包封狂犬病抗原的脉冲聚合物微粒的制备

这种方法的意义在于，它可用于单次注射多剂疫苗，有可能挽救数百万人的生命，特别是在新生儿因获取挑战而未接种疫苗的低收入和中等收入国家。这种制造方法允许狂犬病疫苗在封装在微粒中时保留其天然免疫力，微粒的释放模仿当前的疫苗接种计划，只需一次注射。狂犬病是一种致命的疾病，在某些情况下需要多达五次重复注射疫苗才能防止死亡。

然而，在一次就诊中实施完整的疫苗接种方案可以提高依从性并挽救生命。该技术代表了一种平台技术，能够为各种疾病提供多种疗法或预防措施。首先，通过将3D打印的母模表面放置在包含载玻片的真空室中来处理3D打印的母模表面，表面有40微升三氯氢硅。

开始吸尘一小时。将PDMS预聚物基料和固化剂以9:1的质量比混合到塑料杯中。然后，将溶液转移到50毫升管中，并在室温下离心300G三分钟。

离心后，确保溶液澄清。表面处理完成后，将母模放入铝箔盘中，将未固化的PDMS倒在模具上，确保特征完全浸没。将铝箔盘放入真空室中，拉动真空一小时以去除任何气泡。

取下铝箔培养皿后，在母模的每一端放置 800 微米的垫片，并将干净的载玻片覆盖在母模上，避免气泡。使用粘合剂夹将模具夹在 800 微米的垫片上。将预聚物在120摄氏度的烤箱中固化四个小时。

固化后，小心地松开粘合剂夹。使用剃须刀片将母模与固化的PDMS模具分离。为了制备PLGA薄膜，将450毫克PLGA放在环垫片内的不粘聚合物片上。

然后，在PLGA上覆盖第二块不粘聚合物板，并使用101.6毫米C形夹压缩两个铝块之间的堆栈，直到手指紧固。将 C 型夹紧组件放入真空烘箱中。在烤箱中放置 30 分钟后，拧紧夹子并将其放回原处 30 分钟。

然后，将组件转移到干燥器中冷却四个小时。冷却后，松开夹子，从不粘聚合物片上取下PLGA膜，然后将其放入标记的培养皿中。将培养皿储存在干燥器内以备后用。

要生成 PLGA 颗粒，请如前所述处理 PDMS 模具表面。使用镊子或手术刀，将250微米的PLGA薄膜切割成大约颗粒阵列的大小，并将其放在处理过的PDMS模具上。将干净的玻璃显微镜载玻片覆盖在PDMS模具顶部的PLGA胶片上，并通过在阵列和PLGA胶片上放置弹簧夹将它们固定在一起。

将夹紧的模具组件在真空烤箱中保持一小时，然后在室温下冷却 15 分钟。冷却后，使用剃须刀片轻轻施加压力，将PDMS模具与PLGA颗粒阵列分离，并将PLGA颗粒储存在干燥器中以备将来使用。为了用浓缩的狂犬病疫苗抗原填充颗粒，准备压电分配器并将含有PLGA颗粒的载玻片放入分配区域。

将浓缩的抗原加载到板上，然后输入目标设置参数并单击运行。然后压电机器人将填充颗粒。完成后，使用立体镜验证粒子是否已填充。

为了密封填充的颗粒，将不锈钢块放在热板上，将两个平行的显微镜载玻片放在不锈钢块上。调平不锈钢块后，打开热板并将温度设置为205摄氏度。一旦达到不锈钢所需的表面温度，将填充的PLGA颗粒悬浮在两个载玻片上，并立即启动计时器18秒。

从热板上取出密封的颗粒阵列后，将其悬挂在实验室工作台上的两个载玻片上并冷却一分钟。要收获密封的颗粒，请将手术刀刀片与载玻片成 45 度角，并对颗粒底部施加压力以将它们与载玻片分开。使用手术刀将收获的颗粒移动到0.5毫升低蛋白结合管中。

加入250微升含有牛血清白蛋白和葡萄糖的PBS，以维持狂犬病疫苗的稳定性 将样品放在立体镜下，并使用一对细尖镊子上的一个爪子粉碎颗粒。在颗粒填充过程中，需要足够的干燥时间才能完全蒸发溶剂或水。干燥后，溶质库保留在颗粒核心的底部。

在18至24秒的上限时间之间观察到颗粒的理想形态，因为含有货物的颗粒在这些时间是完全密封的，而不会失去颗粒结构。颗粒足够小，在正确包装和密封时可以轻松放入 19 号针中。此外，当将10个颗粒注入粘性溶液（例如2%羧甲基纤维素）中时，它们一致地流过19号针头。

透射电子显微照片显示浓缩抗原样品中存在完整的狂犬病变异，这些变异体的浓度约为起始储备溶液的 4.4 倍。密封后，大约69%的抗原仍以其生物活性形式包封，这表明热应激在密封过程中会导致显着损失，但大多数病毒抗原保持完整。微粒填充是最关键的步骤之一。

如果颗粒未正确填充，则颗粒不太可能正确密封。为了了解稳定性，需要额外的配方开发，包括颗粒核心中的赋形剂和其他生物相关材料。