Name: 小鼠皮肤成纤维隔离用流式细胞仪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T10:00:01.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: 了解如何使用流式细胞仪直接从小鼠皮肤中分离成纤维细胞，无需体外培养即可保留细胞天然表型。该方法适用于发育生物学和伤口愈合研究，有助于识别参与瘢痕形成的成纤维细胞亚型。

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM087609 基金（授予 H.P.L.）、Ingrid Lai 与 Bill Shu 为纪念 Anthony Shu 捐赠的礼物基金（授予 H.P.L.）、NIH U01 HL099776 基金（授予 M.T.L.）、Hagey 儿科再生医学实验室以及 Oak 基金会（授予 M.T.L.、G.C.G. 和 H.P.L.）的支持。G.G.W. 得到了斯坦福医学院、斯坦福医学科学家培训项目以及 NIGMS 培训基金 GM07365 的支持。Z.N.M. 得到了整形外科基金会研究奖学金以及 Hagey 家族基金的支持。M.S.H. 得到了加州再生医学研究所（CIRM）临床研究员培训基金 TG2-01159、美国颌面外科医师学会（ASMS）/颌面外科医师基金会（MSF）研究基金奖以及移植与组织工程研究员奖的支持。

本方案遵循斯坦福大学实验动物护理与使用管理委员会批准的方法。
1. 小鼠真皮的消化
<ol>
	<li>使用腹腔注射氯胺酮 100 mg/kg + 赛拉嗪 20 mg/kg + 乙酰丙嗪 3 mg/kg 进行麻醉后，通过颈椎脱位法处死小鼠。 
	注意：可使用不同年龄和遗传背景的小鼠。</li>
	<li>剃除并脱去背部皮肤的毛发。从一块约 60 mm × 100 mm 的背部皮肤中可分离出约 100,000 个细胞。</li>
	<li>将小鼠浸入 70% 乙醇中，并置于洁净无菌的表面上晾干。</li>
	<li>立即使用无菌解剖剪取下小鼠背部皮肤。在雌性小鼠中，避免包含乳腺组织。</li>
	<li>从尾部基部开始，用镊子提起皮肤，并做一横向切口，随后沿筋膜上平面进行解剖。</li>
	<li>在取材过程中应小心避免带入任何皮下脂肪。检查所获取的皮肤组织，若存在皮下脂肪，使用手术刀钝边小心刮除。</li>
	<li>将取下的皮肤用聚维酮碘冲洗，随后在冰上用 PBS 洗涤 5 次。 
	注意：应尽可能保持皮肤无菌，以避免污染。</li>
	<li>在无菌培养皿中使用剃刀片和解剖剪将皮肤组织切碎，直至样品成为大小均匀的 2–3 mm 碎块。</li>
	<li>准备 50 ml 锥形管，每管加入 20 ml 胶原酶 IV（溶于 DMEM，浓度为 1 mg/ml）。根据每管对应五只小鼠的比例将真皮组织分装入管中。</li>
	<li>在 37 °C 条件下于水浴或培养箱中孵育 1 小时，期间剧烈振荡样品。</li>
	<li>从培养箱中取出样品，在无菌操作台中使用无针头的 10 ml 注射器反复吹打 3–5 次。</li>
	<li>将样品重新放回 37 °C 培养箱中，剧烈震荡继续孵育 30 分钟。</li>
	<li>在无菌操作台中，使用 10 ml 移液器将样品上下吹打 3–5 次。随后将样品通过 100 µm 滤网转移至新的 50 ml 锥形管中。</li>
	<li>用 20 ml 含 10% FBS 的 DMEM 冲洗同一滤网，以最大化细胞得率，并使总体积达到 40 ml。在 4 °C 条件下以 300 g 离心 8 分钟。</li>
	<li>使用无菌玻璃移液器去除上清液，操作时需特别注意先去除上层脂肪层，再移除剩余上清液。 
	注意：此步骤对减少脂肪细胞污染至关重要。</li>
	<li>将沉淀物重悬于 20 ml 含 10% FBS 的 DMEM 中。</li>
	<li>将细胞/DMEM 悬液通过 70 µm 滤网过滤。</li>
	<li>用 10 ml 含 10% FBS 的 DMEM 冲洗滤网，并将滤过液在 4 °C 条件下以 300 g 离心 8 分钟。</li>
	<li>使用无菌玻璃移液器去除上清液，再次注意先去除任何残留的脂肪层。</li>
	<li>若存在明显红细胞污染（沉淀物呈明显红色），将沉淀物重悬于 20 ml ACK 裂解缓冲液中，在室温下孵育 5 分钟。否则跳至第 24 步。</li>
	<li>加入等体积（20 ml）FACS 缓冲液（PBS、10% FBS、0.1% 叠氮化钠），混匀后保留 5 ml 作为未染色对照。将剩余样品在 4 °C 条件下以 300 g 离心 8 分钟。</li>
	<li>去除上清液，将沉淀物置于冰上。若流式细胞术检测时间未定，此时可将细胞冻存。</li>
</ol>
2. 通过FACS分离成纤维细胞
<ol>
	<li>为每个沉淀物制备500 µl谱系抗体孵育混合液。先向离心管中加入含DNase（10 µg/ml）的475 µl FACS缓冲液，然后依次加入荧光素标记的CD31抗体（1:100）、CD45抗体（1:200）、Tie2抗体（1:50）、Ter-119抗体（1:200）和EpCAM抗体（1:100），使每种抗体达到相应稀释比例。</li>
	<li>将每个沉淀物重悬于500 µl谱系抗体孵育混合液中，冰上孵育20分钟。</li>
	<li>向样品中加入5 ml含DNase（10 µg/ml）的FACS缓冲液，轻轻混匀。在4 °C下以300 g离心8分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用5 ml含DNase（10 µg/ml）的FACS缓冲液洗涤细胞沉淀，并在与步骤26相同的条件下离心。</li>
	<li>将沉淀物重悬于500 µl含DNase（10 µg/ml）的FACS缓冲液中，从中取出50 µl作为活力染料对照样品备用。</li>
	<li>按照所选活力染料的推荐浓度，将其加入剩余样品中。</li>
	<li>进行FACS分析31，分选活力染料阴性/CD31阴性/CD45阴性/Tie2阴性/Ter-119阴性/EpCAM阴性细胞（见图2A），直接分选至FACS缓冲液中。</li>
</ol>

