提取人输卵管上皮细胞用于单细胞分析的有效方法

我们的研究重点是了解和对抗卵巢癌的化疗耐药性。我们的目标是发现驱动耐药性的机制和细胞亚群，以及根除这些侵袭性种群的新靶点。

单细胞RNA测序有助于表征异质性卵巢肿瘤中的亚群。我们利用非癌性输卵管上皮细胞作为卵巢癌分析的正常来源细胞。

将输卵管上皮细胞有效分离到富集的单细胞悬液中将有助于进一步了解高级别浆液性卵巢癌疾病的起因。这种机械和酶消化技术为提取活输卵管上皮细胞的富集单细胞悬浮液提供了更有效的过程。

[旁白]首先，将新鲜的人输卵管收集在含有解离介质的 15 或 50 毫升管中，并将管子放在冰上。将输卵管转移到含有新鲜解离培养基的无菌培养皿中，并将样品置于解剖显微镜下。现在，使用细尖镊子和 Vannas-Tubingen 剪刀，解剖掉脂肪、结缔组织和管子周围的任何血管。然后，用剪刀剪开输卵管的冠状面，形成直径三到五毫米的小圆柱体。在切割时使用细=点镊子稳定组织。小心地从含有组织碎片的培养皿中吸出解离介质。用两毫升冷的 1x PBS 清洗纸巾片两次，然后轻轻旋转板。吸出PBS后，在室温下将组织片在冷的5毫摩尔EDTA中孵育五分钟。将组织片段悬浮在冷的 1% 胰蛋白酶汉克斯平衡盐溶液中，并在 4 摄氏度下孵育 40 分钟。吸出 1% 胰蛋白酶汉克斯平衡盐溶液，并在冷解离培养基中洗涤组织碎片两次以灭活胰蛋白酶。在室温下将组织片段与0.4毫克DNase一起在两毫升解离培养基中孵育至少30分钟。在解剖显微镜下，当仍在DNase培养基中时，用镊子握住输卵管的碎片，使管腔与培养皿底部平行。用镊子反复按压组织，将上皮细胞从管腔中排出。确认组织周围细胞光晕的释放。将含有培养基的细胞转移到无菌的 15 毫升管中。用解离培养基洗涤培养皿两次，并在同一管中混合洗涤液。丢弃剩余的基质管碎片。要收获细胞，请将它们以 500g 离心五分钟。吸出上清液并将沉淀重悬于一毫升解离培养基中。现在，将 10 微升细胞悬液与等体积的台盼蓝混合。将 10 微升混合物移液到腔室计数载玻片中，并将其插入细胞计数器中以确定细胞计数。将细胞重悬于含有一型胶原酶和DNase的九毫升解离培养基中。在设置为 200 RPM 的轨道振荡器中在 37 摄氏度下孵育 30 至 45 分钟。要收获细胞，请以 500g 离心五分钟。吸出上清液后，将沉淀重悬于五毫升解离培养基中以洗掉胶原酶。将细胞悬液通过 100 微米细胞过滤器放入 50 毫升管中，并将滤液以 500g 离心五分钟。如果细胞沉淀呈红色，则准备红细胞裂解缓冲液来裂解红细胞。从沉淀中吸出培养基，加入五毫升稀释的红细胞裂解缓冲液，并将样品在冰上孵育三分钟。要停止红细胞裂解，请向管中加入 45 毫升 1x PBS。将试管以 500g 离心五分钟。收获细胞并将其重悬于一毫升解离培养基中后，将 10 微升细胞悬液与等体积的台盼蓝混合。将 10 微升混合物移液到腔室计数载玻片中，并将其插入细胞计数器。流式细胞术分析证实，从输卵管组织中分离出活且富集的上皮细胞群，平均活力为82%。取出CD45阳性免疫细胞后，EpCAM阳性上皮细胞平均占样本的80%，而CD10阳性基质细胞污染极少，为7.8%。接种四至六天后，分离的上皮细胞在二维培养物中形成贴壁鹅卵石样簇，确认上皮身份。免疫化学表明，大多数培养细胞表达EpCAM和PAX8，只有少数波形蛋白阳性细胞。培养物中存在纤毛细胞。