Name: 高压低温电子层析成像对蓝藻 DNA 压实的可视化研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 了解高压低温电子层析成像技术如何可视化蓝藻DNA压实过程。本方法结合荧光显微镜与冷冻电镜，可在接近活细胞状态下观察细菌细胞周期中DNA结构的动态变化，为微生物学研究提供高分辨率成像方案。

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作者感谢Tammo Reisewitz对稿件的审阅，感谢Mako Hayashi和Sayuri Hagiwara对蓝细菌的精心培养与观察，感谢Yoshitaka Kimori进行图像处理，感谢Chihong Song、Naoyuki Miyazaki和Miyoko Nagayoshi协助结构的分割工作。本研究得到了生理学研究所（NIPS）协作研究项目对Y.K.的资助。

1. 蓝细菌的同步培养
<ol>
	<li>在含有1.5%（w/v）琼脂和0.3%（w/v）硫代硫酸钠的无菌BG11平板（置于9 cm无菌塑料培养皿中）上培养S. elongatus PCC 79428。</li>
	<li>将平板置于23 °C、光照强度为50 µE/m2/s的培养箱中，进行12小时光照/12小时黑暗的光暗循环培养。</li>
	<li>每周将细胞转移至新的BG11琼脂平板上。 
	注意：在此培养条件下，一周后琼脂上的菌落将呈现为绿色的活跃增殖细胞带。</li>
	<li>用火焰灭菌的接种环挑取绿色的细胞团块，在洁净工作台中将细胞划线接种至新的BG11琼脂平板上。</li>
</ol>
2. 荧光显微镜监测
<ol>
	<li>使用在琼脂平板上培养6天的细胞观察DNA压缩情况。在光照周期结束时，将1 mL 0.2 M蔗糖溶液倾倒于平板上的细胞表面以收集细胞。重复倾倒溶液，使大部分细胞被收集。将悬浮细胞溶液转移至微量离心管中，用于DNA染色。</li>
	<li>向微量离心管中含细胞的500 µL悬浮液中加入DNA染色染料（例如 Hoechst 33342），使其终浓度为1 µg/mL。然后将离心管避光孵育10分钟。</li>
	<li>在2,000 × g 条件下离心1分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，加入10 µL 0.2 M蔗糖溶液，制成浓密的细胞悬液。</li>
	<li>取1 µL染色后的细胞悬液滴加到载玻片上，盖上盖玻片，使用配备紫外滤光片、放大倍数为100X并配合浸油的物镜，在荧光显微镜下观察。</li>
	<li>确认此时大多数细胞中均可观察到DNA压缩现象，随后准备样品进行下一步冷冻处理。</li>
</ol>
3. 冷冻高压电子断层成像样品的冷冻
<ol>
	<li>设置冷冻固定装置。将液氮罐充满液氮，并通过聚四氟乙烯管将液氮罐与冷冻室连接后，开始冷却冷冻室。</li>
	<li>待冷冻室温度降至液氮温度后，向室内一个小铜杯中注入液态乙烷。操作时需佩戴护目镜，因为液态乙烷具有爆炸性。</li>
	<li>使用等离子体离子轰击仪对带有微孔碳膜的电镜载网（微孔载网）的碳膜面进行辉光放电处理，条件为50 mA，持续30秒。</li>
	<li>向微孔载网上滴加1 µL BSA金标记物（15 nm），作为定位标记。</li>
	<li>向微孔载网上滴加2.5 µL处于DNA压缩阶段的细胞样品，用滤纸吸去多余液体，立即使用冷冻固定装置中的 plunger 将载网浸入液态乙烷中。</li>
	<li>将冷冻后的载网保存在液氮储存罐中，直至进行后续观察。</li>
</ol>
