小鼠皮肤成纤维隔离用流式细胞仪

该程序的总体目标是使用 FACS 分离成纤维细胞，从而放弃体外培养，这已被证明会导致这些细胞的表型变化。这种方法可以帮助回答发育生物学和伤口愈合中的关键问题，例如如何识别与瘢痕形成和纤维化有关的成纤维细胞亚型。该技术的主要优点是避免了体外实验，因为粘附于塑料，男性粘附于成纤维细胞的表型。

这种方法不仅可以提供对真皮成纤维细胞的见解，还可以应用于其他系统，例如腹膜成纤维细胞和腹部粘连。首先剃除和脱毛感兴趣的小鼠的背皮。然后，将裸露的小鼠浸入 70% 乙醇中，并将动物放在干净、无菌的表面上晾干。

接下来，从尾巴的底部开始，用镊子将皮肤覆盖起来，然后用解剖剪刀进行横向切割。然后，沿筋膜上平面解剖以收获背组织。去除一块 60 x 100 毫米的皮肤后，使用手术刀的钝边小心去除任何皮下脂肪。

然后，用 betadine 冲洗收获的皮肤，然后在冰上清洗五次 PBS。使用剃须刀片和解剖剪刀，在无菌培养皿中将真皮块切碎，直到样品均匀地达到大约 2 到 3 毫米的大小。然后，将最多 5 只小鼠的组织片段转移到适当数量的 50 毫升锥形管中，其中含有 20 毫升 DMEM 中的胶原酶 4

在 37 摄氏度下剧烈搅拌样品。一小时后，将试管转移到无菌罩中，将组织流经不需要的 10 毫升注射器 3 到 5 次。将样品放回摇床中再放置 30 分钟，然后用 10 mL 注射器再移入 3 至 5 支移液管。

然后，通过 100 微米过滤器将样品过滤到新的 50 毫升试管中，并用 20 毫升 DMEM 清洗网片，并补充 FBS，使总体积达到 40 毫升。接下来，旋转细胞并使用无菌玻璃移液器吸出上层脂肪。去除污染的脂肪部位后，使用新的玻璃移液管去除剩余的上清液，并将沉淀重悬于 20 毫升 dmem 加 FBS 中。

现在，通过 75 微米过滤器过滤细胞，并用 10 毫升 dmem 加 FBS 冲洗网片。然后，再次旋转细胞并去除脂肪和上清液，如刚才所示。将沉淀重悬于 20 ml FACS 缓冲液中，留出 5 mL 等分试样用于未染色的对照。

然后，离心剩余的样品，弃去上清液，将沉淀置于冰上。为了通过 FACS 分离成纤维细胞，将沉淀重悬于 500 μL 冰上的谱系抗体孵育混合物中。20 分钟后，将 5 毫升补充有 DNase 的 FACS 缓冲液与细胞轻轻混合，然后离心。

在第二个 5 ml DNase 中洗涤沉淀。然后，将细胞重悬于 500 μL 的 FACS 缓冲液和 DNase 中，保留 50 μL 等分试样的细胞用于活力染料对照。最后，将活力染料添加到剩余的样品中，并根据图对细胞进行分类。

使用谱系负耗竭方法而不是正选择方法可避免对特定亚群进行预选。拉动转录组微阵列分析显示，通过活收获和组织外植体方法分离的培养成纤维细胞在转录组宽水平上具有高度相似性，Pearson 乘积矩相关系数为 0.92。相比之下，培养的成纤维细胞与活收获的未培养成纤维细胞显著不同，这确立了分析活收获的成纤维细胞优于培养的成纤维细胞的重要性。

开发后，这项技术为发育生物学和伤口愈合领域的研究人员铺平了道路，以确认成纤维细胞的异质性并识别导致瘢痕形成和其他形式纤维化的亚群。