Name: 包封狂犬病抗原的脉冲聚合物微粒的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 了解使用PLGA微粒脉冲释放封装狂犬病抗原的方法，实现单次注射多剂量疫苗。该技术可提高疫苗依从性，为中低收入国家提供便捷的免疫接种方案。

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我们感谢Chiron Behring和Bharat Biotech International为“Particles for Humanity&#160;”提供了RABV抗原。我们还要感谢Charles Rupprecht兽医博士（VMD）、理学硕士（MS）、哲学博士（PhD.）提供的宝贵指导和技术支持。作者谨此感谢Rebecca Richards-Kortum博士慷慨允许使用其SciFLEXARRAYER S3皮升级点样装置，并感谢Chelsey Smith博士在设备使用方面的指导。我们同时感谢马萨诸塞大学陈医学院（University of Massachusetts Chan Medical School）协助获取狂犬病抗原的显微图像。&#160;最后，我们感谢Don Chickering和Erin Euliano在稿件提交前的审阅。本研究工作得到了比尔及梅琳达·盖茨基金会（Bill and Melinda Gates Foundation）资助项目（编号：INV-004360）的支持。

1. 颗粒主模具的制备
注意：3D 打印过程可使用任何具有足够空间分辨率的 3D 打印机进行；然而，本方案描述的是多光子 3D 打印机的操作流程。
<ol>
	<li>使用计算机辅助设计（CAD）软件设计微颗粒结构。 
	注意：设计参数如下：308个颗粒（直径 = 400 µm，高度 = 500 µm，壁厚 = 100 µm）排列成22 × 14的阵列，颗粒间距为600 µm。设计中还在阵列外侧紧邻位置包含一个四角星和一个五角星作为定位标记（补充图1）。</li>
	<li>将最终设计导出为STL文件（补充代码文件1），并上传至可定义打印参数的软件中（如下所示），然后保存为与3D打印机兼容的文件格式（见材料表）。 
	注意：切片间距 = 5 µm，扫描线间距 = 1 µm，壳层轮廓 = 50 µm，基底层切片数 = 5 µm，支撑结构 = 空心，扫描模式 = 振镜，Z轴 = 显微镜Z驱动，扫描速度 = 100,000，功率 = 100。</li>
	<li>对硅打印基底（见材料表）进行等离子清洗预处理（气体：O2；功率：200瓦；温度：25 °C；流量：20；时间：5分钟），随后立即将基底浸入含有30 mL乙醇和60 µL 3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯的玻璃培养皿溶液中，用铝箔覆盖，并在室温下孵育过夜。 
	注意：此步骤可增强打印物在基底上的附着力，对后续PDMS分离（步骤2.6）至关重要。</li>
	<li>将打印文件上传至多光子3D打印机，将打印树脂涂布于处理过的基底上，安装10倍物镜（见材料表），然后开始打印微结构。</li>
	<li>打印完成后，将样品浸入丙二醇甲醚醋酸酯（见材料表）中45分钟，以去除未曝光的光刻胶，随后将样品浸入异丙醇中5分钟。将母模置于254 nm紫外光下照射120分钟进行后固化处理。 
	&#8203;注意：如有条件，可使用365至405 nm波长范围的紫外光照射约20分钟，对打印结构进行后固化。</li>
</ol>
2. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具制备
<ol>
	<li>将3D打印的母模表面进行处理：将其放入真空腔室中，腔室内放置一个玻璃载片，载片表面加入40 µL三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷（见材料表）。抽真空（相对压力：-20 in.Hg）持续1小时。 
	注：此步骤可确保脱模时（步骤2.6）易于分离。</li>
	<li>在处理母模表面的同时，按9:1的质量比将聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物基础剂与PDMS预聚物固化剂充分混合（每个母模至少需要10 g材料）。混合均匀后，将未固化的PDMS转移至50 mL离心管中，在室温下以300 × g离心3分钟。</li>
	<li>表面处理完成后，将母模放入铝箔皿中，并将未固化的PDMS倒在母模上，确保所有结构特征完全浸没。将铝箔皿放入真空腔室，抽真空（相对压力：-20 in.Hg）1小时，以去除气泡。</li>
	<li>从真空腔室中取出铝箔皿。在母模两端放置800 µm的间隔片，并将一块洁净的玻璃载片覆盖在母模上，注意避免引入气泡。使用文件夹夹子将模具和载片夹紧，使夹紧力集中在间隔片上（补充图2）。</li>
	<li>将该结构置于设定为120 °C的烘箱中，加热至少4小时，使预聚物固化成PDMS模具。</li>
	<li>从烘箱中取出结构，小心松开夹子，并使用刀片小心地将母模与固化的PDMS模具分离。 
	&#8203;注：3D打印的母模可重复使用，用于制备更多的PDMS模具。</li>
</ol>
3. PLGA 薄膜制备
<ol>
	<li>称取 450 mg PLGA（参见材料表），置于内径为 50.8 mm、厚度为 250 µm 的环形垫片内的 76 mm × 76 mm 非粘性聚合物片上。将另一张非粘性聚合物片覆盖在 PLGA 上，并使用 101.6 mm C 型夹将整个夹层结构夹在两块铝块之间，拧紧至手指力度即可。 
	注意：本研究中 exclusively 使用 502H 型 PLGA；但其他类型的 PLGA 也适用于此工艺。</li>
	<li>将 C 型夹组装件放入设定为 120 °C 的真空烘箱中，在相对压力为 -30 in.Hg 的真空条件下加热 30 分钟。随后取出组装件，将夹具彻底拧紧后，重新放回真空烘箱中继续处理 30 分钟。 
	注意：使用真空的主要目的是避免 PLGA 在高温下发生降解，高温会加速其降解过程。</li>
	<li>从烘箱中取出组装件，在干燥器中冷却 4 小时。</li>
	<li>冷却后，松开夹具，将 PLGA 薄膜从非粘性聚合物片上取下，放入已标记的培养皿中。将培养皿存放在干燥器内，以备后续使用。</li>
</ol>
4. PLGA 微粒的制备
<ol>
	<li>按照之前步骤 2.1 中所述方法处理 PDMS 模具的表面。</li>
	<li>使用镊子和/或解剖刀，从 250 µm 厚的 PLGA 薄膜上切割出与阵列大小相近的一块，并将其放置在已处理的 PDMS 模具上。</li>
