包封狂犬病抗原的脉冲聚合物微粒的制备
2023年5月12日
该方法描述了将狂犬病抗原封装到具有结构和材料特性的可生物降解聚合物微粒中，这些微粒能够在预定延迟后实现脉动释放。对从颗粒核心回收的抗原进行酶联免疫吸附测定 （ELISA） 评估，通过颗粒制造证实存在完整的三聚体狂犬病病毒糖蛋白。
这种方法的意义在于，它可用于单次注射多剂疫苗，有可能挽救数百万人的生命，特别是在新生儿因获取挑战而未接种疫苗的低收入和中等收入国家。这种制造方法允许狂犬病疫苗在封装在微粒中时保留其天然免疫力，微粒的释放模仿当前的疫苗接种计划，只需一次注射。狂犬病是一种致命的疾病，在某些情况下需要多达五次重复注射疫苗才能防止死亡。
然而，在一次就诊中实施完整的疫苗接种方案可以提高依从性并挽救生命。该技术代表了一种平台技术，能够为各种疾病提供多种疗法或预防措施。首先，通过将3D打印的母模表面放置在包含载玻片的真空室中来处理3D打印的母模表面，表面有40微升三氯氢硅。
开始吸尘一小时。将PDMS预聚物基料和固化剂以9:1的质量比混合到塑料杯中。然后，将溶液转移到50毫升管中，并在室温下离心300G三分钟。
离心后，确保溶液澄清。表面处理完成后，将母模放入铝箔盘中，将未固化的PDMS倒在模具上，确保特征完全浸没。将铝箔盘放入真空室中，拉动真空一小时以去除任何气泡。
取下铝箔培养皿后，在母模的每一端放置 800 微米的垫片，并将干净的载玻片覆盖在母模上，避免气泡。使用粘合剂夹将模具夹在 800 微米的垫片上。将预聚物在120摄氏度的烤箱中固化四个小时。
固化后，小心地松开粘合剂夹。使用剃须刀片将母模与固化的PDMS模具分离。为了制备PLGA薄膜，将450毫克PLGA放在环垫片内的不粘聚合物片上。
然后，在PLGA上覆盖第二块不粘聚合物板，并使用101.6毫米C形夹压缩两个铝块之间的堆栈，直到手指紧固。将 C 型夹紧组件放入真空烘箱中。在烤箱中放置 30 分钟后，拧紧夹子并将其放回原处 30 分钟。
然后，将组件转移到干燥器中冷却四个小时。冷却后，松开夹子，从不粘聚合物片上取下PLGA膜，然后将其放入标记的培养皿中。将培养皿储存在干燥器内以备后用。
要生成 PLGA 颗粒，请如前所述处理 PDMS 模具表面。使用镊子或手术刀，将250微米的PLGA薄膜切割成大约颗粒阵列的大小，并将其放在处理过的PDMS模具上。将干净的玻璃显微镜载玻片覆盖在PDMS模具顶部的PLGA胶片上，并通过在阵列和PLGA胶片上放置弹簧夹将它们固定在一起。
将夹紧的模具组件在真空烤箱中保持一小时，然后在室温下冷却 15 分钟。冷却后，使用剃须刀片轻轻施加压力，将PDMS模具与PLGA颗粒阵列分离，并将PLGA颗粒储存在干燥器中以备将来使用。为了用浓缩的狂犬病疫苗抗原填充颗粒，准备压电分配器并将含有PLGA颗粒的载玻片放入分配区域。
将浓缩的抗原加载到板上，然后输入目标设置参数并单击运行。然后压电机器人将填充颗粒。完成后，使用立体镜验证粒子是否已填充。
为了密封填充的颗粒，将不锈钢块放在热板上，将两个平行的显微镜载玻片放在不锈钢块上。调平不锈钢块后，打开热板并将温度设置为205摄氏度。一旦达到不锈钢所需的表面温度，将填充的PLGA颗粒悬浮在两个载玻片上，并立即启动计时器18秒。
从热板上取出密封的颗粒阵列后，将其悬挂在实验室工作台上的两个载玻片上并冷却一分钟。要收获密封的颗粒，请将手术刀刀片与载玻片成 45 度角，并对颗粒底部施加压力以将它们与载玻片分开。使用手术刀将收获的颗粒移动到0.5毫升低蛋白结合管中。
加入250微升含有牛血清白蛋白和葡萄糖的PBS，以维持狂犬病疫苗的稳定性 将样品放在立体镜下，并使用一对细尖镊子上的一个爪子粉碎颗粒。在颗粒填充过程中，需要足够的干燥时间才能完全蒸发溶剂或水。干燥后，溶质库保留在颗粒核心的底部。
在18至24秒的上限时间之间观察到颗粒的理想形态，因为含有货物的颗粒在这些时间是完全密封的，而不会失去颗粒结构。颗粒足够小，在正确包装和密封时可以轻松放入 19 号针中。此外，当将10个颗粒注入粘性溶液（例如2%羧甲基纤维素）中时，它们一致地流过19号针头。
透射电子显微照片显示浓缩抗原样品中存在完整的狂犬病变异，这些变异体的浓度约为起始储备溶液的 4.4 倍。密封后，大约69%的抗原仍以其生物活性形式包封，这表明热应激在密封过程中会导致显着损失，但大多数病毒抗原保持完整。微粒填充是最关键的步骤之一。
如果颗粒未正确填充，则颗粒不太可能正确密封。为了了解稳定性，需要额外的配方开发，包括颗粒核心中的赋形剂和其他生物相关材料。
概述
该方法描述了将狂犬病抗原封装到可生物降解的聚合物微粒中，使其在预定的延迟后实现脉动释放。这种方法可以促进在单次注射中给予多剂量疫苗，从而改善低收入和中等收入国家的免疫接种情况。
关键研究组成部分
科学领域
- 疫苗递送系统
- 可生物降解聚合物
- 免疫学
背景
- 狂犬病是一种需要多次疫苗剂量的致命疾病。
- 当前的免疫接种计划可能会对遵守造成挑战。
- 封装技术可以增强疫苗的稳定性和递送效果。
- 单次注射解决方案可能会在服务不足的地区挽救生命。
研究目的
- 开发一种封装狂犬病疫苗抗原的方法。
- 创建一个模仿传统免疫接种计划的递送系统。
- 改善疫苗遵守情况和可及性。
使用的方法
- 制作用于微粒生产的PDMS模具。
- 准备用于抗原封装的PLGA薄膜和颗粒。
- 使用压电分配器填充颗粒中的疫苗。
- 密封并收集填充的微粒以进行稳定性测试。
主要结果
- 颗粒成功地被填充了狂犬病疫苗抗原。
- 封装后约有69%的抗原保持生物活性。
- 密封时间得到优化以维持颗粒的完整性。
- 微粒展示了适合通过标准针头注射的尺寸。
结论
- 该方法为疫苗递送提供了一个有前景的平台。
- 单次注射疫苗可以提高免疫接种率。