4. 冷冻高电压电子断层扫描（Cryo-HVET）
<ol>
	<li>将高压电子显微镜（HVEM）设置为1 MV的高电压。</li>
	<li>在低温工作站内，将冷冻网格装载至已用液氮预冷至-150 °C的HVEM低温样品 holder 中，然后将其装入高压电子显微镜。操作时需小心避免冰污染。</li>
	<li>在1,000倍的较低放大倍数下选择成像区域。调节同心轴（eucentric z-axis）高度。</li>
	<li>将样品台倾斜至-60°，并消除倾斜旋转过程中的回程间隙（backlash）。</li>
	<li>在10,000倍放大倍数下，调节焦点至目标位置附近。通过偏离聚焦图像的方式，设置6至10 µm的欠焦量。成像前，预先将样品上的电子剂量设定为2 e-/Å-2或更低。</li>
	<li>通过高压电子显微镜中像平面的电流密度测量电子剂量。使用电子胶片或数字相机在与聚焦过程相同的放大倍数下拍摄图像。</li>
	<li>按照与步骤(4.5)相同的方法，以2°至4°的倾斜角增量，手动采集从-60°到+60°的倾斜图像。 
	注意：在许多现代电子显微镜中，通过数字相机组合可实现倾转系列图像的自动采集。在此情况下，请遵循仪器说明书操作。对于负片胶片，使用原液显影剂在20°C下显影12分钟，随后在定影液中定影10分钟。使用平板扫描仪以4,000 dpi的分辨率（图像上每像素0.635 nm）对胶片进行数字化。若使用数字相机，则将采集的图像直接用于后续图像处理步骤。如有必要，可使用中值滤波器结合2至4倍的像素合并（binning，即尺寸缩减因子）及适当软件（例如 ImageJ）降低图像尺寸。</li>
</ol>
5. 断层重建
<ol>
	<li>使用以下命令从单个倾斜图像创建堆叠图像文件 &#34;tif2mrc&#34; 或 &#34;新建堆栈&#34; 在 IMOD 软件中9.</li>
	<li>在 IMOD 中启动 eTomo 图形用户界面软件并设置图像参数：像素尺寸、标志点直径、图像旋转角度 等等然后创建脚本。</li>
	<li>根据材料表中列出的软件执行各个程序，使用标记物（平均残差误差小于0.5）对倾转序列进行对齐。最后，在IMOD中使用SIRT算法重构三维断层图像。</li>
	<li>从断层图像中提取感兴趣区域（ROI），并使用去噪滤波器进行去噪：在 IMOD 中使用各向异性扩散滤波器，在 EMAN 中使用双边滤波器10或数学形态学滤波器11, 等等。，使用适当的参数以增强对比度。</li>
</ol>
6. �感兴特征的分割
注意：以下所述步骤仅适用于所使用的软件（见材料表），但也可使用其他软件包。请参考其用户指南。
<ol>
	<li>在 3D 查看器窗口中，使用 Amira 软件打开断层扫描文件并生成正交切片（OrthoSlice）。</li>
	<li>在分割编辑器窗口中，通过选择一个新的 &#34;标签场（label field）&#34;来创建一个分割文件。</li>
	<li>手动勾画目标特征（FOI）的边界，并在所有断层扫描切片中追踪该目标特征。对于第二个目标特征，创建一个新的 &#34;材质（material）&#34;，并重复相同的操作。</li>
	<li>通过选择 &#34;SurfaceGen&#34; 菜单生成表面渲染。为可视化已分割的体积，选择 &#34;SurfaceView&#34; 菜单。使用 3D 查看器窗口中的工具对 3D 体积进行移动、旋转和缩放。</li>
	<li>对于自动分割，使用魔棒工具（Magic Wand Tool）。单击目标对象，并调节显示和掩膜中的滑块，以覆盖数值范围，使对象的特征被完整选中。</li>
</ol>

