高压低温电子层析成像对蓝藻 DNA 压实的可视化研究

这种方法可以帮助回答微生物学领域的关键问题，例如 DNA 结构在细菌的细胞周期中如何变化。该技术的主要优点是可以在适当的时间点可视化接近生活状态的整个细菌细胞的超微结构，而无需任何其他处理。演示该程序的是我实验室的博士后 Chihong Song 和 Kaneko 博士实验室的研究生 Mako Hayashi。

首先在含有 1.5% 琼脂和 0.3% 硫代硫酸钠的 9 厘米灭菌 BG-11 平板上培养蓝藻。在 23 摄氏度下以 12-12 光周期孵育板，每秒每平方米 50 micro-E 的光。为了维持细胞，每周将它们转移到新鲜的 BG-11 琼脂平板上。

在一周内，培养物显示为绿色条带。使用火焰灭菌环转移绿色细胞团块，并将它们划线到新板上。为了观察 DNA 压缩，请在光照期结束时收集培养 6 天的细胞。

要从板中释放细胞，请添加 1 毫升 0.2 摩尔蔗糖。然后，收集细胞悬液，重复蔗糖添加和去除，直到溶液变为绿色。颜色变化表示大多数单元格已被释放。

现在，将 500 μL 悬浮细胞溶液转移到 Microfuge 管中，并添加 Hoechst 染色剂，最终浓度为 1 μg/mL。然后，让细胞在黑暗中孵育 10 分钟。接下来，旋转细胞，弃去上清液，并将它们重悬于 10 微升 0.2 摩尔蔗糖中。

接下来，将一微升悬浮液转移到载玻片上，盖上盖玻片，并在配备紫外线滤光片的荧光显微镜下观察细胞。使用 100 倍油浸物镜，寻找 DNA 压缩的证据，这应该可以在大多数细胞中观察到。首先，准备投入式冷冻装置。

然后，通过插入乙烷容器和冷却棒附件来设置液氮容器。接下来，用液氮填充容器，并将其冷却至液氮温度。之后，将乙烷气体装入容器。

一定要戴安全眼镜，因为液态乙烷具有爆炸性。最后，取下冷却棒附件，用塑料盖住容器，以避免结霜。要继续，使用等离子体离子屏障以 50 毫安的电流对碳涂层 EM 网格的碳侧进行辉光放电 30 秒。

然后，根据测试方案准备 Vitrobot。使用镊子将预处理的 EM 网格设置到腔室中。在应用样品之前，用一微升 15 纳米 BSA 金示踪剂处理 EM 网格作为基准标记。

现在，将 2.5 μL 细胞悬液分装到网格上。用滤纸吸去多余的溶液，并立即在液态乙烷中冷冻网格。将冷冻网格储存在液氮中，直到可以检查它们。

接下来，启动 HVEM，并将其设置为 1 兆伏的高电压。然后，使用液氮将样品网格支架冷却至零下 150 摄氏度。冷却后，将冷冻网格安装到冷却的冷冻样品架中，然后将其加载到 HVEM 中。

注意避免冰块污染装置。现在，以 1， 000 倍的低放大倍率选择一个成像区域。然后，调整偏心 z 轴高度，并将样品台倾斜至负 60 度。

然后，消除倾斜旋转的反冲。现在，以 10， 000 倍的放大倍率聚焦在目标位置附近。通过与聚焦图像的偏差，将下方聚焦设置为 6 到 10 微米。

对于成像，将剂量设置为每秒每平方埃 2 个电子或更低。密切关注电流密度反射的电子剂量，并通过数码相机或电子胶片拍摄图像。接下来，以 2 到 4 度的增量收集从负 60 度到正 60 度的倾斜图像。

如果可能，请使用显微镜的自动化功能。打开商业软件包，并加载用于断层重建的倾斜图像。然后，使用命令 tif2mrc 或 newstack 从单个图像制作图像堆栈文件。

接下来，启动 eTomo GUI 软件，并输入像素大小、基准直径、图像旋转等图像参数。因此，创建编辑脚本。现在，使用建议的软件创建一个倾斜序列，使用基准标记对齐，平均残差小于 0.5。

最后，使用 SIRT 算法重建 3D 断层照片。现在，从断层照片中提取感兴趣的区域，并应用去噪滤波器，例如各向异性扩散滤波器、双边滤波器或数学形态滤波器。使用增强图像对比度的参数执行筛选。

接下来，分割感兴趣的特征。使用切片功能打开断层照片。然后，转到 Segmentation Editor 窗口，并选择新的标签字段以创建分段文件。

然后，在第一个切片中手动追踪感兴趣特征的边界，然后是其他每个切片。可以使用相同的作添加其他感兴趣的功能。现在，要使用 SurfaceGen 菜单中的选项生成表面渲染以可视化分段的体积，请选择 SurfaceView 菜单。

要在 3D 体积中移动、旋转和缩放，请使用 3D 查看器窗口中的工具。可以使用 Magic Wand Tool 完成自动分割。单击对象，然后调整 Display 和 Masking 中的滑块，以便完全选择对象的特征。

在精确的同步培养中，用 Hoechst 标记的 DNA 在黑暗条件下显示出正常的均匀分布，然后在光照期间在细胞内逐渐压缩，在光照周期结束时呈现出波浪状棒状结构。最后，杆状细胞在中心分裂，它的两部分分布到子细胞中。细胞分裂后，压实的 DNA 立即消失，DNA 恢复到正常的均匀分布。

当处于 DNA 压缩最后阶段的细胞被冷冻并使用高压电子显微镜观察时，许多细胞显示出明显的 DNA 压缩，很容易与正常细胞区分开来。正如细胞分裂前所预期的那样，一些细胞中心表现出收缩。从 3D 断层照片中，紧凑的 DNA 在细胞质中明显分离，并被低密度材料包围。

类囊体膜层沿着压实 DNA 的波浪杆扭曲。有趣的是，许多小磷酸盐小体粘附在压缩的 DNA 上，通常成对出现。这些多磷酸盐小体可能是 DNA 合成的磷酸盐供应商。

看完这个视频后，你应该对如何通过冷冻高压电子显微镜在适当的时间点观察接近生活状态的整个细菌细胞的超微结构，而无需任何额外的处理，如染色。在尝试此过程时，重要的是要记住 DNA 压缩的状态在光周期结束时每分钟都在变化。确保您不会错过冷冻样品的最佳时机。

按照此程序，可以执行其他方法，如 CLEM，以回答有关压缩 DNA 中特定蛋白质或核苷酸定位的其他问题。该技术发展后，应该为微生物学领域的研究人员探索细菌或小型真核生物中的细胞分裂、DNA 分离和病毒感染铺平道路。