质量单细胞核转录组分析的有效工具 通过 snRNA-seq 方法
补充图1：FANS免疫染色的验证。 核悬液分别在（A）不加抗NeuN-AF 488抗体（阴性对照）或（B）加入该抗体的条件下孵育，随后通过FACS分选仪检测，以验证免疫染色条件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64369/figS1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：星形胶质细胞簇的基因表达分析及重新聚类。（A）基于图2F中全基因组表达谱对4968个细胞核进行聚类的降维均匀流形近似与投影（UMAP）图。细胞类型注释基于细胞类型特异性标记基因确定。（B）从（A）中选取的包含2579个细胞核的星形胶质细胞簇，进一步细分以探究潜在的细胞亚型。通过Seurat聚类方法（0-3）检测到四种亚型，以不同颜色表示。（C）四种细胞亚型中特定细胞标记基因的表达水平。所有图表均使用Seurat R软件包24生成。简言之，对每个细胞的RNA-seq计数数据，先按总表达量进行归一化，并乘以缩放因子（10,000），然后进行对数转换。转换后的数值在每个细胞内进行标准化处理（方差缩放至1，均值设为0），随后应用UMAP算法计算嵌入向量，作为二维图中x轴和y轴的坐标值。图形展示的是降维技术在二维散点图上的输出结果，每个点代表一个细胞，其x、y坐标由降维算法确定的细胞嵌入向量决定。具有相似基因表达特征的细胞在嵌入空间中位置相近。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64369/figS2.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图3：神经发生谱系中NeuN的基因表达分析 (AUMAP 图显示来自公开数据集的神经发生谱系聚类情况15UMAP 图的生成方法同 补充图2. (B神经发生谱系中特定细胞标志物的基因表达水平，显示星形胶质细胞（水通道蛋白4 = Aqp4）、神经干细胞（仅含同源结构域蛋白 = Hopx）、NeuN/Rbfox3（神经干细胞和中间前体细胞 [IPCs]）以及增殖细胞（周期素依赖性激酶6 = Cdk6）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64369/figS3.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充表1：本研究中使用的培养基和缓冲液的组成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64369/Supplemental table 1_R1_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍一种对小鼠齿状回中分离的单个细胞核进行测序的方法，该方法通过荧光激活细胞核分选（FAN-分选）排除大多数神经元。该方法可获得高质量的表达谱，有助于研究该微环境中存在的大多数其他细胞类型，包括数量稀少的细胞群体，如神经干细胞。

结合神经元荧光激活核负向分选与单核RNA测序研究海马神经发生微环境

成年海马神经发生（Adult Hippocampal Neurogenesis, AHN），是指在成年期持续维持海马内增殖性与静息态神经干细胞（NSCs）的过程……

通过负向FACS分选排除神经元的策略，能够对低丰度细胞群体（如神经干细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞）获得高质量的RNA测序结果，从而研究它们在成年海马神经发生调控中的作用。利用该方法，可在FACS设门过程中灵活调整抗体的选择，使本方案在探究与齿状回相关的多种生物学问题时具有高度的通用性。该方法主要用于研究成年海马神经发生微环境。然而，该方法也可轻松适用于研究其他干细胞微环境。本实验操作将由弗朗西斯·克里克研究所的博士后培训研究员 Sara Ahmed de Prado 演示。首先，将安乐死小鼠解剖所得的脑组织转移至一个盛有冰冻 PBS 的 10 厘米培养皿中。然后将培养皿置于冰上，沿矢状轴将脑组织切成两半。使用解剖刀去除小脑。将其中一半脑组织转移至另一个置于冰上的10厘米培养皿中，该培养皿内含有冰冷的PBS。使用双目解剖镜分离齿状回（dentate gyrus，DG），并重复此步骤以获取脑部另一半的第二个DG。将两个DG转移至预冷的Dounce匀浆器中，加入1毫升冰冷的匀浆缓冲液（homogenization buffer，HB）。先用松头A型研杵匀浆10次，再用紧头B型研杵匀浆15次。将匀浆液转移至预冷的15毫升离心管中。用1毫升冷的HB缓冲液冲洗Dounce匀浆器，并将冲洗液收集至同一管中。向15毫升离心管中加入3毫升HB缓冲液，冰上孵育5分钟。轻轻倒置试管两次，混匀该细胞核悬液。取0.5毫升HB缓冲液，预润湿置于50毫升离心管上方的70微米细胞筛网帽，随后过滤细胞核悬液，并用0.5毫升HB缓冲液冲洗细胞筛网。接着，移除细胞筛网，将离心管置于水平转子离心机中，在4摄氏度下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。使用P1000移液器将沉淀物轻轻重悬于4毫升HB缓冲液中。冰上孵育5分钟后，在4摄氏度下以500 × g离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于3毫升洗涤培养基中。取0.5毫升洗涤培养基预湿置于50毫升试管上的35微米滤筛帽。然后使用P1000移液器每次吸取0.5毫升悬液，将细胞核悬液过滤。用0.5毫升洗涤液冲洗滤网盖后，将试管置于冰上。将滤液转移至新的15毫升离心管中，在4°C、500 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 3 毫升洗涤液中。再次进行离心，然后将沉淀重悬于 1 毫升含有小鼠抗 NeuN 抗体（Alexa Fluor 488 标记）、1 微克/毫升 DAPI 的洗涤液中。将反应体系置于冰上避光孵育 45 分钟。对于荧光激活的细胞核分选（FANS），将免疫染色的细胞核悬液转移至一个5毫升的试管中，并在冰上放置直至开始流式细胞术操作。在将试管放入FACS仪器之前，以低强度涡旋振荡样品3秒。为获取染色细胞核悬液的数据，需在DAPI-height和DAPI-area上设置门控，以排除细胞碎片和聚集的细胞核。然后在对数侧向散射（SSC）区域和对数前向散射（FSC）区域设置门控，以将单个细胞核与其余DAPI染色的聚集体或细胞碎片分离开。接着通过设置抗NeuN-AF488抗体和FSC区域的门控，分离NeuN-AF488阴性细胞群。分析完成后，按照门控策略将抗NeuN-AF488阴性细胞群分选至含有50 µL洗涤液的1.5 mL收集管中。分选完成后，向收集管中加入1毫升含1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS），以收集管壁上的液滴，并在4摄氏度下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，保留50微升溶液用于重悬已离心的细胞核。在0.5毫升微量离心管中，将5微升细胞核悬液与5微升台盼蓝混合。在进行文库构建和细胞核测序之前，使用自动细胞计数仪测定单细胞悬液的浓度并评估其活力。生物信息学聚类分析显示，在海马齿状回（DG）中，无论是否采用FANS方法，均能清晰区分出对应于已知细胞类型的细胞核群。在未经过FACS分选的样本中，大部分高质量测序的细胞核为神经元，占比达84.9%。它由三类神经元组成，表明齿状回中最具有代表性的细胞群体可能是颗粒神经元、其他兴奋性神经元以及抑制性神经元。在未进行FACS分选的样本中，鉴定出的非神经元细胞簇主要由11.1%的胶质细胞类型构成，包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和少突胶质前体细胞，3.3%的免疫细胞，以及0.6%的 Cajal-Retzius 细胞。在通过FANS排除NeuN阳性群体后，胶质细胞簇变得尤为显著，占总细胞核的81.3%。对于每个细胞核测序深度为 50,000 条 reads 的样本，非 FACS 分选样本中每个细胞核检测到 25,010 个基因，NeuN 阴性的 FANS 样本中每个细胞核检测到 1,665.5 个基因，证实了单细胞核转录组测序具有高质量，且 FACS 分选不会损伤细胞核，不影响后续的 snRNA-seq 分析。在非 FACS 分选样本中，神经元比例较高，其转录活性也更高，每个细胞核平均检测到 2,660 个基因和 6,170 条转录本，而非神经元细胞类型的平均转录活性为每个细胞核 1,090 个基因和 1,785 条转录本。在使用本方案获得数据后，建议考虑采用一些新的正交方法，如空间转录组学或体内研究，以验证所获得的发现。