<ol><li>Smith, R. M., Williams, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+gene+transcription+imparted+by+chromosome+compaction+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+elongatus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elongatus.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 103 (22), 8564-8569 (2006).</li>
<li>Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cyanobacterial+circadian+clock+based+on+the+kai+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22CSHS+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">A cyanobacterial circadian clock based on the kai oscillator.</a> CSHS Quant. Biol. 72, 47-55 (2007).</li>
<li>Seki, Y., Nitta, K., Kaneko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+polyphosphate+bodies+and+DNA+during+the+cell+division+cycle+of+Synechococcus+elongatus+PCC+7942%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+biol%22%5BJournal%5D)">Observation of polyphosphate bodies and DNA during the cell division cycle of Synechococcus elongatus PCC 7942.</a> Plant biol. 16 (1), Stuttgart, Germany. 258-263 (2014).</li>
<li>Murata, K., Hagiwara, S., Kimori, Y., Kaneko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+compacted+DNA+in+cyanobacteria+by+high-voltage+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of compacted DNA in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography.</a> Sci. Rep. 6, 34934(2016).</li>
<li>Koster, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+of+molecular+and+cellular+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+struct.+boil%22%5BJournal%5D)">Perspectives of molecular and cellular electron tomography.</a> J. struct. boil. 120 (3), 276-308 (1997).</li>
<li>Lučić, V., Rigort, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography%3A+The+challenge+of+doing+structural+biology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography: The challenge of doing structural biology in situ.</a> J. Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Adsorption+of+Cyanophage+P-SSP7+onto+Marine+Prochlorococcus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing Adsorption of Cyanophage P-SSP7 onto Marine Prochlorococcus.</a> Sci. Rep. 7, 44176(2017).</li>
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<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+struct.+boil%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. struct. boil. 116, 71-76 (1996).</li>
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<li>Murata, K., Esaki, M., Ogura, T., Arai, S., Yamamoto, Y., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+imaging+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+high-voltage+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicros%22%5BJournal%5D)">Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography.</a> Ultramicros. 146, 39-45 (2014).</li>
<li>Kortje, K. H., Paulus, U., Ibsch, M., Rahmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+thick+sections+of+nervous+tissue+with+energy-filtering+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Imaging of thick sections of nervous tissue with energy-filtering transmission electron microscopy.</a> J. Microsc. 183, 89-101 (1996).</li>
<li>Bouwer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+most-probable+loss+tomography+of+thick+selectively+stained+biological+specimens+with+quantitative+measurement+of+resolution+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated most-probable loss tomography of thick selectively stained biological specimens with quantitative measurement of resolution improvement.</a> J. Struct. Biol. 148 (3), 297-306 (2004).</li>
<li>Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+damage+in+the+TEM+and+SEM%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Radiation damage in the TEM and SEM.</a> Micron. 35 (6), 399-409 (2004).</li>
<li>Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volta+potential+phase+plate+for+in-focus+phase+contrast+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 111 (44), 15635-15640 (2014).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zernike+phase+contrast+cryo-electron+microscopy+and+tomography+for+structure+determination+at+nanometer+and+subnanometer+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Zernike phase contrast cryo-electron microscopy and tomography for structure determination at nanometer and subnanometer resolutions.</a> Structure. 18 (8), 903-912 (2010).</li>
<li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nmeth/journal/v11/n4/abs/nmeth.2842.html">Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells.</a> Nat. Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li>
<li>Ophus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+linear+phase+contrast+in+scanning+transmission+electron+microscopy+with+matched+illumination+and+detector+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Comm%22%5BJournal%5D)">Efficient linear phase contrast in scanning transmission electron microscopy with matched illumination and detector interferometry.</a> Nat. Comm. 7, 1-7 (2016).</li>
<li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+FIB-SEM%3A+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