	<li>将一块洁净的玻璃显微镜载玻片覆盖在 PLGA 薄膜和 PDMS 模具上方，并通过在阵列和 PLGA 薄膜正上方放置弹簧夹具将各组件夹紧。</li>
	<li>将夹紧的模具组件放入设定为 120 °C 的真空烘箱中，抽真空至相对压力为 -30 in.Hg，持续 1 小时。 
	注意：形成微粒所需的时间取决于 PLGA 材料，可能在 1–12 小时之间变化。</li>
	<li>从烘箱中取出夹紧的模具组件，于室温下静置冷却约 15 分钟，或直至触摸时不再发热。</li>
	<li>使用剃刀刀片轻轻在 PDMS 模具与 PLGA 微粒阵列之间施加压力，使其分离。将 PLGA 微粒存放在干燥器中以备后续使用。</li>
</ol>
5. 抗原浓度测定与纯化
<ol>
	<li>在室温下解冻一份市售的狂犬病病毒（RABV）抗原（参见材料表）。</li>
	<li>将两个截留分子量为100 kDa的离心式滤膜（MWCO；参见材料表）放入两个收集管中，组装过滤装置。</li>
	<li>向每个离心式滤膜的上层加入500 µL UltraPure水，进行预润湿。</li>
	<li>在室温下，使用台式离心机以2,400 x g离心1分钟。</li>
	<li>使用200 µL移液器从过滤装置的上层和下层收集管中移除水分。 
	注意：请勿让预润湿的滤膜干燥。</li>
	<li>向每个滤膜的上层加入400 µL蒸馏水，然后加入100 µL已解冻的RABV抗原，并用移液器混匀。 
	注意：本研究将抗原浓缩约5倍，并将分子量&#60;100 kDa的辅料浓度降低约50倍。</li>
	<li>将两个离心式滤膜装入台式离心机，确保滤膜朝向离心机中心。标记滤膜朝向离心机中心的一侧。 
	注意：若方向错误，溶液将无法被正确过滤或浓缩。</li>
	<li>在室温下以14,000 x g离心10分钟。</li>
	<li>从离心机中取出滤膜装置。收集管中为滤过液，而滤膜中则含有浓缩后的样品（补充图3A）。</li>
	<li>使用移液器移除收集管中的滤过液并弃去。</li>
	<li>向每个滤膜中加入450 µL过滤后的蒸馏水，通过上下吹打6次混匀浓缩样品与水。</li>
	<li>第二次以14,000 x g在室温下离心10分钟。确保滤膜朝向与步骤5.7中一致。</li>
	<li>从离心机中取出滤膜单元，同前使用移液器移除并弃去各收集管中的滤过液。</li>
	<li>将滤膜从收集管中取出，并使用收集管的上盖盖紧滤膜外壳（补充图3B）。</li>
	<li>将滤膜外壳底部直接置于涡旋振荡器上，在保持滤膜直立及45°倾斜的状态下以3,000 rpm涡旋30秒（补充图3C）。 
	注意：此步骤旨在重悬在离心过程中可能形成的RABV抗原沉淀。</li>
	<li>小心取下收集管盖，将滤膜外壳重新放回原收集管中，并进行短暂离心（2–3秒）以回收可能滞留在盖内的液体。 
	注意：该短暂离心必须在台式微量离心机中进行，滤膜应与转轴呈切线方向，与之前方向相反，以确保溶液不会穿过滤膜丢失。</li>
	<li>将每个滤膜单元倒置插入滤膜试剂盒提供的新收集管中（参见材料表），在室温下以1,000 x g离心2分钟，以收集浓缩样品。</li>
	<li>将两个收集管中的浓缩样品合并至一个收集管中。测量并记录最终体积。 
	注意：所得样品的抗原浓度约为原始储备液的5倍，辅料（&#60;100 kDa）浓度约为原始储备液的1/50，外观呈轻微乳白色。总体积应约为44–48 µL。</li>
	<li>将经过两次洗涤并浓缩5倍的抗原在4 °C保存至分装前，但保存时间不得超过16小时。在将该溶液填充至颗粒前，需以1,000 x g离心1分钟以去除气泡。可根据需要使用蒸馏水稀释，以达到目标分装浓度。</li>
</ol>
6. 颗粒填充
<ol>
	<li>通过0.22 µm真空滤器对500 mL去离子水进行真空过滤，然后在超声20分钟的同时施加真空（相对压力：-20 in.Hg）以脱气。</li>
	<li>在此期间，将压电分配毛细管（PDCs；参见材料表）连接到压电分配器上。</li>
	<li>根据制造商的说明对仪器进行预运行（参见材料表），并将载有PLGA微粒的载玻片放入分配区域。</li>
	<li>按照补充图4设置&#34;查找目标参考点&#34;和运行，然后设置&#34;目标基底&#34;。</li>
	<li>将25 µL浓缩抗原加入源板中，并将源板装入仪器。使用PDCs将10 µL浓缩抗原吸入分配针头，清洗针头外表面，然后校准分配对齐（补充图5）。</li>
	<li>输入&#34;目标设置参数&#34;，然后点击运行（补充图6）。</li>
	<li>完成后，取出已填充的微粒，并在体视显微镜下确认其填充情况。</li>
	<li>立即进入实验方案的下一步。</li>
</ol>
7. 颗粒封合与收获
<ol>
	<li>将一块不锈钢块（参见材料表）放置在加热板上。将两张显微镜载玻片平行地放在不锈钢块上。确保不锈钢块处于水平状态，然后打开加热板，调节温度使不锈钢表面温度达到 200 °C。封合前需确认加热板的温度。</li>
	<li>将装有内容物的 PLGA 微粒置于两张玻璃载玻片上，使其悬于加热板上方，随后立即启动计时器，持续 18 秒。 
	注：微粒所需封合的时间和热量取决于用于制备微粒的 PLGA 的化学性质。可使用定制的 3D 打印载玻片支架，以便在安全距离操作载玻片。STL 文件作为补充代码文件 2提供。</li>
	<li>封合完成后，将微粒阵列从加热板上取下，并将其放置在另外两张独立的玻璃载玻片上，使其悬于实验台上方。让微粒冷却 1 分钟。</li>
	<li>冷却后，可在体视显微镜下使用解剖刀收获微粒。持解剖刀时，使刀刃与载玻片成 45° 角，对微粒底部施加压力，使其从玻璃载玻片上分离。</li>
	<li>收获后，使用解剖刀将微粒转移至 0.5 mL 低蛋白吸附离心管中（参见材料表）。随后向管中加入 250 µL 含 30 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）和 1 mg/mL 葡萄糖的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）。 
	&#8203;注：在 PBS 中配制的含 30 mg/mL BSA 和 1 mg/mL 葡萄糖的溶液可维持 RABV 抗原的稳定性。</li>
	<li>在体视显微镜下使用精细尖头镊子压碎微粒。确保微粒核心中的 RABV 抗原能够溶解于周围溶液中。将样品储存于 4 °C 冰箱中，直至通过 ELISA 检测抗原效价。样品必须在制备后 7 天内完成 ELISA 检测。</li>
</ol>
8. 通过 ELISA 评估抗原
注意：切勿让微孔板在任何步骤中变干。始终将微孔板叠放，并始终用塑料封膜、空板或盖子覆盖最上方的板，以防止干燥。
<ol>
	<li>按照说明制备缓冲液 补充文件 1.</li>
