在录制多细胞行为黏细菌生物膜，使用定时Microcinematography

以下实验的总体目标是开发一种廉价的延时微电影摄影测定法，具有足够的严谨性，以产生可重复和可量化的结果。这是通过使用廉价的可重复使用的硅垫圈来构建 agros 培养基板或显微镜载玻片来实现的。获得的结果表明，这些平板复合物在各种培养基类型和琼脂浓度下保持水合和充分氧合超过一周。

此外，由于延时微电影摄影是一个缓慢的过程，因此使用 8 台廉价显微镜有助于加快数据采集速度。大家好，我是来自雪城大学生物系 Roy Welch 博士实验室的 Ryan Taylor。今天，我们将向您展示在我们的实验室中制作细菌生物膜延时电影的程序，我们将使用此程序来研究 MTI 生物膜的多细胞行为。

那么让我们开始吧。要开始此过程，请用 clut 计测量过夜混合物 Occus sanus 培养物的细胞密度，将 1 毫升培养物转移到 2.5 毫升离心管沉淀中，洗涤并按照随附的书面方案中的说明将细菌重悬于 TPM 培养基中，移液并涡旋以完全重悬沉淀，这可能需要一段时间。接下来，将 0.5 克 aros 添加到 50 毫升 TPM 中，这是检测培养基。

还将 0.5 克 aros 添加到 50 毫升 C-T-T-Y-E 中，这是用于消毒的营养椎间盘培养基高压灭菌器。然后将培养基保持在 55 摄氏度，置于培养箱或水浴中。在构建示踪测定时。

板复合物继续构建营养盘第一火焰灭菌器玻璃显微镜。滑动并在载玻片顶部放置一个 0.5 毫米厚的无菌硅橡胶垫圈。将大约 300 微升 C TT YE 培养基移液到载玻片上垫圈形成的孔中。

C-T-T-Y-E 培养基 agro 应将火焰堆起，对另一张载玻片进行消毒，并将其以一定角度放在 C-T-T-Y-E 培养基 aros 的顶部。将滑块向下倾斜可防止气泡形成。幻灯片就位后，用每侧一个迷你活页夹将复合物丰满。

将剪下的复合物置于 4 摄氏度，让 C-T-T-Y-E 媒体 agro 凝固。这通常需要大约 5 分钟。一旦 agro 设置好，就可以准备用于追踪测定的板复合物。

首先准备用于构建检测复合物的载玻片。对于每个复杂的火焰灭菌的两个玻璃显微镜载玻片。将高压灭菌垫圈放在其中一个载玻片的顶部，以形成测定的底部。

另一个滑轨用于压平 agros 并用作支撑滑轨。测定的顶部是盖玻片。首先用标记胶带包裹显微镜载玻片，然后火焰灭菌器玻璃盖玻片并将其放在灭菌的包装玻片上。

向上滑动包裹的载玻片支撑盖玻片，防止其开裂。用镊子将高压灭菌垫圈放在火焰灭菌的盖玻片的顶部。按下底部载玻片和盖玻片上的垫圈，确保它们与玻璃形成密封。

否则，阵列的介质可能会变干。将滑动垫片和盖板垫片组件放在一边，从这里开始，消毒面朝上，一次只在一个复合物上工作，以防止介质凝固，这会导致电影质量差。首先放置营养盘。

将营养盘复合物从 4 摄氏度中取出。使用带有 100 微升玻璃一次性吸头的微量采样移液器，去除结合、eclipse 和前一部分玻片，暴露出现已固化的 C-T-T-Y-E aros。从 C-T-T-Y-E 培养基 agro 中取出一个直径为 1 毫米的营养盘，并将其放入由盖玻片上的垫圈形成的孔中。

然后从培养箱中取出 TPM 培养基 agros，并将 300 微升移液管放入由盖玻片上的垫圈形成并包含营养盘的孔中。TPM 培养基 Agros 应堆起以压平 T-P-M-S-A 培养基 aros 将其中一个没有垫圈的火焰灭菌载玻片以一定角度放置在 TPM 培养基 aros 的顶部。将载玻片倾斜放置有助于防止气泡形成。