我们介绍了一系列用于可视化蓝细菌中瞬时DNA压缩的实验方案。其基本原理与关联性光镜和电镜技术（CLEM）相似12。此外，在本方法中，活体蓝细菌首先通过荧光显微镜进行监测，随后迅速在电镜载网上冷冻，并直接利用高压冷冻电镜断层扫描技术进行高分辨率三维成像。作为首次应用，我们成功地以三维形式解析了DNA压缩状态下细菌细胞的精细结构。目前，该方法主要针对特定研究对象，但在部分情况下经方法改进后可进一步拓展应用范围。本文讨论了该技术的优势、局限性以及未来的发展前景。
该方法的优势之一是能够对整个细胞进行三维可视化。1 MV 高压电子显微镜（HVEM）成功实现了对DNA高度压缩细胞中亚细胞器动态结构的观察。然而，由于图像对比度较低，正常细胞内部的精细结构难以分辨。在较厚样品中，非弹性散射和多重散射的增加会导致图像模糊13。通过能量过滤器进行零损失和最概然损失图像滤波，可减少非弹性散射从而提高图像对比度14,15，但该方法对厚度超过非弹性平均自由程（iMFP）的样品无效。零损失和最概然损失峰的强度随样品厚度增加而显著下降。对于电子敏感的冰嵌入样品，尤其难以获得足够的信噪比。Murata et al. 的研究表明，在厚度为 5 µm 的树脂包埋酵母细胞中，1 MV 扫描透射电子显微术（STEM）比明场成像具有更高的图像对比度，此时图像对比度主要来源于振幅对比13。然而，预计高能加速电子引起的反冲损伤会对辐射剂量造成新的限制，尤其适用于对损伤敏感的冷冻样品16。未来，Volta相位板和Zernike相位板17,18在HVEM中的应用可能通过降低总剂量来减轻反冲损伤。另一个使用HVEM观察厚样品的限制在于，全球范围内提供HVEM的用户设施极为稀少。
采用一种替代方法观察厚样品，300 kV 下的冷冻扫描透射电子显微断层成像技术已在厚度超过数百纳米的冷冻水合样品上获得高对比度图像19为了在冷冻扫描透射电子显微镜（cryo-STEM）中重建相位衬度，还引入了电子叠层成像显微术，该方法利用聚光镜中的相位片将相位调制的衍射图样投射到像素化的二维探测器上。20通过多次衍射图样的计算重建图像。对于大尺寸天然冷冻样品的直接快速三维冷冻成像，也可采用冷冻聚焦离子束扫描电子显微镜（cryo-FIB-SEM）技术。21，其中采用聚焦离子束进行连续切片，并对块面进行成像，以观察完全水合的冷冻样品。尽管这些技术拓展了生物样品的观察范围，但仍难以定位细菌的目标位置， 例如 标记的细菌，因为目标完全位于冰层下方，在修块前无法识别。
DNA 压缩在蓝细菌中形成一种独特的结构。由于压缩后的细胞内部存在显著的密度差异，而正常细胞中无此现象，因此即使不染色也能轻易区分 DNA 压缩细胞。然而，为了观察细胞内更局部的事件，有必要将荧光标记的感兴趣区域（ROI）转移到电子显微镜下进行成像。在关联光镜与电镜（CLEM）技术中，通常使用 EM 定位网格上的荧光乳胶微球或量子点来实现光镜图像与电镜图像的配准12。这些标记颗粒除了具备荧光特性外，还必须具有高电子密度，从而能够准确且可靠地关联两幅图像之间的位置。此外，通过冷冻光镜确认标记区域，可在两台显微镜之间实现 ROI 的完全重叠。在深入表征 DNA 压缩过程中的精细结构变化时，这些颗粒与冷冻光镜技术将成为未来实现更稳健、更精确关联不可或缺的工具。
本文介绍了一种通过同步培养、荧光显微镜和高压冷冻电子断层扫描技术相结合的方法，用于表征蓝细菌DNA压缩的瞬态结构。该实验方案重点在于观察压缩状态的DNA。将此方法与上述其他新技术结合，可进一步深入研究DNA压缩过程，而经过适当修改的方法也可广泛应用于细菌中其他动态结构事件的研究。

