Name: 在录制多细胞行为黏细菌生物膜，使用定时Microcinematography (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-06T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学习使用低成本可重复利用的硅胶垫片进行延时显微摄影，以观察黄色黏球菌的多细胞群体行为。该方法可在多种培养基和琼脂浓度下保持一周以上的水合与供氧，实现可重复且可量化的实验结果。

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本研究得益于美国国家科学基金会职业奖（MCB-0746066，转录激活因子调控涌现行为的表征）对 R.D.W. 的资助。
我们感谢 L. J. Shimkus、B. S. Goldman、G. Suen、M. Singer、L. G. Welch、K. A. Murphy 和 H. G. Taylor 对本文手稿提出的有益讨论和意见。

所需材料：
<ul>
 <li>Klett 比色计</li>
 <li>移液器及吸头</li>
 <li>2.5 ml 微量离心管</li>
 <li>微量离心机</li>
 <li>CTTYE 培养基：
 <ul>
 <li>1.0% Casitone（Difco Laboratories），0.5% 酵母提取物（Difco Laboratories）</li>
 <li>10.0 mM Tris-HCl（pH 8.0），1.0 mM KH2PO4，8.0 mM MgSO4</li>
 </ul>
 </li>
 <li>TPM 培养基：
 <ul>
 <li>10.0 mM Tris-HCl（pH 8.0），1.0 mM KH2PO4，8.0 mM MgSO4</li>
 </ul>
 </li>
 <li>琼脂糖</li>
 <li>设定为 55°C 的水浴锅</li>
 <li>玻璃显微镜载玻片</li>
 <li>大型玻璃盖玻片</li>
 <li>2 x 2 cm，0.5 mm 厚的硅胶垫片（Grace Bio-Lab Inc.）</li>
 <li>Parafilm 封口膜（或标签胶带）</li>
 <li>镊子</li>
 <li>小型文件夹夹子</li>
 <li>微量取样移液器（Fisher）</li>
 <li>100 μl 一次性玻璃吸头（Fisher）</li>
 <li>吸水纸（Kimwipes）</li>
</ul>
第1部分：细胞准备
首先创建一个无菌环境。
<ul>
 <li>清洁工作区，戴上手套，并点燃 burner。</li>
</ul>
<ol>
 <li>通过将细胞接种至含有 CTTYE 肉汤的锥形瓶中，并在 32°C 黑暗条件下剧烈振荡培养，启动过夜培养。</li>
 <li>当培养物密度达到 5 x 108 个细胞/毫升时，用移液器将 1 毫升细胞转移至 2.5 毫升微量离心管中。</li>
 <li>以 16,000 × g（或最大转速）离心 2 分钟，使细胞沉淀。</li>
 <li>倾去并弃除上清液。</li>
 <li>用 1 毫升 TPM（盐平衡、无营养成分培养基）洗涤细胞沉淀。
 <ul>
 <li>重新悬浮并涡旋振荡</li>
 </ul>
 </li>
 <li>再次以 16,000 × g（或最大转速）离心 2 分钟，使细胞重新沉淀。</li>
 <li>倾去并弃除上清液。 
 
 关键步骤 
 
 </li>
 <li>使用移液和涡旋振荡相结合的方法，将沉淀完全重悬于 100 μl TPM 培养基中。 
 
 重要提示：此步骤确保管中无细胞团块残留。该过程可能需要一定时间。</li>
 <li>在准备追踪分析平板期间，将细胞置于室温下静置。</li>
</ol>
第2部分：琼脂制备
<ol>
 <li>准备 50 ml 的 TPM（检测培养基）和 CTTYE（营养琼脂）培养基。</li>
 <li>向每种培养基中加入 0.5 g 琼脂糖（琼脂糖比琼脂的光散射更少）。</li>
 <li>高压灭菌以实现灭菌。</li>
 <li>灭菌后，在构建趋迹检测平板复合物时，将培养基置于 55°C 的培养箱（或水浴）中保温。</li>
</ol>
第3部分：营养盘构建
<ol>
 <li>将一个无菌的0.5 mm厚硅胶垫片置于经火焰灭菌的玻璃显微镜载玻片顶部，形成一个小孔。</li>
 <li>用移液器将约300 μl的55°C CTTYE培养基/琼脂糖加入载玻片上由垫片形成的、含有营养盘的小孔中。CTTYE培养基/琼脂糖应呈隆起状。</li>
 <li>将一块经火焰灭菌的载玻片（无垫片）盖在CTTYE培养基/琼脂糖上。 
 