	<li>将25 µL包被抗体加入4975 µL pH 9.4–9.6的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中，配制5 mL浓度为2.5 µg/mL的包被溶液（碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6）。 
	注意：每孔加入 50 µL，共包被 96 孔需 5 mL（额外体积用于弥补移液损耗）。每增加一块 ELISA 板，总体积增加 5 mL。</li>
	<li>使用多通道移液器将50 µL包被液加入微孔板的每个孔中。包被液配制后须立即用于包被。</li>
	<li>用戴着手套的手掌轻拍培养板边缘，确保每个孔的底部都被液体均匀覆盖。</li>
	<li>用封板膜密封培养板，37 °C孵育1小时，然后转移至4 °C过夜。</li>
	<li>从冷藏处取出培养板，每孔加入 200 µL 洗涤缓冲液，洗涤三次。</li>
	<li>吸除洗涤缓冲液，向每孔中加入 300 µL 封闭缓冲液。 
	警告：当在多个板上运行相同样本时，必须逐板操作（即先向第1块板加样，完成后再依次处理第2块、第3块等）。切勿先将试剂X加入所有板，再加入试剂Y，依此类推，因为这会增加孔内液体干燥的风险。在最后一次洗涤步骤后，洗涤缓冲液应保留在板的孔中，仅在即将向孔中添加样本前弃去。应使用塑料96孔板盖覆盖酶联免疫吸附试验（ELISA）板上暂时不加样的所有孔，并逐步移动板盖以暴露需加样的后续孔位。</li>
	<li>用粘性塑料封板膜密封培养板（参见 材料表）置于37 ± 2 °C培养箱中孵育60 ± 5分钟。</li>
	<li>在孵育期间，准备用于评估的标准曲线和待测样品。 
	注意：待检测的抗原必须用稀释缓冲液预先稀释至推荐浓度0.125 IU/mL，并额外准备至少40 µL的过量体积以补偿移液过程中的损耗。每个ELISA板上所有样品均需设置两个复孔（即技术重复）。标准曲线应在每块ELISA板的第2列和第3列中设置，共八个点，采用两倍系列稀释法。对于其他所有待测样品，可根据预期抗原含量选择适当数量的稀释点进行系列稀释。尽管通量较高时可采用较简化的方案，但也可仅使用单次样品稀释作为上述板式设计的替代方法。然而，该单次稀释样品的预期浓度必须落在标准曲线的检测范围内。</li>
	<li>在低吸附蛋白96孔板或低吸附蛋白管中（参见 材料表），在平板的各列中对每个样本进行两倍系列稀释。</li>
	<li>将每个样品的稀释系列起始液加入到对应样品的A行，加入体积为最终所需体积的两倍（每块板每个孔需要100 µL样品，因此A2-A11各孔应至少含有240 µL样品，额外增加40 µL以补偿移液过程中的损耗）。</li>
	<li>在低吸附蛋白板上除第1列和第12列外的所有其他孔中（即B2至H11）加入120 µL稀释缓冲液。</li>
	<li>使用装有10个吸头的多通道移液器，将120 µL样品从A2-A11孔转移至B2-B11孔，上下吹打数次以混匀，注意避免溅出和产生气泡。重复此操作，沿各列向下逐行转移，直至H2-H11孔。最后从最末一行孔中吸取剩余的120 µL液体并弃去。 
	注意：样品现已准备好进行分析。如果此时封闭步骤尚未完成，需确保样品保持在冰上。</li>
	<li>孵育步骤结束后，用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤平板三次。</li>
	<li>使用多通道移液器，将100 µL稀释缓冲液加入第1列和第12列中作为 &#34;空白&#34;.</li>
	<li>使用多通道移液器，从含有样本稀释液的低吸附蛋白96孔板的每个孔中转移100 µL至已洗涤的ELISA板中。对所有正在进行的ELISA板重复此步骤。</li>
	<li>用粘性塑料膜密封培养板，置于37 ± 2 °C培养箱中孵育60 ± 5分钟。</li>
	<li>配制检测抗体溶液（参见 材料表) 加入 4.4 µL 抗体溶液至 10,995.6 µL 稀释缓冲液中，使终浓度为 0.2 µg/mL，用移液器吹打混匀。 
	注意：96 孔板每孔 100 µL 需要总共 11 mL（额外体积用于弥补移液损耗）。每增加一块需检测的 ELISA 板，总体积增加 11 mL。该溶液必须在配制后立即使用。</li>
	<li>孵育步骤结束后，用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤平板 5 次。</li>
	<li>吸去残留的洗涤缓冲液，使用多通道移液器向微孔板的每个孔中加入100 µL检测抗体溶液。</li>
	<li>用粘性塑料膜密封板，在37 ± 2 °C条件下于培养箱中孵育60 ± 5分钟。</li>
	<li>在检测抗体孵育步骤即将结束时，加入4.4 µL链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物溶液（参见 材料表) 加入洗涤缓冲液至总体积为 10,995.6 µL。 
	注意：96 孔每孔 100 µL 需要总共 11 mL（额外体积用于多通道移液器加样）。每增加一块需检测的 ELISA 板，总体积增加 11 mL。</li>
	<li>用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤平板 5 次。</li>
	<li>吸去残留的洗涤缓冲液，向每孔中加入100 µL共轭溶液。</li>
	<li>用粘性塑料封膜密封培养板，置于37 °C培养箱中，在37 ± 2 °C条件下孵育60 ± 5分钟。</li>
	<li>根据制造商说明书，在最后一次洗涤步骤期间准备底物（参见 材料表）。每块板加入一片邻苯二胺盐酸盐（OPD；参见 材料清单在9 mL去离子水中避光溶解，然后加入1 mL 10倍浓度的稳定过氧化物缓冲液。根据待评估的平板数量调整药片数量和溶液总体积（10 mL）。</li>
	<li>用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤平板 5 次。</li>
	<li>使用多通道移液器向每个孔中加入100 µL底物。</li>
	<li>用粘性塑料封口膜密封培养板，并用铝箔包裹避光，在室温下静置10–20分钟。 
	注意：通过肉眼观察显色过程，避免信号饱和。</li>
	<li>每孔加入50 µL终止液，立即在492 nm波长下测定吸光度，并以620 nm为参考波长进行读板。</li>
	<li>使用校正后的吸光度读数（492 nm 处的读数减去 620 nm 处的读数），并从所有样品中减去空白孔的平均值。采用四参数逻辑拟合（4PL）插值法将吸光度值转换为 IU/mL。最后，乘以 250 µL（总样品体积），换算为 IU。 
	注意：该分析可使用数据分析软件完成。</li>
</ol>