<ol><li>Sorrell, J. M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts-a+diverse+population+at+the+center+of+it+all%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts-a diverse population at the center of it all.</a> International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).</li>
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<li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature protocols. 3, 799-810 (2008).</li>
<li>Klein, M., Fitzgerald, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+separation+of+intact+epidermal+sheets+from+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin.</a> The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).</li>
<li>Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((yThree+blocks+are+not+enough+-+Blocking+of+the+murine+IgG+receptor+FcgammaRIV+is+crucial+for+proper+characterization+of+cells+by+FACS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">yThree blocks are not enough - Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis.</a> European journal of immunology. , (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本论文所述方案提供了一种基于流式细胞术分选分离成纤维细胞的方法，与现有方法相比，该方法无需选择特定亚群，也无需在后续分析前进行细胞培养。从皮肤收获到成纤维细胞分选完成所需时间约为6小时；然而，收获过程中使用的小鼠数量会影响这一时间估算。
在实验方案中有几个关键点需要特别注意。首先是限制脂肪细胞的污染，需在消化前去除皮肤中的脂肪组织，并在消化及离心后的分离过程中去除上清液中的上层脂质层。此外，在细胞沉淀后更换为新的离心管可能也有帮助，因为部分脂类成分会黏附在离心管的塑料管壁上，可能导致后续洗涤步骤中产生污染。第二个要点是在表皮-真皮连接处仔细分离真皮与表皮。尽管污染的表皮细胞可通过FACS耗竭策略予以去除，但仍应尽可能在此步骤中减少污染。
该方法的局限性包括当前谱系抗体组合可能无法完全排除污染性细胞的存在。在选择与谱系抗体（CD31、CD45、Tie2、Ter119、EpCAM）偶联的荧光素时，研究人员必须充分考虑可能需要进行的其他表面标志物分析。额外的染色所用荧光染料必须与所选谱系抗体的荧光素处于不同的检测通...