 重要提示：必须以倾斜角度放置此载玻片，以防止产生气泡。</li>
 <li>载玻片就位后，用小型长尾夹从两侧夹紧整个组件，每侧一个夹子。</li>
 <li>将夹好的组件置于4°C环境中，使CTTYE培养基/琼脂糖凝固。通常需要约5分钟。</li>
</ol>
第4部分：追踪实验准备——建立孔板复合物
组装组件，制备载玻片复合物，放置营养盘，倒入TPM培养基/琼脂糖，分离并干燥培养板复合物，接种细胞，组装追踪分析用培养板复合物。
组装板复合组件
<ol>
 <li>针对每个复合物，用火焰灭菌一块玻璃载玻片</li>
 <li>将一个经高压灭菌的垫圈放置在载玻片上，并置于一旁（灭菌面朝上）。这将构成检测的底部。</li>
 <li>用火焰灭菌一块玻璃盖玻片，并将其放置在另一块用标签胶带（或Parafilm）包裹的玻璃载玻片上，然后置于一旁（灭菌面朝上）。此载玻片作为支撑，防止盖玻片破裂。这将构成检测的顶部。</li>
 <li>用火焰灭菌第三块玻璃载玻片，并置于一旁（灭菌面朝上）。该载玻片将用于压平琼脂糖。 
 
 重要提示：务必使用镊子用力按压垫圈，确保其与玻璃之间形成密封，否则培养基/琼脂糖可能干涸。</li>
</ol>
放置营养盘
重要提示：第5至第10步必须一次对一个载玻片复合物进行操作；否则培养基/琼脂糖可能开始凝固，导致成像质量下降。
<ol start="5">
 <li>从4°C取出营养盘复合物（第3部分步骤5），将载玻片分开，暴露出已凝固的CTTYE/琼脂糖。</li>
 <li>使用带有100 μl玻璃一次性吸头的微型取样移液器，从上述CTTYE培养基/琼脂糖孔中取出直径为1 mm的“营养盘”，并将其放入盖玻片密封垫圈所形成的孔中（见上述步骤3）。</li>
</ol>
倒平板
关键步骤
<ol start="7">
 <li>用移液器将约 300 μl 的 55°C TPM 培养基/琼脂糖加入盖玻片上的密封圈所形成的孔中，并覆盖营养盘。TPM 培养基/琼脂糖应呈隆起状。 
 
 关键步骤</li>
 <li>将经火焰灭菌且无密封圈的载玻片（来自步骤 3）盖在 TPM 培养基/琼脂糖上方。 
 
 重要提示：必须以一定角度放置该载玻片，以防止产生气泡。 
 
 </li>
 <li>待载玻片（来自步骤 5）就位后，使用小型长尾夹从两侧夹紧整个装置。</li>
 <li>将夹好的装置置于 4°C 环境中，使培养基/琼脂糖凝固。此过程通常需要约 5 分钟。</li>
</ol>
分离并干燥培养板
重要提示：为防止培养基/琼脂糖干燥，步骤11至20每次仅能对一个载玻片复合体进行操作。 
 
 重要提示：为获得最佳结果，步骤11至13应在4°C下进行。
<ol start="11">
 <li>待培养基/琼脂糖凝固后，取下文件夹夹，并挤压复合物末端以松开缠有胶带的载玻片。</li>
 <li>取下缠有胶带的载玻片，将其放置于实验台上以备后续使用。 
 