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</ol>

McHugh 博士已基于本项工作提交了一项专利申请，并目前担任 Particles for Humanity 的顾问。Graf 先生已基于本项工作提交了一项专利申请。Kadasia 博士&#160;、Yang 先生和 Brady 女士是 Particles for Humanity 的成员，这是一家公共利益公司，在本研究期间从麻省理工学院获得了一项类似的微粒疫苗递送技术的授权。

可以根据特定需求调整颗粒的几何形状；然而，对于圆柱形结构，作者建议保持本方案中所述的高度:直径:壁厚为5:4:1的比例。该长径比可确保存在足够的PLGA材料以封闭颗粒，并在操作过程中保持足够的机械强度。颗粒的尺寸和形状可在计算机辅助设计（CAD）过程中轻松修改，从而生成多种多样的几何结构。结合CAD的灵活性与3D打印技术，可实现微颗粒设计的快速迭代。尽管本方案采用多光子3D打印机，但任何具备在合适材料上打印微结构尺寸能力的3D打印机均可用于制备初始主模具。此外，光刻技术此前已被用于制造阵列结构，其规模远大于本方案所制备的结构；然而，由于操作繁琐、定制光掩模的订购周期较长以及设备可及性有限，会减缓设计的迭代进程16。最后，若无法在本单位内制备主模具，也可将主模具的制备外包给收费服务公司。无论采用何种3D打印机或方法制备主模具，打印物与基底之间的粘附性对后续步骤至关重要。具体而言，在制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具过程中，若粘附性不足，打印的颗粒将滞留在PDMS模具中，需手动移除打印颗粒，并导致主模具损毁。
颗粒填充是另一个需要考虑的关键方面。微粒的填充容量有限，因此过滤不仅用于浓缩RABV抗原，还用于去除会占据微粒核心体积大部分空间的储存辅料。然而，由于RABV抗原体积较大（约60 nm × 180 nm）17，在离心步骤中可能部分沉淀抗原。因此，在离心后通过移液或涡旋重新悬浮抗原非常重要，以实现RABV抗原的高回收率。高浓度溶液适合分配，因为它可减少分配循环次数，从而限制填充过程中抗原的降解。然而，粘度是压电分配机器人形成稳定液滴的主要限制因素，因此分配极高浓度的溶液可能无法实现或不推荐。稀释填充液是实现稳定液滴形成的最简单方法，但应考虑为达到目标载量所需增加的填充循环次数以及更长的颗粒填充时间对抗原稳定性的影响。
局限性 
该方法需要高度专业化的设备来制备初始模具，以及用于微粒制备的专用填充仪器。尽管可以通过付费服务的方式绕过对具有足够打印分辨率以生成初始主模具的3D打印机的需求，但压电分配机器人仍难以获得。采购压电分配机器人需要较高的前期投入，通常在80,000至200,000美元之间，具体取决于品牌、通量和功能。尽管存在其他几种潜在的替代填充方法，但这些方法尚未使用RABV抗原进行验证12。
未来应用 
大量包封的RABV抗原在封存过程中保持稳定。理论上，通过将该抗原整合到由不同类型PLGA构成的微粒中，以模拟暴露后预防治疗的给药时间线，所有剂量均可通过单次注射完成。消除因追加给药而需多次前往医院的需求，将提高患者的依从性，从而改善治疗效果。此外，本研究已证明该方法能够保留结构高度复杂的灭活狂犬病病毒的ELISA反应活性，因此其他抗原（包括亚单位疫苗）也可能适用于此种包封技术。在低收入和中等收入国家（LMICs），将其他预防性抗原与PULSED微粒结合使用，有望通过提高疫苗接种率挽救数百万人的生命。然而，要实现这一目标，疫苗不仅需要在包封过程中保持稳定，在释放过程中也必须保持稳定。这可能具有挑战性，因为载荷将暴露于由体温和PLGA降解产物引起的较高温度及潜在酸性微环境中18。未来的研究将致力于开发抗原在释放过程中的稳定策略，这将为广泛适用的单次注射疫苗平台开辟可能性，用于预防多种传染病。

