从人窦卵泡中提取、标记和纯化谱系特异性细胞

这里展示的方案能够标记和分离从早期窦阶段开始存在于卵巢卵泡中的特定细胞谱系，从而实现高分辨率分析和培养。这种高度精确的方法利用荧光团偶联抗体的组合来靶细胞表面标志物，这些标志物在离散的颗粒、基质和膜谱系中稳定且特异性地表达。首先将卵巢放入无菌培养皿中，然后倒入冷却培养基以滋润组织，确保卵巢半浸没在培养基中。

移除任何缝合线或其他材料，并将残留的周围组织从卵巢中解剖出来。要分离窦卵泡，请识别单个卵泡并选择健康的卵泡。排除任何充满血液、深色或不对称的卵泡。

使用手术刀从卵巢中分离选定的窦卵泡，保持胃窦完整并切除包围卵泡的皮质组织。将每个切除的完整窦卵泡放入六孔板的一个孔中。使用放置在培养皿下方的尺子，确定卵泡直径以进行描述。

使用手术刀将完整的窦卵泡一分为二以评估窦腔，并加入6毫升酶细胞分离培养基，然后将板在加湿的培养箱中孵育10分钟。孵育后，加入6毫升含有20%胎牛血清或FBS的可用培养基，并用P-1000微量移液器重复剧烈移液于平分卵泡上，与培养基冲洗。接下来，收集介质并将其通过100毫米过滤器。

将过滤后的上清液在300G和4摄氏度下离心三分钟后，吸出上清液。将剩余的组织置于每毫升100单位胶原酶和每毫升1单位分散酶的混合物中，在孵育30分钟前稀释在平衡的盐水溶液中。通过在 10 分钟和 20 分钟后研磨和剧烈移液两次来机械破坏组织。

完成后，通过P-1000微量移液器吸头恢复组织并通过移液冲洗，并通过100毫升过滤器过滤。将应变的组织在300G和4摄氏度下离心三分钟，然后将富含膜细胞和基质细胞的细胞沉淀放在冰上进行标记和FACS。为了鉴定颗粒细胞和膜细胞，将细胞沉淀重悬于含有直接偶联抗体的封闭溶液中，并在 4 摄氏度下孵育 10 分钟。

洗涤和离心细胞后，将细胞重悬于含有4-6二脒基-2-苯基吲哚或DAPI的FACS缓冲液中，并通过FACS仪器运行细胞悬液以捕获少量细胞，使用荧光团偶联抗体的荧光强度进行门控。将卵巢的其余部分一分为二。使用弯曲的细剪刀和手术刀切除髓质，避免损伤卵巢皮层。

通过轻轻刮擦继续处理和变薄卵巢皮层，直到保留最少的髓质。沿卵巢长度将皮质组织分成两到三毫米宽的条带。对于卵巢组织冷冻，将一条皮质条放入每个含有冷冻溶液的冷冻小瓶中。

在4摄氏度的旋转板上摇动装有皮质条的低温小瓶20分钟。通过用短暂浸入液氮中的棉头接触每个冷冻小瓶来形成冰晶。收集卵巢细胞，并将细胞组分从窦卵泡FACS分选至纯度超过95%。

随着窦卵泡尺寸的增加，PVRL1或凝集素中CD99特异性标记的颗粒细胞越来越多地局限于颗粒卵巢细胞区室。结果发现，针对内分泌蛋白或CD55的抗体特异性地划分了所有基质细胞和膜细胞，丙氨酸氨基肽酶由雄激素膜细胞特异性表达。用针对CD99的抗体标记细胞以鉴定颗粒细胞，并使用抗CD45的抗体来排除造血细胞。

针对PVRL1的抗体将颗粒细胞群分离成卵泡和壁室。在用胶原酶分散酶酶消化后，用CD55，CD34和丙氨酸氨基肽酶抗体标记的细胞制剂能够捕获所有基质或膜细胞或雄激素卵泡细胞，而内皮细胞从膜细胞群中排除。在初始卵泡分离期间，通过在卵泡边界周围的安全边缘内切割，特别注意避免破坏卵泡的窦。

在该程序的下游，细胞可用于分子或诊断分析，或者用于体外培养以进行毒理学研究，实验分析或卵泡微环境的概括。迄今为止，这些方法被用于模拟涉及卵巢的内分泌疾病，并鉴定卵泡相关细胞的新亚群。