 关键步骤</li>
 <li>使用镊子作为楔子，将盖玻片/垫圈/培养基/琼脂糖复合物从无垫圈的支撑载玻片上分离，并弃去支撑载玻片。 
 
 重要提示：切勿使用撬动方式分离盖玻片/垫圈复合物，否则可能导致盖玻片破裂和/或培养基/琼脂糖黏附在支撑载玻片上。</li>
 <li>将盖玻片/垫圈/培养基/琼脂糖复合物放置于缠有胶带的载玻片上（垫圈面朝上），并从4°C环境中取出。将该复合物置于火焰旁，使新暴露的培养基/琼脂糖表面可见的水分完全蒸发，时间不超过1分钟。 
 
 重要提示：切勿让培养基/琼脂糖干燥过久，否则可能影响M. xanthus的群集行为。</li>
</ol>
接种细胞
关键步骤
<ol>
 <li>当多余水分蒸发后，用移液器将0.5 μl浓缩细胞（第1部分步骤8所得）加到培养基/琼脂糖表面，位置应距离营养盘约1 mm。 
 
 重要提示：务必确保移液时将移液器垂直向下移动，然后垂直向上提起。这可保证菌群扩散呈圆形。 
 
 重要提示：切勿让移液器枪头接触培养基/琼脂糖表面。否则会在表面形成凹陷，改变M. xanthus菌群的扩散行为。 
 
 提示：在接近培养基/琼脂糖前先压下移液器按钮，使细胞液滴预先出现在枪头底部，有助于更准确地释放细胞。</li>
 <li>细胞接种完成后，将培养装置置于火焰旁，使细胞液滴干燥，时间不超过20秒。</li>
</ol>
组装检测体系
<ol>
 <li>细胞点干燥后，将载玻片/垫片复合物（来自步骤1）与盖玻片/垫片/培养基/琼脂糖/细胞复合物（来自步骤13）上的垫片对齐，并轻轻按压以形成密封。 
 
 关键步骤</li>
 <li>用无尘纸擦拭载玻片和盖玻片表面，去除石蜡膜残留物。完成后的检测装置应与图1相似。</li>
 <li>擦拭后（步骤15），立即将完成的载玻片复合物放置于维持在32°C的加热载物台上（载玻片朝下，盖玻片朝上），以防止冷凝水形成。若已产生冷凝水，请将载玻片复合物在加热载物台上静置数秒，再启动图像采集软件。</li>
 <li>选择合适的物镜（2X、4X 或 10X）。</li>
</ol>
第5部分：影片制备
关键步骤
<ol>
 <li>打开相机和显微镜，检查光照强度（确保光线不过强）。启动计算机并打开图像采集程序。</li>
 <li>点击实时图像窗口并调节显微镜焦距。图像应与图3所示相似，注意观察均匀的琼脂表面。</li>
 <li>开始采集图像。 
 