成纤维细胞通常根据形态被定义为梭形且能够黏附于塑料基质的细胞。成纤维细胞是胚胎和成体器官中负责合成和重塑细胞外基质的主要细胞类型1。因此，成纤维细胞对哺乳动物的发育至关重要，并显著影响各组织和器官中邻近细胞类型的微环境及其行为。
成纤维细胞也是多种疾病状态的主要细胞类型，这些疾病造成了巨大的临床负担。成纤维细胞的病理性活动会损害正常组织功能，包括组织和器官纤维化（如肺和肝纤维化）、皮肤创伤愈合后的瘢痕形成、动脉粥样硬化、系统性硬化症以及血管损伤后动脉粥样斑块的形成2-5。尤其是创伤愈合过程，无论急性或慢性，均涉及瘢痕组织的沉积，这种组织在结构和功能上均不同于周围的正常组织，并在多种病理状态下导致显著的疾病负担。损伤后，成纤维细胞会转化为肌成纤维细胞，后者分泌结构性细胞外基质（ECM）成分，对邻近细胞类型产生旁分泌效应，并通过沉积瘢痕组织来恢复机械稳定性6。
在皮肤组织中，伤口修复的质量在不同发育阶段以及不同解剖部位之间存在显著差异。生命前两个孕期的胎儿能够实现无瘢痕愈合；然而，从第三个孕期开始直至成年，人类的伤口愈合均会形成瘢痕。此外，伤口愈合还存在部位特异性和年龄特异性的差异。口腔内的伤口可发生重塑，几乎不形成瘢痕7,8，而皮肤伤口中的瘢痕组织沉积则十分明显9。关于微环境与局部成纤维细胞的内在特性在年龄和部位相关伤口愈合结果中各自所起作用的相对重要性，目前仍存在争议10,11。鉴于小鼠口腔真皮与皮肤真皮之间，以及早期胚胎（E15）与晚期胚胎（E18）真皮在愈合能力上的显著差异，可以推断在特定发育阶段及不同解剖部位的成纤维细胞群体之间，确实存在内在差异。
1986年，Harold F. Dvorak 提出肿瘤是无法愈合的伤口12。Dvorak 得出结论，肿瘤在体内表现类似于伤口，并通过激活宿主的伤口愈合反应来诱导其间质的形成。此后，大量研究探讨了成纤维细胞在癌进展中的作用13-15，但与伤口愈合类似，对皮肤癌间质区室中贡献成纤维细胞的身份及其胚胎起源仍未得到充分界定。鉴于近期研究揭示肿瘤相关成纤维细胞可能是抗癌治疗的有效靶点，这一问题的答案具有重要的医学意义16。
鉴定并前瞻性分离具有成纤维潜能的成纤维细胞谱系 体内 是有效调控其在多种急性和慢性疾病状态下对损伤反应的关键步骤。1987年，Cormack鉴定出成纤维细胞的两个亚群，其中一个位于乳头层真皮，另一个位于网状层真皮。17,18第三个亚群被发现位于毛囊的毛乳头区域，与毛囊相关联。19,20在培养条件下，这些成纤维细胞亚型在增殖能力、形态学特征以及生长因子/细胞因子表达谱方面均表现出差异。21-24.
迄今为止，针对成纤维细胞异质性的研究在充分表征成纤维细胞间的发育及功能多样性方面仍 largely未能取得理想进展 体内这在一定程度上是由于依赖培养的成纤维细胞群体，以及细胞培养过程或基于某些成纤维细胞并不普遍表达的自身表面受体进行阳性筛选所带来的均质化效应25最近，本实验室的一项研究证明，采用本文所述基于FACS的分离方法所获得的培养与未培养成纤维细胞在表面标志物和转录水平上存在显著差异。26.
随后，我们在小鼠背部真皮中鉴定出一种特定的成纤维细胞谱系，并确定该谱系由胚胎期Engrailed-1基因的表达所定义，主要负责背部皮肤结缔组织的沉积。该谱系在急性与慢性纤维化过程中均发挥功能，包括伤口愈合、肿瘤间质形成以及辐射诱导的纤维化27。对不同成纤维细胞谱系的特征进行表征，对于旨在调控纤维生成行为的治疗策略具有重要意义。
而不是使用依赖于现有方案的方法 体外 操作以实现细胞分离28,29，收获方案（图1）在此详细描述的方法将有助于获得更具信息量的成纤维细胞分析结果，更准确地反映其表型与行为特征 体内.