疫苗接种是一种极为有效的医疗保健工具，仅在2000年至2019年间就预防了超过3700万例死亡1。尽管如此，疫苗可预防疾病仍对全球健康构成重大威胁，尤其是在低收入和中等收入国家（LMICs），由于未接种和接种不足的比例较高，每年导致约150万例本可避免的死亡2。狂犬病也不例外，存在类似的不平等现象。尽管狂犬病是目前已知对人类致死率最高的疾病，几乎无一例外地致命，但它完全可以预防，并已在许多高收入国家被成功根除。相反，狂犬病的负担主要由亚洲和非洲部分地区的居民承担，该疾病对当地人群和家畜造成了毁灭性的影响3,4。
疫苗接种对于控制狂犬病的全球影响至关重要5。考虑到该疾病的总体发病率较低，疫苗接种的成本限制了暴露前预防（PrEP）的广泛实施。此外，在中低收入国家（LMICs），患者因寻求医疗保健所面临的经济社会压力，限制了暴露后预防（PEP）的应用效果。诸如前往医疗机构的交通距离、治疗期间的收入损失、治疗费用、预约时间与日常活动冲突以及遗忘等因素，导致PEP的依从率低至60%6,7。如此高的患者失访率提示有必要优化策略，以弥补狂犬病疫苗接种中的不足，从而有效防控该疾病。
单次注射（SI）疫苗系统通过控制抗原的释放，已被探索作为仅需一次注射即可完成全程免疫的方法。消除多次前往医疗机构的需求，有助于减轻阻碍个体获得充分医疗保健的负担。为实现单次注射疫苗接种，通常将抗原包封于可生物降解的聚合物基质中，这种基质常以可注射微粒的形式存在。注射后，聚合物逐渐降解并释放所包埋的抗原。迄今为止，已有两种主要的释放策略被用于实现单次注射疫苗接种。其中一种策略是抗原在较长时间内持续释放。尽管该策略旨在增强单次注射的免疫原性，但目前尚不清楚这种方法是否足以在人体内引发针对狂犬病病毒（RABV）的保护性免疫反应8。另一种策略则是在预设的延迟时间后释放抗原，以模拟传统且已被证实有效的初免-加强疫苗接种程序。基于喷雾干燥和乳化/溶剂蒸发的微粒制备方法体现的是前一种策略，已成功用于包封模型疫苗9&#160;以及如破伤风类毒素等高度稳定的抗原10。然而，这些包封方法涉及热、溶剂作用和物理力等应激因素，可能导致抗原变性11。
颗粒均匀液化并密封以包载药物（PULSED）是一种新近开发的制备方法，可用于将生物制剂包封于可生物降解的微粒中。该方法采用微模塑技术制备出可容纳液态有效成分的微粒，随后加热使聚合物重新流动，从而在可生物降解聚合物的连续层内完全包封中央货物储库。这种微结构可在一段时间后实现有效成分的脉冲式释放，释放时间取决于聚合物壳的降解速率12。本文展示了利用PULSED制备方法，将灭活的狂犬病病毒（RABV）包封于由聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）构成的微粒中，PLGA是一种广泛用于多种美国食品药品监督管理局（FDA）批准制剂的可生物降解聚合物13，并通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）评估了RABV抗原的稳定性。通过组合不同分子量和/或端基的PLGA微粒，该方法有望在单次注射后模拟当前狂犬病疫苗的接种时间进程。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m PES 滤膜</td><td>Cole-Parmer+B4B2:B63</td><td>04396-26</td><td></td></tr><tr><td>0.25 mm 垫片</td><td>McMaster Carr</td><td>98090A935</td><td></td></tr><tr><td>0.75 英寸文件夹夹</td><td>Staples</td><td>480114</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>贝克顿·迪金森公司（Becton, Dickinson and Company）</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>10 mL&amp;nbsp;带放大刻度线的无菌聚苯乙烯一次性血清移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>101.6 mm C 型夹</td><td>Amazon</td><td>PT-SD-CP01A</td><td>黑色手柄最终会脱落。发生此情况后，请使用钳子进行调节。</td></tr><tr><td>19 G 针头</td><td>EXCELINT</td><td>26438</td><td></td></tr><tr><td>25 mL&amp;nbsp;带放大刻度线的无菌聚苯乙烯一次性血清移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯&amp;nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>M6514-25ML</td><td></td></tr><tr><td>5 mL&amp;nbsp;带放大刻度线的无菌聚苯乙烯一次性血清移液管</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>50 mL&amp;nbsp;带放大刻度线的无菌聚苯乙烯一次性血清移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher</td><td>AC268310010</td><td></td></tr><tr><td>铝块</td><td>McMaster Carr</td><td>9057K175</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>VWR</td><td>89079-069</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 离心过滤器，100 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>C82301</td><td></td></tr><tr><td>抗狂犬病病毒抗体，无血清抗体，克隆株 1112-1，100</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>抗狂犬病病毒小鼠单克隆抗体，克隆株 D1-25，生物素标记</td><td>Fisherbrand</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>羧甲基纤维素</td><td>东京化成工业（Tokyo Chemical Industries）</td><td>C0045</td><td></td></tr><tr><td>ClipTip 300，带滤芯，成排放置</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Costar 0.65 mL 低吸附 snap-cap 微量离心管</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>3206</td><td></td></tr><tr><td>Costar 1.7 mL 低吸附 snap-cap 微量离心管</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Describe</td><td>Nanoscribe</td><td></td><td>用于定义 Nanoscribe 3D 打印机打印参数的软件，见步骤 1.2。&lt;br/&gt; 随打印机提供的软件。</td></tr><tr><td>干燥器</td><td>Fisher Scientific</td><td>10529901</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>Staples</td><td>649280</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x)，不含钙，不含镁</td><td>Gibco</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>F1-ClipTip 多通道移液器，30 至 300 &amp;micro;L</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand SureOne 气溶胶屏障移液器吸头，0.1 &amp;ndash; 10 &amp;micro;L</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand SureOne 气溶胶屏障移液器吸头，100 &amp;ndash; 1000 &amp;micro;L</td><td>Fisherbrand</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand SureOne 气溶胶屏障移液器吸头，2 &amp;ndash; 20 &amp;micro;L</td><td>Fisherbrand</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand SureOne 气溶胶屏障移液器吸头，20 &amp;ndash; 200 &amp;micro;L</td><td>Fisherbrand</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Elite 移液器套装</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;移液控制器&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿，90 mm</td><td>VWR</td><td>470313-346</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Globe Scientific</td><td>1380-10</td><td></td></tr><tr><td>Helicon Focus 8</td><td>HeliconSoft</td><td></td><td>用于图像聚焦堆叠的软件</td></tr><tr><td>IP-Q 树脂</td><td>Nanoscribe</td><td></td><td>打印机树脂与 10x 镜头兼容，用于在 Nanoscribe Photonic Professional GT2 上打印大型微结构</td></tr><tr><td>Lascar EL-USB-TC-LCD 热电偶</td><td>Amazon</td><td>5053485896236</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>显微镜载玻片盒</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z374385-1EA</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Nanoscribe Photonic Professional GT2 配 10X 物镜</td><td>Nanoscribe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoWrite</td><td>Nanoscribe</td><td></td><td>用于与 Nanoscribe 3D 打印机交互的软件。&lt;br/&gt; 随打印机提供的软件。</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp 平底 96 孔板</td><td>Invitrogen</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>OPD 底物片剂（邻苯二胺二盐酸盐）</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 封口膜，4 英寸</td><td>Fisherbrand</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>PDC 60 带 Type 3 涂层</td><td>Scienion</td><td>P-2020</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 颗粒模具</td><td>Rice University</td><td>n/a</td><td>N/A - 颗粒直径为 400 &amp;mu;m，壁厚 100 &amp;mu;m，高度 500 &amp;mu;m，内径为 200 &amp;mu;m。阵列尺寸为 14 x 22 颗粒，彼此间距 600 &amp;mu;m。使用 4 点和 5 点星形作为定位标记，分别位于阵列右上和左上颗粒右侧和左侧 600 &amp;mu;m 处。</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 稳定过氧化物底物缓冲液 (10x)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-430</td><td></td></tr><tr><td>塑料杯</td><td>Fisher Scientific</td><td>S04170</td><td></td></tr><tr><td>PLGA 薄膜，502H</td><td>Sigma</td><td>502H: 719897-1G</td><td></td></tr><tr><td>丙二醇单甲醚乙酸酯</td><td>Millipore Sigma</td><td>484431</td><td></td></tr><tr><td>狂犬病抗原</td><td>Chiron Behring 和 Bharat Biotech International</td><td></td><td>通过与公司签订材料转让协议获得该材料。</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>VWR</td><td>21899-530 和 76457-512</td><td></td></tr><tr><td>SciFLEXARRAYER S3 配 PCD 60</td><td>Scienion</td><td></td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>96 孔板密封膜</td><td>Thermo Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>硅晶圆</td><td>University Wafer</td><td>1025</td><td></td></tr><tr><td>弹簧夹</td><td>IRWIN</td><td>VGP58100</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢块</td><td>McMaster Carr</td><td>9083K12</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素&amp;minus;过氧化物酶聚合物，超敏型</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>DOW</td><td>2646340</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯（Teflon）片</td><td>McMaster Carr</td><td>9266K12</td><td>用于制备 PLGA 薄膜。必须切割成适当尺寸的片状。</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯（Teflon）片，0.8 mm 厚</td><td>McMaster Carr</td><td>9266K81</td><td></td></tr><tr><td>三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷</td><td>Sigma</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>镊子&amp;nbsp;</td><td>Pixnor</td><td>ESD-16</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 去离子水</td><td>Fisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>紫外烘箱，CL-1000S 紫外交联仪</td><td>UVP</td><td>95-0174-01</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Bel-Art</td><td>F420100000</td><td>请注意，您需要两个。其中一个将专门用于使用三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷预处理样品，以防止污染。</td></tr><tr><td>可加热至 120 &amp;deg;C 的真空烘箱</td><td>VWR</td><td>97027-664</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>真空泵，CRVpro4&amp;nbsp;</td><td>Welch</td><td>3041-01</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>木质压舌板</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72320</td><td></td></tr></tbody></table>