用迷你活页夹将复合物夹在一起，每侧一个。将剪下的复合物置于 4 摄氏度，让介质凝固。这通常需要大约 5 分钟。

培养基凝固后，将复合物从 4 摄氏度中取出。取下活页夹并挤压复合物的末端。要松开缠绕在胶带上的玻片，请取下缠绕在胶带上的玻片并将其放在工作台上以备进一步使用。

然后使用一对镊子作为楔子。将盖滑垫圈 media agros 复合物与支撑滑片分开，并丢弃支撑滑片。不要使用撬动动作来分离盖板衬垫复合物，因为这可能会导致盖板滑移制动和/或介质粘在支撑滑轨上。

卸下支撑载玻片后，将盖玻片垫片介质复合物放在胶带缠绕的载玻片上，垫圈面朝上。将此复合物放在燃烧器旁边，让所有可见的水分从新暴露的 media agros 表面蒸发。不要让介质干燥超过一分钟。

由于这可能会影响 M Zant 的蜂群行为，因此请继续将细胞接种在新制备的测定复合物上。一旦多余的水分从盖玻片垫圈介质中蒸发出来，agros 复合物吸出 0.5 微升浓缩的细胞以沉积在介质上。Aeros 在接近介质区域之前按下移液器吸头。

移液器吸头底部会出现一滴细胞，这使得细胞沉积更容易，而不会让吸头接触培养基。agros 表面的凹陷可以改变 mz 群体的行为。将移液器笔直向下移动，以分配距离嵌入的营养盘约 1 毫米的细胞。

然后将移液器笔直向上拉。通过这种方式，可以确保 swarm 是圆形的。细胞沉积后，将复合物放在燃烧器旁边，让细胞点干燥不超过 20 秒。

干燥后，将形成复合物底部的滑动垫圈组件与盖子上的垫圈对齐。滑动垫片介质 acro cell 复合物形成复合物的顶部。轻轻按压在一起以形成密封。

用 kim 抹布清洁盖玻片中载玻片的表面，以去除任何残留物，以防止冷凝。清洁载玻片后，立即将复合物放在加热的显微镜载物台上，幻灯片向下，盖子滑上。如果已经形成冷凝，则让玻片复合物在加热的载物台上放置几秒钟，然后再启动图像采集软件。

为了准备电影，请在显微镜上选择合适的物镜，2 x x 4 x 或 10 x。打开相机和显微镜并检查光照水平，以确保光线不太强。启动计算机并打开图像采集程序。

单击实时图像窗口并聚焦显微镜。该图像看起来与此处显示的图像类似。开始获取图像。

确保在第一个小时内定期检查焦点，因为培养基琼脂往往会沉淀，导致焦点漂移。图像采集完成后，传输采集的图像进行存储。通过在 90% 乙醇中浸泡过夜或对垫圈进行 TOLA 以重复使用来分解载玻片复合物。

这部延时电影显示了 em 接受此处描述的跟踪测定。捕获速率为每分钟 1 张图像，放大倍数为 20 倍，回放速率为每秒 60 张图像。这段延时视频显示了一个细胞群，其中 1% 的细胞表达 GFP。

这部电影是通过合并交替的相差和荧光图像来编译的。该测定是在 C-T-T-Y-E 上以 1% Aros 捕获速率为每分钟一张图像，放大倍数为 100 倍。这部延时电影展示了 M Anthes 的滑行运动。

该测定是在 1% Aros 捕获速率为每分钟一张图像的 C-T-T-Y 上进行的，放大倍数为 100 倍。这部 TimeLapse 电影展示了 P OSA 抽搐的运动。该测定是在 LB 上以 1% Aros 捕获速率进行的，捕获速率为每分钟一张图像。

放大倍率为 20 倍时，播放速率为每秒 60 张图像。这部延时电影展示了 Smar 感觉到蜂群的运动。该测定是在 LB 上进行的，1% Aris 捕获速率为每分钟一张图像。

放大倍率为 20 倍时，播放速率为每秒 60 张图像。这部延时电影展示了 EGT 滑动运动。该测定是在 0.5% Tag rose 捕获速率为每分钟 1 张图像的 LB 上进行的，因为 20 x 回放速率的放大倍数为每秒 120 张图像，因为 lv 中 0.5%的脆弱性。

该分析使用了图 1 B.中所示的较大垫圈，我们刚刚向您展示了如何生成细菌生物膜的延时电影。执行此过程时。重要的是要记住花点时间并尽可能精确，以获得一致的结果。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。