DNA 压缩是一种在某些蓝细菌中发现的显著胞质事件。当 集胞藻属长集胞藻 在12小时光照/12小时黑暗的培养条件下，DNA在光照期结束时呈现凝聚状态，与其他时间点的形态明显不同1有研究提出，这一过程由基于Kai蛋白的生物钟调控2. Seki 等 有研究报道，用 Hoechst 33342 染色的 DNA 发生了凝聚 S. elongatus 细胞在光周期即将结束时，在荧光显微镜下呈现波浪状杆形。随着细胞分裂，凝聚的DNA在杆状结构中央分离成两部分，最终在每个子细胞中恢复为正常的均匀分布。3然而，由于其瞬时性和在电子显微镜下尺寸较大，阻碍了结构分析。Murata 等 结合了多种方法，包括同步培养、荧光显微镜、快速冷冻和高压电子冷冻断层扫描技术（cryo-HVET），成功鉴定了瞬时DNA压缩结构，包括多聚磷酸体（PPBs）的动力学特征4该论文通过结合实验步骤，以可视化方式详细解释了这一复杂材料。
S. elongatus 呈胶囊状，长度为 2 至 5 µm，宽度约为 0.5 µm，且完美的 DNA 压缩状态仅在活细胞中极短时间内出现。因此，蓝细菌 DNA 压缩过程中发生的结构变化尚不明确。为了通过电子显微镜研究这些结构，必须克服两个主要的技术难题：一是需要在接近天然状态下观察整个细菌这种较厚的样品，二是需要快速固定动态结构。关于第一个问题，电子的非弹性平均自由程（iMFP）取决于电子显微镜的加速电压5。在 300 kV 的透射电子显微镜（TEM）中，该值小于 350 nm。例如，当在 200 kV TEM（iMFP ≈ 250 nm）下观察冰包埋的蓝细菌（样品厚度 ≈ 600 nm）时，细胞内部结构难以清晰成像。相比之下，1 MV TEM（iMFP ≈ 500 nm）能够提供贯穿整个细胞的细胞质结构图像（图 1）。在本实验方案中，作为解决方案的一部分，采用了加速电压为 1 MV 的高压电子显微镜（HVEM）。然而，全球具备 HVEM 设施的机构极为有限。讨论部分也探讨了可能的替代方案。第二个问题通过冷冻电子显微镜技术（cryo-EM）得以解决。该技术是一种在接近天然条件下可视化动态结构的强大工具，其通过快速冷冻装置将样品在液态乙烷中迅速冷冻，从而以最少的修饰直接观察冻结瞬间的状态6。结合断层扫描技术，可从倾斜系列图像中重建三维（3D）结构的快照7。在本实验中，通过在 12 小时光照/12 小时黑暗循环条件下进行同步培养，在 S. elongatus 中重现了 DNA 压缩过程，并通过荧光显微镜监测确定样品冷冻的精确时机。
本文所述方法可广泛应用于细菌细胞内动态结构的研究， 例如 细胞分裂、染色体分离和噬菌体感染，并有望为微生物学研究开辟新的途径。