制备包载狂犬病抗原的脉动型聚合物微粒

Fabrication of Pulsatile Polymeric Microparticles Encapsulating Rabies Antigen

目前狂犬病暴露后预防的指南要求在数周内进行多次注射。这对于中低收入国家（LMICs）的居民而言负担尤为沉重，而这些地区正是大多数致命狂犬病暴露事件的发生地。为将疫苗接种程序简化为单次注射，研究人员已探索了多种药物递送策略，例如将抗原包裹于聚合物颗粒中。然而，封装过程中的严苛条件可能导致包封抗原发生变性。本文介绍一种可实现可调脉冲释放的狂犬病病毒（RABV）抗原聚合物微粒封装方法。该方法称为“药物均匀液化密封封装法”（Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs, PULSED），利用软光刻技术，以多光子三维打印的主模具制备出反向聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具。随后将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）薄膜通过热压成型方式注入PDMS模具中，形成开口的圆柱形结构，并使用压电分配机器人将浓缩的RABV填充其中。接着通过对微粒顶部加热，使材料流动并形成连续、无孔的聚合物密封层，从而完成封装。制备完成后，采用特异性检测完整三聚体狂犬病病毒糖蛋白的酶联免疫吸附试验（ELISA）来确认微粒中免疫原性抗原的高回收率。

微粒封口与填充是本方案中最关键的两个步骤。为展示理想的填充效果及一些常见错误，实验中使用荧光素钠盐进行填充。为便于观察，以荧光素钠盐替代RABV抗原。填充过程中，应将溶液准确加入微粒核心底部，并留出足够时间使溶剂/水完全蒸发。完成后，溶质以储库形式保留在微粒核心底部（图1A）。填充完成后，正确封口至关重要。图1B展示了封口过程的多种结果（包括成功与失败的情况）。当封口时间为12秒时，微粒中心至外部仍存在明显通道，表明微粒未完全封闭；相反，若封口时间延长至36秒，PLGA几乎完全熔化，导致微结构呈现浅表形态。当封口时间为18秒和24秒时，可观察到理想形态：此时微粒内部载荷被聚合物完全包封，同时保持完整的微粒结构。图1C展示了填充与封口后的几种可能结果。在加样过程中，若溶剂未能到达微粒底部，则溶质将在微粒核心中部析出干燥（填充错误）；尽管此类微粒仍可能完成封口，但载荷量不足会限制装载效率。若微粒装载过多载荷（过载），封口过程将受到阻碍，因为载荷会阻止PLGA流动覆盖开口。当微粒正确填充并封口后，其几何尺寸足够小，可轻松通过19 G针头。此外，在使用2%羧甲基纤维素等黏稠溶液注射时，10个微粒均能顺利通过19 G针头（通过率为100% ± 0%）（补充图7）。
<img alt="微流控器件填充过程中的干燥与封口时间序列；液体液位的显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65147/65147fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：填充与封口过程中常见的问题。（A）一个填充循环后溶剂蒸发的图像，其中颗粒装载了6 nL溶于水的100 mg/mL荧光素钠盐溶液。（B）在0、12、18、24和36秒时从封口过程中取出的502H PLGA颗粒的代表性图像。（C）颗粒在正确填充、错误填充或过度填充时封口过程的不同结果。图像通过多张图像聚焦堆叠并使用聚焦堆叠软件合并生成。比例尺 = 200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/65147fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在将抗原加载到颗粒之前，通过离心过滤装置处理抗原具有两个重要原因。首先，离心步骤可去除疫苗溶液中的辅料成分，这些成分可能限制颗粒的载抗原能力，同时保留狂犬病病毒（RABV）抗原。当前方案可使抗原纯化约50倍。其次，抗原在此过程中也被浓缩。图2A展示了浓缩抗原样品中完整RABV病毒颗粒的显微图像。该抗原的浓度约为起始原液的4.4倍（图2B）。最初加载到离心过滤装置中的抗原量可进行调整，以调节最终达到的浓缩倍数。例如，加载40 µL的原液抗原可实现约1.75倍的浓缩。补充图8展示了在浓缩过程中涡旋振荡（步骤5.15）的重要性。若忽略涡旋或涡旋操作不当，将限制浓缩效果。
<img alt="纳米颗粒的电子显微镜图像；浓度增加的柱状图比较：显微镜图像、图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65147/65147fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：抗原浓度。 通过离心过滤浓缩抗原的结果，由透射电子显微镜（A）显示，并通过 ELISA（B）验证。误差线表示标准偏差。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey 多重比较检验。**p &lt; 0.01，****p &lt; 0.0001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/65147fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
图3A 显示浓缩抗原被填充入未密封和已密封的颗粒中。尽管有相当数量的抗原被载入颗粒（0.0469 ± 0.0086 IU），但该材料包含 &lt;90%的颗粒载量，为额外抗原的加载留出了充足空间。有趣的是，未密封颗粒仅含有0.0396 ± 0.0077 IU，仅占所加载总量的85% ± 16%。尽管这一损失在统计学上不显著，但在填充过程中的反复再水化和干燥可能导致部分RABV抗原发生变性。密封后，仍有69% ± 5%的抗原以生物活性形式被包封。尽管这表明在密封过程中由于热应力导致了显著的损失，但大部分灭活的病毒抗原仍保持完整。图3B将稳定型辅料与抗原共同包封是一种可行的策略，可进一步提高抗原在制备全过程中的稳定性，此前该方法已在其他灭活病毒抗原中取得成功。14,15.
<img alt="生物活性抗原分析：微胶囊结构、柱状图比较、抗原封存效果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65147/65147fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：颗粒制备后的生物活性RABV抗原。（A）图像显示含有RABV抗原的未封合与已封合颗粒。（B）抗原在颗粒制备过程中的稳定性（n = 4）。加载对照通过将抗原直接加入溶液中制备。误差线表示标准偏差。比例尺 = 200 µm。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验。*p &lt; 0.05。图像通过多层图像聚焦堆叠并使用聚焦堆叠软件合并生成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/65147fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：颗粒、基准标记和阵列的尺寸。 该图显示了在CAD软件中展示的四角星形基准标记（A）、圆柱形微粒（B）、五角星形基准标记（C）以及带有基准标记的颗粒阵列（D）的几何特性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：该图显示了用于固化PDMS模具的烘箱内结构的横截面。 箭头指示了使用夹具夹紧的位置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S2.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图3：高效回收浓缩抗原的正确操作技术。 第一次离心结束后，红色圆圈标记的浓缩样品（A）保留在滤膜中，而滤液则收集在收集管底部（较大的外层管）。为重悬沉淀的抗原，使用收集管（B）盖上离心过滤装置，准备进行涡旋振荡。涡旋时，将管尖端保持与涡旋垫接触，并以45°角绕轴旋转管的盖端（C）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S3.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图4：预运行程序压电分配器。 (A) 通过从“主选项卡”进入，设置“查找目标参考点” 机器人设置 &gt; 其他 &gt;功能部门 &gt; 寻找目标参考点. 使用蓝色高亮的按钮设置基准标记。首先，选择 学习模板 并在感兴趣的基准标记周围绘制一个方框，然后通过点击验证模板的准确性 搜索模板，并保存模板。对四角星和五角星执行相同操作，并根据下方说明中的要求保存文件名 使用两种不同的模板图像接下来，确保黑色方框中的所有参数一致。使用四角星形定位标记载入 加载模板 （绿色框）。通过选择保存“查找目标参考点”程序 任务列表 （橙色框）。(B设置 运行 通过导航至 机器人设置 &gt; 任务标签页，然后通过从蓝色框中添加任务来加载任务序列 任务列表 （黑箱）使用 运行中的任务 选择（绿色框）。最后，保存任务（橙色框）。(C) 通过导航设置“目标底物” 机器人设置 &gt; 靶底物，然后添加一个目标（蓝色框）。(D) 输入此处所示参数并选择 保存 （蓝色框） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S4.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充图 5：加载抗原并校准分配对齐。（A）进入 喷嘴设置 &gt; 执行任务选项卡，通过选择 TakeProbe10 uL（黑框）并点击 DO（黑框），将 10 µL 抗原吸入分配尖端。（B）这将打开一个独立窗口。选择已加载浓缩抗原的孔位，并选择 OK（蓝框）。（C）抗原吸入完成后，通过选择蓝框清洗尖端，并重复此清洗步骤两次。选择摄像头（黑框），通过选择“液滴体积”（绿框）测定液滴体积。确保形成稳定的液滴，其体积标准偏差（%）&lt;2（橙框）。（D）完成这些步骤后将打开“Snap Drop Cam”界面；在下拉菜单中选择 图像（蓝框），然后选择 喷嘴头摄像头向导。这将打开一个新窗口。请迅速执行接下来的一系列步骤。（E）确保已在 补充图 4 中制备的目标已加载，然后选择 移动至目标（蓝框）。将液滴数调整为 15，并选择 点样（黑框）。点样完成后，立即选择 移动（绿框）。确保已选择 自动查找，并删除颗粒大小 = 12，然后点击 开始（橙框）。如果自动检测失败，请在载玻片上移动至不同区域后重复此过程（紫框）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S5.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图6：编程点样阵列并开始运行。 （A）进入 靶标设置 &gt; 靶标，然后填写蓝色框中所示的参数。（B）接下来，切换到“区域设置”选项卡，在“液滴数”字段中输入 20（蓝色框），选择一个孔（黑色框），然后选择要分配至的靶标/颗粒（绿色框）。通过选择不同的孔并重新选择靶标/颗粒，可在单次运行中执行额外的填充循环。（C）在主界面中，确保已选中在 补充图5 中创建的运行程序和靶标。（D）进入“运行”选项卡，点击 开始运行（蓝色框）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S6.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图7：微粒的可注射性。 （A-C）充满荧光素钠盐并密封于19 G针头中的微粒经显微镜聚焦堆叠成像。 （D）使用2%羧甲基纤维素溶液（n = 8）通过19 G针头注射共10个微粒。比例尺 = 1 mm。误差线表示标准差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S7.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 8：抗原浓度可能存在的问题。 红色线条表示预期的浓度倍数增加。误差线表示标准差。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey 多重比较检验。*** p &lt; 0.001，****p &lt; 0.0001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S8_Revised.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件1：狂犬病病毒ELISA缓冲液和溶液的制备。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件 1：包含粒子阵列的 STL 文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Supplemental%20File%201.STL" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件 2：包含用于密封颗粒的定制载片夹具几何结构的 STL 文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Supplemental%20File%202.STL" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方法描述了将狂犬病抗原包封于可生物降解的聚合物微粒中，其结构和材料特性可在预设延迟后实现脉冲式释放。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）对从微粒核心释放的抗原进行检测，证实了在微粒制备过程中完整三聚体狂犬病病毒糖蛋白的存在。