<table><tbody><tr><td>手术镊</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650916</td><td></td></tr><tr><td>微型剪刀</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600127</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘消毒液</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Nair（脱毛霜）</td><td>Church and Dwight Co.</td><td>22600267058</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>弹性蛋白酶</td><td>Abcam</td><td>ab95133</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BioLegend</td><td>102421</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103125</td><td></td></tr><tr><td>Tie2</td><td>BioLegend</td><td>124005</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>116233</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (CD326)</td><td>eBioscience</td><td>48-5791</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶（PI 活性染色）</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td></td></tr></tbody></table>

通过facs分离小鼠皮肤成纤维细胞

 Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

成纤维细胞是分泌细胞外基质的主要细胞类型，也是多种器官和组织的关键组成部分。成纤维细胞的生理与病理过程涉及一系列临床疾病，包括多器官纤维化、烧伤后增生性瘢痕、缺血后心脏功能丧失以及肿瘤间质的形成。然而，成纤维细胞仍是一种特征尚不明确的细胞类型，这主要归因于其内在的异质性。现有的成纤维细胞分离方法需要进行细胞培养，而培养过程会显著影响细胞的表型和行为。因此，许多研究成纤维细胞生物学的工作依赖于 体外 操作无法准确反映成纤维细胞的行为 体内为解决这一问题，我们开发了一种基于流式细胞分选（FACS）的方法，用于从成年小鼠背部皮肤中分离成纤维细胞，该方法无需细胞培养，从而保留了单个细胞的生理转录组和蛋白质组特征。我们的策略通过谱系阴性门控（Lin⁻）排除非间充质来源的细胞，-而不是采用阳性筛选策略，以避免预先选择或富集表达特定表面标志物的成纤维细胞亚群，并尽可能涵盖这种异质性细胞类型的多样性。

该方法的有效性（图1已通过多种方式验证，详细内容可参见我们近期的出版物27包括对分选细胞进行免疫细胞化学检测，以及对新鲜分选的大量细胞和单细胞进行转录组分析。直接分选成纤维细胞而非依赖培养，能更准确地捕获其 体内 表型。采用谱系阴性耗竭法（图2A）而非采用阳性筛选方法，可避免对特定亚群进行预先筛选。该方法的价值最近由 Rinkevich 所证实 等27，鉴定出位于真皮层先前未被描述水平的CD26阳性成纤维细胞的存在。
为了证实成纤维细胞培养过程会导致基因表达发生显著变化，我们采用微阵列技术对培养的成纤维细胞与未培养的成纤维细胞进行了比较。我们对通过两种方法分离的成纤维细胞进行了培养：一种是本文详细描述的活体收获法，另一种是已知的组织块培养法28。全转录组微阵列分析显示，通过活体收获法（C.LH）和组织块培养法（C.TE）分离的培养成纤维细胞在全转录组水平上具有高度相似性，其皮尔逊积矩相关系数（r）为0.92（图2B）。相比之下，培养的成纤维细胞与通过活体收获法获得...

成纤维细胞的行为涉及一系列临床疾病实体，但由于其内在的异质性，这些行为仍缺乏充分表征。传统的成纤维细胞研究依赖于体外（in vitro）操作，掩盖了其在体（in vivo）的真实行为。本文介绍一种基于流式细胞分选（FACS）的小鼠皮肤成纤维细胞分离方案，该方法无需进行细胞培养。