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342 溶液</td><td>Dojindo</td><td>346-07951</td><td>1mg/mL H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中</td></tr><tr><td>琼脂粉（植物培养用）</td><td>Wako</td><td>016-11875</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Wako</td><td>027-02192</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>四水合氯化锰</td><td>Wako</td><td>139-00722</td><td>99%</td></tr><tr><td>七水合硫酸锌</td><td>Wako</td><td>264-00405</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>钼酸钠</td><td>Wako</td><td>196-02472</td><td>99%</td></tr><tr><td>五水合硫酸铜</td><td>Wako</td><td>039-04412</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>六水合硝酸钴</td><td>Wako</td><td>031-03752</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>硝酸钠</td><td>Wako</td><td>191-02542</td><td>99%</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Wako</td><td>131-00405</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Wako</td><td>036-05522</td><td>98%</td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>Dojindo</td><td>343-01861</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>Wako</td><td>197-01581</td><td>99.8%</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td>99%</td></tr><tr><td>TES（Good&amp;rsquo;s 缓冲液）</td><td>Dojindo</td><td>344-02653</td><td>99%</td></tr><tr><td>柠檬酸铁铵</td><td>Wako</td><td>092-00802</td><td>一级品</td></tr><tr><td>五水合硫代硫酸钠</td><td>Wako</td><td>197-03585</td><td>99%</td></tr><tr><td>BSA 金标记物 15nm</td><td>Aurion</td><td>215.133</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil 电镜载网</td><td>Quantifoil MicroTools</td><td>R3.5/1 铜网</td><td></td></tr><tr><td>电子照相胶片</td><td>Kodak</td><td>SO-163</td><td></td></tr><tr><td>显影剂</td><td>Kodak</td><td>D19</td><td></td></tr><tr><td>定影剂</td><td>Kodak</td><td>Rapid fixer</td><td>溶液</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman</td><td>1 号级</td><td></td></tr><tr><td>生长培养箱</td><td>NKsystem</td><td>LH-100SP</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE 50i</td><td></td></tr><tr><td>高压透射电子显微镜</td><td>Hitachi</td><td>H1250M</td><td></td></tr><tr><td>HVEM 用冷冻样品台</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>浸入式冷冻装置</td><td>Leica</td><td>EM CPC</td><td></td></tr><tr><td>等离子体离子轰击仪</td><td>Vacuum device</td><td>PIB-10</td><td></td></tr><tr><td>液氮储存罐</td><td>Taylor-Wharton</td><td>25LDB</td><td></td></tr><tr><td>显影槽</td><td>Dosaka EM</td><td>TB-3-75</td><td></td></tr><tr><td>平板扫描仪</td><td>Nikon</td><td>Coolscan 9000ED</td><td></td></tr><tr><td>分割软件</td><td>FEI</td><td>Amira</td><td>https://www.fei.com/software/amira</td></tr><tr><td>断层重建软件</td><td>eTOMO</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod</td></tr></tbody></table>