 关键步骤</li>
 <li>在最初一小时内定期检查焦距，因为培养基/琼脂容易沉降，导致焦距漂移。</li>
 <li>清洁工作区域。</li>
 <li>图像采集完成后，将采集的图像转移至存储设备，并将载玻片组件浸泡于90%乙醇中过夜，以进行拆解。</li>
 <li>将垫圈进行高压灭菌处理，以便重复使用。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig1.jpg" alt="琼脂细胞培养装置示意图，显示两种带垫圈和气隙的细胞培养腔室设计。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. TM平板复合体的示意图。（A）为TM平板复合体的爆炸视图及横截面图。（B）显示使用较大垫圈的情况。
<img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig2.jpg" alt="显微镜网络示意图；用于计算机集成分析、图像采集和研究的光学装置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 显微镜集群。每个显微镜节点（插图）由一台尼康 E400 显微镜、物镜、加热载物台、Insight 相机和一台笔记本电脑组成。各个节点相互联网，并连接至一台主控计算机。其中两个节点配备了荧光成像功能，包括 EXFO 光源和两个 Uniblitz 快门。
<img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig3.jpg" alt="显微镜下的细胞；细胞结构的显微图像；生物学研究；显微技术。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
 图3. 追踪实验装置在时间=0时的20倍放大图像。比例尺，1 mm。
<img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig4.jpg" alt="精子相互作用、受精阶段A-D，显微镜下观察细胞过程的显微图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
 图4. TM培养皿复合体的适应性。（A）M. xanthus在含1.0%琼脂的CTTYE培养基上滑行运动的100倍放大图像。（B）P. aeruginosa在含1.0%琼脂的LB培养基上抽搐运动的20倍放大图像。（C）S. marcescens在含1.0%琼脂的LB培养基上群集运动的20倍放大图像。（B）和（C）均在含1.0%琼脂的LB培养基上进行检测。（D）M. smegmatis在含0.5%琼脂的LB培养基上滑动运动的40倍放大图像。该图像采用图1B所示的替代检测配置拍摄。
视频 1. 群体在追踪实验中受处理的时间延时视频。
视频 2. 一个 M. xanthus 群体的延时视频，其中 1% 的细胞带有荧光标记。通过采集并叠加明场相差图像与荧光图像，以阐明荧光标记细胞在群体中的位置。该视频在 CTTYE 培养基含 1.0% 琼脂上拍摄。
视频 3. M. xanthus 滑行运动的延时视频。该视频在 CTTYE 培养基中含 1.0% 琼脂的条件下拍摄。
视频 4. P. aeruginosa 菌群抽搐运动的时间推移视频。该视频在含有 1.0% 琼脂的 LB 培养基上拍摄。
视频 5. S. marcescens 群集运动的延时视频。该视频在 LB 培养基含 1.0% 琼脂上拍摄。
视频 6. M. smegmatis 滑动运动的延时视频。该视频采用图 1B 所示的替代实验装置，在含 0.5% 琼脂的 LB 培养基上拍摄而成。

<ol><li>Taylor, R. G., Welch, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+as+an+emergent+property+of+a+swarm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis as an emergent property of a swarm.</a> J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).</li>
<li>Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+of+Myxococcus+xanthus+During+Fruiting+Body+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation.</a> J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).</li>
<li>Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+pole-to-pole+oscillations+of+a+bacterial+gliding+motility+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein.</a> Science. 310, 855-857 (2005).</li>
<li>Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+surface+migration%2C+and+other+dynamic+behavior+in+bacterial+biofilms+revealed+by+digital+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging.</a> Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).</li>
<li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+as+microbial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li>
<li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+and+twitching+motility+are+necessary+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).</li>
<li>Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substratum-induced+morphological+changes+in+a+marine+bacterium+and+their+relevance+to+biofilm+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure.</a> J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).</li>
<li>Dworkin, M., Eide, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myxococcus+xanthus+does+not+respond+chemotactically+to+moderate+concentration+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients.</a> J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).</li>
<li>Dworkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactic+behavior+of+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tactic behavior of Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 154, 452-459 (1983).</li>
<li>Wu, S. S., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+expression+of+the+pilA+gene+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).</li>
<li>Bustamante, V. H., Martínez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Frz+signal+transduction+system+of+Myxococcus+xanthus+shows+the+importance+of+the+conserved+C-terminal+region+of+the+cytoplasmic+chemoreceptor+FrzCD+in+sensing+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals.</a> Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

延时显微电影摄影技术（TM）已成为研究原核生物运动性的标准方法2-7。传统上，TM 采用滤纸条、薄层琼脂垫或琼脂块作为基质8-11。当仅需生成用于一般性展示细菌运动的图像序列时，这些方法足够有效且成本低廉。然而，若图像序列需用于生成可重复且定量严谨的数据，则这些方法耗时较长且可靠性有限。例如，人为操作误差导致的技术差异可能引发多种不准确结果，从琼脂表面不平整显著影响被研究细菌的行为，到检测基质一侧与另一侧之间焦平面不一致等问题。为解决这些难题，我们设计了一种 TM 培养皿组件，其具备足够一致的质量，可通过使用廉价且可重复使用的硅胶垫圈实现可重复的实验结果（图 1）。此外，该培养皿组件具有高度可改装性，并已在多种培养基类型和琼脂浓度条件下证实可维持超过一周的充分水合与氧气供应。
为了便于生成延时电影，配备了8台尼康E400显微镜，每台均装配有2X、4X和10X物镜。此外，每台显微镜还配备了一台Insight相机（Diagnostic Instruments, Inc.）和一个加热载物台（20/20 Technologies）。每台相机均连...

