丝状蓝藻延时显微镜分析的垂直固定方法
2023年9月25日
我们提出了一种简单易用的XY平面丝状蓝藻可视化方法。使用低熔点琼脂糖基质，允许以垂直方向获取参与分裂的蛋白质的图像。因此，该方法可以应用于任何丝状生物和不同种类的蛋白质。
在细菌中，研究细胞分裂蛋白的动力学需要细胞的空间方向。例如，在细菌细胞分裂的主要成分Z环的情况下，垂直方向是记录XY平面中整个结构的基础。在本视频中，我们开发了一种在丝状蓝藻Anabaena中实现这种特定取向的方法。
Anabaena是一种多细胞光合生物，与其他细菌共享使用大气氮作为氮源的能力。在没有这种元素的情况下，Anabaena分化专门从事固氮的细胞。因此，它提供了一个很好的模型来分析细胞分裂和多细胞之间的关系。
首先，选择存在于目标丝状蓝藻菌株中的分裂成分。对于实验，有必要构建一种丝状蓝藻突变体，该突变体表达与荧光蛋白融合的所选分裂体成分。在该协议中，我们使用表达与GFP融合的FtsZ的Anabaena突变体为例。
首先，用10毫升固定相培养物和90毫升液体培养基制作突变体的新鲜传代培养物。然后在恒定的光照和最佳温度下生长新的细胞培养物，直到达到指数期。在我们的例子中，突变体在25摄氏度下生长了七天。
现在取两毫升生长培养物并将其放入离心管中。在室温下以2， 500 x g 离心10分钟。离心后，检查所有细胞是否都在管底部。
处理样品时要小心，以免重新悬浮。在微波炉中加热3%低熔点琼脂糖溶液。重要的是在短时间内执行此操作，并检查溶液直到完全液态。
融化后，放在一边冷却。取上一步的离心管，弃去1.9毫升上清液，上下移液至少三次将细胞重悬于剩余体积中。在您的工作场所，将带有细胞的管子，融化的琼脂糖溶液，在尖端切开的一毫升注射器以及带有新干净刀片的手术刀。
然后通过移液至少三次将细胞与900微升3%琼脂糖溶液混合。确保琼脂糖溶液不太热，但保持液态非常重要。有了这个，我们可以避免在此过程中的细胞损伤。
下一步必须在琼脂糖溶液凝胶化之前快速完成。小心地将琼脂糖基质吸入一毫升注射器中。重要的是避免在吸吮样品时产生气泡。
之后，孵育样品，将注射器在室温下水平放置两个小时。孵育后，使用柱塞在干净平坦的表面上小心地除去带有细胞的基质。使用手术刀将凝胶样品切成尽可能薄的切片，保持基质的完整性。
然后将样品并排存放在相应的盖玻片中。如视频所示，在此步骤中，您可以使用吸头来协助样品的处理过程。对于延时实验，建议使用用于显微镜分析的细胞室。
在这种情况下，我们使用适合这些类型腔室的圆形盖玻片，如您在视频中看到的那样。最后，为防止样品脱水，在腔室内添加额外体积的融化的3%琼脂糖溶液。成像前，等到琼脂糖完全凝胶化。
现在将装有细胞的腔室放入显微镜中进行成像。建议使用具有温度和湿度控制功能的设备。以最大放大倍率在明场中可视化样品，并搜索垂直方向的灯丝。
您可以使用沿Z平面的自发荧光信号进行初始扫描，找到感兴趣的分裂位点。有了这个，使用荧光蛋白标记物的参数来可视化您感兴趣的蛋白质在分裂位点的信号。现在，您可以根据生物模型和感兴趣的蛋白质进行延时实验。
在这种情况下，我们可以看到 Z 平面中 FtsZ-GFP 突变体中 Z 环的整个结构。通过我们的方法，我们能够在很长一段时间内记录这些环的动力学。最后，随着荧光强度的变化，我们得出结论，这种结构在我们的模型中是高度动态的。
该方法是一种快速且廉价的方案，以Anabaena为模型，通过应用于丝状蓝藻等复杂形态的共聚焦显微镜来记录分裂位点中的蛋白质动力学。
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概述
本研究提出了一种创新方法，用于垂直方向上可视化丝状蓝藻，从而能够详细观察细胞分裂蛋白，特别是Z环结构。以藍藻作为模型，该方法展示了如何有效地应用荧光标记物来研究复杂的多细胞形式的动力学。
研究的主要组成部分
研究领域
- 细胞分裂
- 蓝藻生物学
- 荧光显微镜
背景
- 藍藻是能够进行固氮的多细胞光合有机体。
- 了解蓝藻中的蛋白质动力学可以为细胞分裂和多细胞性提供洞见。
- 在成像中的空间方向对于捕捉完整的结构如Z环至关重要。
使用的方法
- 分隔体组分FtsZ的荧光蛋白标记
- 丝状蓝藻模型系统（藍藻）
- 用于成像的共聚焦显微镜
主要结果
- Z环结构动力学在XY平面上成功可视化。
- 该方法展示了高时间分辨率并能够连续观察蛋白质行为。
- 结果确认了Z环在细胞分裂过程中的动态性质。
结论
- 该方法促进了对丝状生物中蛋白质动力学的研究，并提供了一个适用于各种丝状物种的框架。
- 研究结果为细胞生物学和显微镜方法学的广泛理解做出了贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution, time-lapse imaging of protein dynamics in complex bacterial systems is critical for de-risking early discovery and validating division-related targets. The vertical immobilization method for filamentous cyanobacteria enables direct visualization of Z-ring assembly and dynamics, supporting predictive confidence in mechanistic studies. This capability strengthens the translational bridge from basic cell biology to applied microbial engineering and synthetic biology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell division protein dynamics in multicellular bacterial models.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing FtsZ Z-ring formation and behavior in vivo.
- Facilitates functional validation of division-related targets in genetically engineered strains.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, vertically oriented biological samples for quantitative imaging workflows.
- Improves assay reproducibility by standardizing sample orientation and imaging conditions.
- Enables robust, time-lapse readouts for screening division-modulating compounds in complex morphologies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant or industrially relevant multicellular bacterial systems.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical microbial engineering applications.
- Supports risk-adjusted advancement of engineered strains for biotechnological use.
Pipeline & Workflow Integration
This vertical immobilization protocol fits at the interface of early discovery and assay development, enabling high-content imaging from target validation through preclinical microbial model evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on division protein function and spatial organization in multicellular bacteria.
- Screening: Delivers standardized, reproducible sample preparation for quantitative imaging assays.
- Analytics: Provides time-resolved, quantitative fluorescence measurements of protein dynamics at division sites.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to preclinical microbial engineering and synthetic biology workflows.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, low-cost method adaptable to diverse filamentous bacterial systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in division protein function and target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for microbial engineering and synthetic biology initiatives.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of division-targeted interventions and engineered strains.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and fluorescent protein engineering.
- Needs access to temperature- and humidity-controlled imaging platforms.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- Adaptable to various filamentous bacterial models with appropriate genetic tools.
- Sample orientation and handling are critical for reproducible, high-content imaging outputs.