目前的狂犬病暴露后预防指南要求在数周内进行多次注射。这可能会造成不成比例的……

该方法的意义在于，它可通过单次注射实现多剂量疫苗的递送，有望挽救数百万人的生命，特别是在中低收入国家，由于获取疫苗存在困难，许多新生儿未能获得免疫接种。这种制备方法可使狂犬病疫苗在微粒中保持其原有的诱导免疫活性形态，且微粒的释放模式可模拟目前的疫苗接种程序，仅需单次注射即可完成。狂犬病是一种致命性疾病，在某些情况下需要多达五次重复接种疫苗才能防止死亡。然而，在一次就诊中完成全部疫苗接种程序可以提高依从性并挽救生命。该技术代表了一种平台型技术，能够递送针对多种疾病的多样化治疗或预防药物。首先，将3D打印的母模表面进行处理：将其置于真空腔室内，腔室内放置一个玻璃载片，载片表面含有40微升三氯硅烷。启动真空泵，持续抽真空一小时。将PDMS预聚物基础剂与固化剂按9:1的质量比混合于塑料杯中。然后将混合溶液转移至50毫升离心管中，在室温下以300 ×g离心3分钟。离心后，确保溶液澄清。表面处理完成后，将主模具放入铝箔皿中，将未固化的PDMS倒入模具上，确保所有结构完全浸没。将铝箔皿放入真空腔室，抽真空一小时，以去除所有气泡。取下铝箔皿后，在母模两端各放置一个800微米的间隔片，并将一块洁净的载玻片覆盖在母模上，避免产生气泡。使用长尾夹通过800微米间隔片将模具夹紧。将预聚物置于120摄氏度烘箱中固化4小时。固化后，小心松开回形夹。使用刀片将母模从固化的PDMS模具上分离。制备PLGA薄膜时，将450毫克PLGA置于非粘性聚合物片上的环形垫片内。然后，在PLGA上覆盖第二片防粘连聚合物膜，并使用一个101.6毫米的C型夹将整个叠层夹在两块铝块之间，拧紧至手指力度。将装有C型夹的组件放入真空烘箱中。在烘箱中放置30分钟后，再次拧紧夹子，并重新放回烘箱中继续处理30分钟。然后，将组装件转移至干燥器中冷却四小时。冷却后，松开夹具，将PLGA薄膜从防粘聚合物片上取下，并放入已标记的培养皿中。将培养皿存放在干燥器内，以备后续使用。为了制备PLGA微粒，按照先前所述方法处理PDMS模具表面。使用镊子或手术刀将250微米厚的PLGA薄膜切割成与微粒阵列大致相同的尺寸，并将其放置在经处理的PDMS模具上。在PDMS模具上的PLGA薄膜上方覆盖一片洁净的玻璃显微镜载玻片，并用弹簧夹夹住阵列和PLGA薄膜，将两者固定在一起。将夹紧的模具组件置于真空烘箱中保持一小时，然后在室温下冷却15分钟。冷却后，用剃刀刀片轻轻施加压力，使PDMS模具与PLGA微粒阵列分离，并将PLGA微粒存放在干燥器中以备后续使用。为向微粒中填充高浓度狂犬病疫苗抗原，需先准备压电分配装置，并将载有PLGA微粒的载玻片放入分配区域。将浓缩的抗原加入到孔板中，然后输入目标设置参数并点击“运行”。压电机器人将随之填充微粒。完成后，使用体视显微镜确认微粒是否已填充。为密封填充的微粒，将一个不锈钢块放在加热板上，并在不锈钢块上放置两片平行的显微镜载玻片。待不锈钢块水平后，开启加热板并将温度设定为205摄氏度。当不锈钢表面达到目标温度时，将填充的PLGA微粒悬置于两片玻璃载玻片之间，并立即启动计时器，持续18秒。将密封的微粒阵列从加热板上取下后，将其悬置于实验台上的两片载玻片上，冷却一分钟。为收集密封的微粒，将手术刀片以45度角抵住载玻片，并对微粒底部施加压力，使其从载玻片上分离。使用手术刀将收集的微粒转移至一个0.5毫升低蛋白结合离心管中。加入 250 微升含有牛血清白蛋白和葡萄糖的 PBS，以维持狂犬病疫苗的稳定性。将样品置于体视显微镜下，使用精细镊子的一个尖端压碎颗粒。在颗粒填充过程中，需要足够的干燥时间以确保溶剂或水完全蒸发。干燥后，溶质储库会残留在颗粒核心的底部。对于这种PLGA，理想的微粒形态出现在顶盖时间18至24秒之间，因为在此时间段内，载有货物的微粒已完全封闭，且未丧失微粒结构。当微粒被适当填充和密封后，其尺寸足够小，可轻松通过19号针头。此外，在注射至黏性溶液（如2%羧甲基纤维素）时，10个微粒能够持续稳定地通过19号针头。透射电子显微镜图像显示，在浓缩的抗原样品中存在完整的狂犬病病毒变异株，其浓度约为起始储备液的4.4倍。封口后，约69%的抗原仍以生物活性形式被包封，表明热应力在封口过程中导致了显著的抗原损失，但大部分病毒抗原仍保持完整。微粒填充是最关键的步骤之一。如果颗粒填充不正确，则颗粒很可能无法正确密封。为了理解其稳定性，需要进行额外的配方开发，包括在颗粒核心中加入辅料和其他生物学相关材料。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