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科研

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Neuroscience

神经科学

荧光激活神经元核负分选结合单核RNA测序研究海马神经源性生态位

本视频展示了一种从小鼠脑中分离荧光标记神经元的方法。...

从小鼠大脑中分离荧光标记的神经元

该视频展示了一种从小鼠海马齿状回（DG）的胶质细胞和干细胞中分离完整细胞核的方法。将DG组织在冰冷的匀浆缓冲液中进行机械解离，以释放细胞核。弃去组织碎片及其他释放出的细胞器，细胞核经DNA染料以及与神经元核抗原（NeuN）特异性结合的荧光素标记抗体染色。随后采用荧光激活细胞核分选技术，分离出NeuN阴性的非神经元细胞核。...

一种从海马齿状回非神经元细胞中分离细胞核的技术

本视频演示了使用荧光激活细胞核分选（FANS）从新鲜冷冻的人脑组织中分离和分选细胞核的实验步骤，该方法可用于研究不同细胞群体在多种神经科学领域的应用。...

使用荧光激活细胞核分选技术从脑组织中分离细胞群体

本视频展示了一种从大鼠海马组织中分离细胞的实验方案，包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。...

从大鼠海马体获取不同神经细胞群体

本视频演示了在微流控芯片内培养的大鼠海马神经元的免疫荧光染色，用于分析神经元的成熟与连接性。...

微流控芯片内大鼠海马神经元的荧光免疫染色

关键词：微流控芯片，大鼠海马神经元，荧光免疫染色，神经元培养，细胞分隔，轴突，树突，免疫荧光，神经生物学

本实验方案的目的是利用荧光激活细胞分选（FACS）技术分选出特定类型的神经细胞，以便后续分析细胞类型特异性的基因表达、表观遗传标记和/或蛋白质表达。...

利用荧光激活细胞分选技术分析大鼠脑组织中特定细胞类型的基因表达

本文介绍一种荧光激活细胞分选（FACS）方案，用于研究来自新鲜和冷冻脑组织中表达 Fos 的神经元群体的分子改变。使用冷冻组织可实现跨多个实验批次对多个脑区进行 FACS...

流式荧光细胞分选（FACS）及对新鲜与冻存大鼠脑组织中Fos表达神经元的基因表达分析

本方案描述了手动分选单个荧光标记神经元的步骤，随后进行 体外...

使用手动分选与双细胞剔除法对荧光标记小鼠神经元进行单细胞RNA测序 体外 具有绝对计数测序的转录组分析（DIVA-Seq）

本方案描述了一种结合荧光的方法 原位...

多重荧光联合检测 原位 新鲜或固定小鼠脑切片上的荧光免疫组织化学杂交

我们开发了一种方法，可从新鲜冷冻组织中富集并分离人星形胶质细胞群体，用于后续分子分析。...

利用荧光激活细胞核分选技术从新鲜冷冻皮层中分离成人人类星形胶质细胞群体

了解利用荧光激活核分选排除神经元并结合单核RNA测序分析小鼠齿状回低丰度细胞群体的方法。该技术可高效捕获神经干细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞，为研究成年海马神经发生机制提供高质量转录组数据。

结合神经元荧光激活核负向分选与单核RNA测序研究海马神经发生微环境

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