通过FACS分离小鼠皮肤成纤维细胞

成纤维细胞是负责分泌细胞外基质的主要细胞类型，也是多种器官和组织的关键组成部分。成纤维细胞……

本实验的总体目标是通过流式细胞分选（FACS）分离成纤维细胞，从而避免体外培养，因为已发现体外培养会导致这些细胞发生表型改变。该方法有助于回答发育生物学和伤口愈合领域中的关键问题，例如如何鉴定参与瘢痕形成和纤维化的成纤维细胞亚型。该技术的主要优势在于避免了体外实验，因为细胞在塑料表面的贴壁生长会改变成纤维细胞的表型。该方法不仅能为真皮成纤维细胞提供研究视角，还可应用于其他系统，如腹膜成纤维细胞和腹部粘连。首先剃除目标小鼠的背部毛发并进行脱毛处理。然后将脱毛后的小鼠浸入70%乙醇中，再将其置于洁净无菌的表面上晾干。接下来，从尾部基部开始，用镊子提起皮肤，使用解剖剪进行横向剪切。然后沿筋膜上层分离，以获取背部组织。当取下一块 60 乘以 100 毫米的皮肤后，用解剖刀的钝边小心去除任何皮下脂肪。随后，用碘伏冲洗收获的皮肤，再在冰上用 PBS 洗涤五次。使用剃须刀片和解剖剪，在无菌培养皿中将真皮组织剪碎，直至样品大小均匀，约为 2 至 3 毫米。然后，将最多五只小鼠的组织碎片转移至相应数量的 50 毫升锥形管中，每管含有 20 毫升含胶原酶 4 的 dmem 培养基。在37摄氏度下剧烈振荡样品。一小时后，将试管转移至无菌操作台，用无针头的10毫升注射器将组织悬液反复吹打三至五次。将样品重新放回摇床继续孵育30分钟，随后再次用10毫升注射器吹打三至五次。然后，将样品通过一个100微米的滤网过滤至一个新的50毫升离心管中，并用20毫升添加了胎牛血清（FBS）的DMEM洗涤滤网，使总体积达到40毫升。接着，离心收集细胞，并使用无菌玻璃移液管吸除上层脂肪层。在去除污染的脂肪组织后，使用新的玻璃移液管移除剩余的上清液，并将沉淀物重悬于20毫升含FBS的DMEM中。接下来，用75微米的细胞筛过滤细胞，并用10毫升含FBS的DMEM冲洗滤网。然后再次离心细胞，去除脂肪和上清液，操作方法如前所述。将细胞沉淀重悬于20毫升FACS缓冲液中，并预留5毫升等分试样作为未染色对照。随后，将剩余样品离心，弃去上清液，并将沉淀置于冰上。为通过FACS分离成纤维细胞，将沉淀在冰上用500 µL谱系抗体孵育混合液重悬。孵育20分钟后，轻轻混入5 mL FACS缓冲液（含DNase），与细胞混匀后离心沉淀。用5毫升DNase再次洗涤沉淀。然后，将细胞重悬于500微升FACS缓冲液和DNase中，并保留50微升细胞用于活率染料对照。最后，向剩余样品中加入活率染料，并根据示意图对细胞进行分选。采用阴性富集去除非目标细胞的方法，而非阳性选择方法，可避免对特定亚群进行预先筛选。全基因组转录谱微阵列分析显示，通过活细胞收获法和组织块培养法分离得到的培养成纤维细胞，在转录组水平上具有高度相似性，其皮尔逊积矩相关系数达0.92。相比之下，培养的成纤维细胞与未经培养的活细胞收获成纤维细胞之间存在显著差异，这表明分析活细胞收获的成纤维细胞比培养后的细胞更为重要。该技术问世后，为发育生物学和伤口愈合领域的研究人员提供了途径，以证实成纤维细胞的异质性，并鉴定出负责瘢痕形成及其他类型纤维化的亚群。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

小鼠皮肤成纤维隔离用流式细胞仪

癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过促进细胞增殖、血管生成和炎症的信号通路，促进肿瘤的发生、生长和进展。本文介绍一种利用细胞分选技术，以PDGFRα作为表面标志物，从新鲜的小鼠和人类组织中分离出纯化的正常成纤维细胞和CAFs群体的方法。...