包封狂犬病抗原的脉冲聚合物微粒的制备

本视频展示了在感染小鼠脑组织中进行免疫组织化学染色以检测狂犬病病毒抗原的方法。该过程包括脱蜡和酒精处理，随后进行蛋白酶消化处理以增强抗原的可及性。免疫组织化学染色结果显示红色沉淀物，证实组织切片中存在狂犬病病毒抗原。...

一种用于检测狂犬病病毒抗原的免疫组织化学染色方法

本视频展示了一种间接酶联免疫吸附测定法，即ELISA夹心免疫捕获法，用于评估疫苗中免疫原性糖蛋白的含量。将含有糖蛋白特异性抗体的检测板与系列稀释的疫苗样本（包括参考疫苗和待测疫苗）共同孵育，随后通过免疫测定法定量待测疫苗中的糖蛋白含量。...

使用夹心 ELISA 法测定疫苗中免疫原性糖蛋白的含量

本视频展示了一种利用聚合物纳米颗粒制备mRNA疫苗候选物的方法。阳离子聚合物与带负电荷的mRNA相互作用，形成聚集体（polyplexes）。聚集体的形成可稳定mRNA，使其成为免疫治疗应用中未来mRNA疫苗的潜在候选物。...

用于疫苗接种的mRNA负载纳米颗粒的制备

在此，我们介绍一种可快速、可重复地制备具有可调控大小、形状及表面蛋白呈递能力的仿生可降解人工抗原呈递细胞（aAPC）的实验方案，用于T细胞扩增。 离体 或 体内.

各向异性聚合物人工抗原呈递细胞的制备及其在CD8+ T细胞活化中的应用

我们为圈养的獴提供了含有乙基或甲基碘苯酸作为生物标志物的安慰剂口服狂犬病疫苗诱饵，并采用一种新型的液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）验证了诱饵的摄取情况。...

小印度猫鼬（Herpestes auropunctatus）血清中碘酚酸类似物的分析及其作为口服狂犬病疫苗生物学标志物的应用

新型的组织透明化技术（如溶剂清除器官的终极三维成像）可与免疫染色兼容，能够实现狂犬病病毒脑部感染及其复杂细胞环境的三维可视化。通过对厚的抗体标记脑组织切片进行光学透明化处理，可增加成像深度，并实现共聚焦激光扫描显微镜下的三维分析。...

溶剂清除脑组织中狂犬病病毒感染的高分辨率三维成像

本文介绍一种间接ELISA夹心免疫捕获法，用于测定狂犬病疫苗中免疫原性糖蛋白的含量。该检测方法采用一种可识别糖蛋白三聚体的中和性单克隆抗体（mAb-D1），可作为体内NIH试验的替代方法，用于在生产过程中监测疫苗效力的一致性。...

体外ELISA检测法评估狂犬病疫苗效价

本文介绍一种用于检测狂犬病病毒抗原的免疫组织化学检测方案，可作为福尔马林固定组织的替代诊断方法。...

免疫组织化学检测法用于检测福尔马林固定组织中的丽沙病毒抗原

本文介绍了一种基于聚（β-氨基酯）聚合物的mRNA纳米颗粒的简单制备方案，通过更换所包载的mRNA即可轻松实现定制化。该方案涵盖了聚合物的合成、纳米颗粒的制备及其表征的完整工作流程。 体外...

用于疫苗接种的mRNA负载型聚(β-氨基酯)纳米颗粒的合成与表征

本文介绍了一种利用纳米孔技术对狂犬病病毒（RABV）基因组进行快速且经济高效的表征工作流程。该工作流程旨在支持基于基因组信息的本地化监测，提供有关流行RABV谱系及其在区域系统发育树中位置的信息，以指导狂犬病防控措施的制定。...

利用纳米孔技术进行狂犬病病毒快速全基因组测序

本方案展示了泛丽沙病毒LN34实时反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测的完整流程，从组织采集到结果解读，包括引物序列和反应体系的优化更新，以提升该检测方法对部分非狂犬病丽沙病毒及兔形目动物样本的检测性能。我们还演示了单孔LN34多重化（LN34M）检测格式的实验设置。...

利用更新的多重LN34实时反转录-聚合酶链式反应检测法对动物进行狂犬病死后诊断

了解使用PLGA微粒脉冲释放封装狂犬病抗原的方法，实现单次注射多剂量疫苗。该技术可提高疫苗依从性，为中低收入国家提供便捷的免疫接种方案。

制备包载狂犬病抗原的脉动型聚合物微粒

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