利用高压冷冻电镜断层扫描技术观察蓝细菌中的dna压缩现象

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

本方案描述了如何在蓝细菌中可视化瞬时DNA压缩现象。DNA压缩是一种显著的细胞质事件，最近被发现会在某些蓝细菌细胞分裂前发生。然而，由于细胞体积较大且该过程具有瞬时性，难以对这一结构进行详细研究。为克服这些困难，首先在蓝细菌中可重复地诱导出DNA压缩现象。 集胞藻属长集胞藻 通过12小时光照/12小时黑暗的同步培养法培养PCC 7942。其次，通过荧光显微镜监测DNA压缩状态，并采用快速冷冻法固定样本。第三，利用高压冷冻电镜断层扫描技术以三维（3D）形式可视化DNA压缩细胞的精细结构。该方法体系可广泛应用于细菌中瞬时结构的研究。 例如 细胞分裂，染色体分离，噬菌体感染 等等通过荧光显微镜进行监测，并在适当的时间点利用冷冻电子断层扫描技术直接观察。

在精确同步培养、每12小时光照/黑暗循环的条件下，用Hoechst标记的DNA在黑暗环境中呈现正常的均匀分布（图2a）。然而，在光照期间，DNA在细胞内逐渐凝聚，在光照期结束时呈现波浪状杆状结构（图2b）。最终，该杆状结构在中央分裂（图2c中的箭头所示），其两部分被分配到子细胞中（图2d）。细胞分裂后，凝聚的DNA立即消失，DNA恢复为正常的均匀分布状态。
当含有处于DNA压缩最终阶段的细胞样品立即转移到载有孔的载网上，并在液态乙烷中快速冷冻后，利用1 MV冷冻高压电子显微镜（cryo-HVEM）观察冷冻样品，可清晰看到蓝细菌内部结构的瞬时状态，包括DNA、类囊体膜层、细胞壁以及多聚磷酸盐体（PPBs）（图3a）。许多细胞中可见明显的DNA压缩现象（图3a中的白色箭头），可轻易与正常细胞区分（图3b中的白色箭头标记）。部分细胞在细胞分裂前预期的中部位置出现收缩现象（图3a中的黄色箭头）。
在三维断层图像中，可对细胞的主要细胞器进行分割识别；细胞壁、类囊体膜层、DNA 和多聚磷酸盐体（PPBs）均可被区分（图4）。特别是，致密的 DNA 在细胞质中被一个明显的间隙分隔，该间隙周围包裹着低密度物质，而类囊体膜层则沿着致密 DNA 的波浪状杆状结构发生扭曲。PPBs 的动态行为为首次观察到：在 DNA 致密化的细胞中，大量小型 PPBs 被发现附着于 DNA 上，而在正常细胞中，PPBs 则较大且数量较少。此外，大多数 PPBs 呈成对出现，部分 DNA 似乎正处于从 PPBs 分离的过程中。这表明 PPBs 自身可能通过 DNA 复制被分为两个，并作为 DNA 合成所需磷酸盐的供应源。
<img alt="显微镜图像、细菌细胞、电子显微镜、结构分析、细胞形态学研究" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 冰包埋的正常蓝细菌 S. elongatus PCC 7942 在不同加速电压下的冷冻电镜图像。a) 200 kV 和 b) 1000 kV。比例尺 = 500 nm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="蓝细菌染色体动态的荧光显微镜观察、实验结果、DNA分析方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：蓝细菌 S. elongatus 细胞的荧光显微镜观察。 在12小时光照/12小时黑暗的同步培养条件下培养后，细胞经Hoechst 33342染色。（a） 黑暗状态开始2小时后的细胞显示出均匀的DNA标记。在光照期间，许多细胞内的DNA逐渐发生凝聚，最终形成一条粗大的波浪状棒状结构 （b），这是DNA压缩的典型特征。在此阶段之后，压缩的DNA结构在细胞分裂过程中迅速从中央分裂（箭头），（c），两个片段分别进入子代细胞 （d）。子代细胞在黑暗期再次恢复为均匀的DNA标记。比例尺 = 2 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌细胞显微镜；电子显微镜图像；细胞结构分析；横截面视图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：嵌入无定形冰中的蓝细菌的冷冻高压电子显微镜图像。 （a）显示在0°倾斜角下拍摄的原始图像，图像采集于光照周期结束时。一些细胞显示出波浪状杆形的DNA结构，类似于真核生物的凝缩染色体（白色箭头）。在正常细胞中，蓝细菌在细胞质内表现出可辨识的DNA结构（白色箭头指示）。部分细胞在细胞中央出现缢缩，符合细胞分裂前的预期特征（黄色箭头）。（b）三维断层图像的xy、xz和yz切片。黄色虚线表示切片的交界位置。比例尺 = 2 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌细胞结构的透射电镜图像与三维模型示意图，突出显示内部组分与形态。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：含压缩 DNA 的细胞超微结构。 主要组分已进行分割标注：细胞壁（亮黄色）、类囊体膜（红色）和 DNA（蓝色）。(a) 显示一个三维断层图像的 z 平面切片。(b) 所有分割组分。指示细胞分裂的缩窄部位位于细胞中央（箭头所示）。PPB 以黄色或橙色球体建模；每个橙色球体代表相应最近的黄色球体的对应物。比例尺 = 500 nm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>