通过荧光激活细胞分选（FACS）从新鲜组织中分离正常成纤维细胞和癌相关成纤维细胞

本视频介绍了一种从新生小鼠皮肤中快速分离并同时培养黑素细胞和成纤维细胞的方法。这些细胞可被长期维持并进行实验操作 体外...

快速培养原代小鼠黑素细胞和成纤维细胞：从小鼠全皮组织样本中分离黑素细胞和成纤维细胞

研究成体干细胞生物学的理想模型是小鼠毛囊。本文介绍了一种分离不同群体毛囊干细胞和表皮角质形成细胞的方案，该方法包括对小鼠背部皮肤进行酶消化处理，随后进行流式细胞术分析。...

从背侧小鼠皮肤中分离毛囊干细胞与表皮角质形成细胞

本文描述了一种基于流式细胞术（FACS）的方案，用于从人皮肤中分离乳头层和网状层成纤维细胞。该方法避免了传统通过组织块培养进行细胞分离时不可避免的体外培养过程。所获得的成纤维细胞亚群在功能上具有差异，并在真皮层内表现出不同的基因表达模式和空间定位。...

通过荧光激活细胞分选法从人皮肤中分离乳头层和网状层成纤维细胞

本方案概述了一种快速方法，可从出生0至4天的小鼠皮肤中同时建立黑色素细胞和成纤维细胞培养物。这些原代培养物可在体外进行维持和操作，用于研究多种生理相关过程，包括皮肤细胞生物学、色素沉着、伤口愈合以及黑色素瘤。...

快速建立原代小鼠黑色素细胞和成纤维细胞培养

我们介绍一种简单、快速且可靠的原代成年成纤维细胞分离方案，初学者（例如学生）也可操作。该方法结合了酶消化组织与超声波机械振荡，以获取原代成纤维细胞。本方案可轻松根据特定实验需求进行调整（例如用于人体组织）。...

超声增强的成年成人原代成纤维细胞分离

细胞重编程需要导入关键基因，这些基因调控并维持多能细胞状态。本方案描述了一种非病毒、非整合的方法，通过使用未修饰RNA（NM-RNA）并结合免疫逃逸因子以降低细胞防御机制，从而实现由人皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。...

从腹部皮肤分离成人人类真皮成纤维细胞及使用非整合方法生成诱导性多能干细胞

获得成纤维细胞的纯种群体对于研究其在伤口修复和纤维化中的作用至关重要。本文详细描述了一种从正常和损伤的小鼠心脏中分离成纤维细胞和肌成纤维细胞的方法，并通过免疫荧光、逆转录PCR（RTPCR）、荧光辅助细胞分选以及胶原凝胶收缩实验对细胞的纯度和功能特性进行表征。...

成年心脏成纤维细胞与肌成纤维细胞的分离与鉴定

本文介绍了一种基于组织块培养的方法，用于分离和培养原代的、患者特异性的许多人主动脉平滑肌细胞和皮肤成纤维细胞。此外，还提出了一种测量细胞收缩及进行后续分析的新方法，可用于研究这些细胞在不同患者间的特异性差异。...

分离患者特异性原代主动脉平滑肌细胞及半定量实时收缩测量 体外

本文介绍了一种基于磁珠分离小鼠皮肤淋巴毛细血管内皮细胞的方法。所分离的淋巴内皮细胞可用于后续实验 体外 实验和蛋白质表达分析...

小鼠皮肤淋巴管内皮细胞的分离

本方案描述了一种优化的分离老龄小鼠泪腺以获取可用于单细胞RNA测序的活单细胞的方法。通过依次进行酶消化并配合轻柔操作，可保持细胞完整性，获得高质量的单细胞悬液，适用于分离特定细胞类型，并对泪腺细胞群中与衰老相关的变化进行转录组学分析。...

从老年泪腺和唾液腺中分离肌上皮细胞与成纤维细胞的单细胞解离、RNA测序操作方案

了解如何使用流式细胞仪直接从小鼠皮肤中分离成纤维细胞，无需体外培养即可保留细胞天然表型。该方法适用于发育生物学和伤口愈合研究，有助于识别参与瘢痕形成的成纤维细胞亚型。

通过FACS分离小鼠皮肤成纤维细胞

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