- 需要进一步的研究来探索该技术在其他治疗方法中的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Pulsatile polymeric microparticle encapsulation of rabies antigen enables single-injection vaccine regimens, addressing adherence and access barriers in resource-limited settings. This platform technology supports the delivery of immunogenic antigens with tunable release profiles, directly impacting vaccine pipeline efficiency and global health portfolios. The method's ability to preserve antigen integrity during fabrication is critical for predictive confidence in translational vaccine development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of antigen stability and immunogenicity under encapsulation stressors.
- Supports functional validation of antigen release kinetics for immune response modeling.
- Facilitates predictive assessment of formulation impact on antigen bioactivity.
Screening & Assay Development
- Provides standardized microparticle fabrication for reproducible vaccine delivery studies.
- Enables quantitative ELISA-based measurement of antigen recovery post-encapsulation.
- Supports scalability and platform reuse for diverse antigen candidates.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant vaccine delivery models for preclinical evaluation.
- Maintains continuity from antigen discovery through formulation optimization.
- De-risks advancement by demonstrating preserved antigenicity after processing.
Pipeline & Workflow Integration
This encapsulation method integrates from antigen discovery through preclinical formulation, supporting lead candidate selection and translational readiness.
- Discovery Biology: Confirms antigen integrity and immunogenicity post-encapsulation for hypothesis-driven vaccine design.
- Screening: Standardizes microparticle production and ELISA-based quantification for batch comparability.
- Analytics: Delivers quantitative recovery and bioactivity data to inform formulation decisions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by enabling single-injection regimens in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform adaptable to multiple vaccine and therapeutic payloads.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antigen stability and release kinetics.
- Operational Value: Standardizes encapsulation and assay workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions for vaccine candidates based on quantitative antigen recovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of single-injection vaccine platforms for global health impact.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polymer processing and microfabrication techniques.
- Demands access to piezoelectric dispensing and ELISA analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of fabrication and assay protocols.
- Adaptation to other antigens may require formulation optimization for stability.
- Heat sealing step may limit compatibility with highly heat-sensitive biomolecules.