本方案描述了如何可视化蓝细菌中瞬时的DNA压缩过程。采用同步培养、荧光显微镜监测、快速冷冻以及高压冷冻电子断层扫描技术。本文介绍了这些方法的操作流程，并讨论了其未来的应用与发展方向。

利用高压冷冻电镜断层扫描技术观察蓝细菌中的DNA压缩现象

本方案描述了如何在蓝细菌中观察瞬时DNA压缩现象。DNA压缩是一种显著的胞质事件，最近被发现可……

该方法有助于解答微生物学领域中的一些关键问题，例如细菌细胞周期过程中DNA结构如何变化。该技术的主要优势在于，无需任何额外处理，即可在适当的时间点观察接近活体状态的完整细菌细胞的超微结构。本次实验操作将由我实验室的博士后研究员 Chihong Song 和 Kaneko 博士实验室的研究生 Mako Hayashi 进行示范。首先在含有1.5%琼脂和0.3%硫代硫酸钠的9厘米无菌BG-11平板上培养蓝细菌。将平板置于23°C、光照强度为每平方米每秒50微爱因斯坦（µE）、光暗周期为12小时光照/12小时黑暗的条件下培养。为维持细胞生长，需每周将其转接至新鲜的BG-11琼脂平板上。一周内，培养物会呈现为绿色条带。使用经火焰灭菌的接种环转移绿色的细胞团块，并在新培养板上划线接种。为观察DNA压缩情况，于光照周期结束时收集培养六天的细胞。为使细胞从培养板上脱落，加入一毫升 0.2 摩尔的蔗糖溶液。随后收集细胞悬液，并重复添加和去除蔗糖溶液，直至溶液变为绿色。溶液颜色变化表明大部分细胞已被释放。现在，将500微升悬浮细胞溶液转移至微量离心管中，加入Hoechst染料，使其终浓度为每毫升1微克。然后，将细胞在避光条件下孵育10分钟。接着，离心收集细胞，弃去上清液，并将细胞重悬于10微升0.2摩尔的蔗糖溶液中。接下来，取一微升悬液转移至载玻片上，加盖盖玻片，并在配备紫外滤光片的荧光显微镜下观察细胞。使用100倍油镜观察，寻找DNA压缩的证据，该现象应在大多数细胞中可见。首先，准备浸入式冷冻装置。然后，通过插入乙烷容器和冷却棒附件来设置液氮容器。接着，向容器中加入液氮，并将其冷却至液氮温度。之后，将乙烷气体充入容器中。务必佩戴护目镜，因为液态乙烷具有爆炸性。最后，取下冷却棒附件，并用塑料盖盖住容器，以防止结霜。接下来，使用等离子离子屏障对碳涂层电镜载网的碳面进行辉光放电处理，电流为50毫安，持续30秒。然后，根据测试方案准备Vitrobot。使用镊子将预处理的电镜载网放入样品室。在加样前，先用一微升、15纳米的BSA金标记物处理电镜载网，作为定位标记。现在，取 2.5 µL 细胞悬液滴加到载网上。用滤纸吸去多余的溶液，并立即在液态乙烷中冷冻载网。将冷冻后的载网保存在液氮中，直至进行观察。接下来，启动高压电子显微镜（HVEM），并将其设置为1兆伏的高电压。然后，使用液氮将样品载网支架冷却至零下150摄氏度。冷却后，将冷冻的载网装入已冷却的低温样品支架中，并将其载入HVEM。注意避免冰污染装置。现在，以1,000倍的低倍率选择成像区域。然后，调节同心z轴高度，并将样品台倾斜至负60度。然后，消除倾斜旋转的回程间隙。现在，以10,000倍的放大倍数在目标位置附近进行聚焦。通过偏离聚焦图像，设置六到十微米的欠焦量。进行成像时，将电子剂量设置为每平方埃每秒两个电子或更低。注意观察反映电流密度的电子剂量，并通过数码相机或电子胶片采集图像。接着，以负60度到正60度的倾斜范围，每隔2至4度收集一次倾斜图像。如果可能，请使用显微镜的自动化功能。打开商业软件包，并加载用于断层重建的倾斜图像。然后，使用命令 tif2mrc 或 newstack 从单个图像创建图像堆栈文件。接下来，启动 eTomo 图形用户界面软件，输入图像参数，包括像素尺寸、标志点直径、图像旋转等，从而创建编辑脚本。现在，使用推荐的软件生成倾斜系列图像，并利用标志点进行对齐，使平均残差误差小于 0.5。最后，使用 SIRT 算法重建三维断层图像。然后从断层图像中提取感兴趣区域，并应用去噪滤波器，例如各向异性扩散滤波器、双边滤波器或数学形态学滤波器。采用能够增强图像对比度的参数进行滤波处理。接下来，分割感兴趣的特征。使用切片功能打开断层图像，然后进入“分割编辑器”窗口，选择一个新的标签域以创建分割文件。然后，在第一层图像中手动描画出目标特征的边界，接着依次描画其他各层图像中的相应边界。可使用相同的操作添加其他感兴趣的目标特征。现在，为了利用 SurfaceGen 菜单中的选项生成表面渲染图像以可视化已分割的体积，选择 SurfaceView 菜单。要移动、旋转和缩放三维图像，请使用三维查看器窗口中的工具。可使用魔棒工具进行自动分割。单击某个对象，然后调节显示和掩膜中的滑块，以确保该对象的特征被完全选中。在精确的同步培养条件下，用Hoechst标记的DNA在黑暗环境中呈现正常的均匀分布，随后在光照期间逐渐在细胞内凝聚，到光照期结束时形成波浪状的杆状结构。最终，该杆状结构在中央分裂，其两部分被分配到子细胞中。细胞分裂后，凝聚的DNA立即消失，DNA恢复为正常的均匀分布状态。当处于DNA压缩最后阶段的细胞被冷冻并使用高压电子显微镜观察时，许多细胞显示出明显的DNA压缩结构，可轻易与正常细胞区分开来。一些细胞在细胞中央出现收缩，符合细胞分裂前的预期特征。从三维断层图像中可见，致密的DNA在细胞质中明显分离，并被低密度物质所包围。类囊体膜层沿着致密DNA的波浪状棒状结构发生扭曲。有趣的是，许多小型磷酸盐体附着在致密的DNA上，通常成对出现。这些多聚磷酸盐体可能是DNA合成所需磷酸盐的供应来源。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过冷冻高压电子显微镜技术，在无需染色等额外处理的情况下，于适当的时间点对处于接近活体状态的完整细菌细胞超微结构进行可视化观察。在进行该实验操作时，需特别注意：在光照周期结束后的每一分钟，DNA 的压缩状态都会发生变化，因此务必确保不错过最佳的样品冷冻时机。在完成此操作后，可进一步采用其他方法（如CLEM），以探究特定蛋白质或核苷酸在压缩DNA中的定位问题。该技术建立后，将为微生物学领域的研究人员探索细菌或小型真核生物中的细胞分裂、DNA分离以及病毒感染等过程提供重要途径。

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生物学

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