<table><tbody><tr><td>1.0% 胰酪蛋白胨</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% 酵母提取物</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;l 玻璃一次性吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 × 2 cm，0.5 mm 厚硅胶垫片</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

记录多细胞行为 myxococcus xanthus 使用延时显微电影技术研究生物膜

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

δ-变形菌Myxococcus xanthus的群体包含数百万个细胞，这些细胞作为一个整体，通过一系列信号协调运动，以响应环境线索，形成复杂而动态的模式。这些模式是自组织且涌现性的，无法通过观察单个细胞的行为来预测。利用延时显微电影追踪分析法，我们鉴定出M. xanthus中一种独特的涌现性模式，称为趋化性，即群体沿营养物质浓度梯度定向移动至其来源的过程1。
为了通过延时显微电影技术高效地表征趋化性，我们开发了一种高度可调节的培养板复合装置（图1），并构建了一个包含8台显微镜的阵列（图2），每台显微镜均能够采集延时视频。该检测方法具有足够的严谨性，可实现可量化数据的稳定重复，所得视频使我们能够观察并追踪群体运动行为中的细微变化。视频采集后，将被传输至一台具备充足内存的分析/存储计算机，以处理和保存数千个视频。该系统的灵活性已被证明对中国台湾M. xanthus研究群体中的多个成员具有重要价值。

为了研究Myxococcus xanthus的群体运动行为，我们设计了一种可针对不同实验进行调整的时间序列显微摄影方案。该方法采用适用于显微观察的标准培养条件，并通过使用廉价且可重复利用的硅胶垫片，获得可重复的实验结果。我们已利用此方法对多细胞趋化性进行了定量分析。

记录多细胞行为 Myxococcus xanthus 使用延时显微电影技术研究生物膜

δ-变形菌 Myxococcus xanthus 的群体包含数百万个细胞，这些细胞作为一个整体发挥作用，通过一系列协调机制协同运动。

以下实验的总体目标是建立一种低成本的时间推移显微电影分析方法，具有足够的严谨性以产生可重复且可量化的结果。该方法通过使用廉价且可重复使用的硅胶垫圈来构建琼脂培养基平板或显微镜载玻片而实现。实验结果表明，这些平板复合体在多种培养基类型和琼脂浓度条件下，能够保持水分和充分的氧气供应超过一周时间。此外，由于延时显微摄影是一个耗时较长的过程，使用八台价格较低的显微镜有助于加快数据采集速度。大家好，我是来自雪城大学生物学系Roy Welch博士实验室的Ryan Taylor。今天我们将向大家展示在本实验室中制作细菌生物膜延时影像的实验流程，并将利用该方法研究MTIs生物膜的多细胞行为。那么，让我们开始吧。首先，使用分光光度计测量过夜培养的恶臭假单胞菌（Occus sanus）培养物的细胞密度，取1毫升培养物转移至2.5毫升离心管中，离心形成菌体沉淀，用TPM培养基洗涤并重悬细菌，具体操作详见随附的书面实验方案。使用移液器吹打并涡旋振荡，以彻底重悬菌体沉淀，此过程可能需要一定时间。接下来，向50毫升TPM（即检测用培养基）中加入0.5克阿拉伯糖（aros）。同时将0.5克aros加入50毫升C-T-T-Y-E中，C-T-T-Y-E为营养琼脂培养基，需经高压灭菌。然后将培养基置于培养箱或水浴中，保持55摄氏度。在构建追踪实验时进行上述操作。将平板复合物置于营养盘上，先用火焰灭菌玻璃显微镜。在载玻片上放置一个无菌的、厚度为0.5毫米的硅橡胶垫圈。用移液器吸取约300微升CTT YE培养基，加入由垫圈在载玻片上形成的孔中。将C-T-T-Y-E培养基琼脂堆成小丘状，火焰灭菌另一张载玻片，并将其倾斜地放置在C-T-T-Y-E培养基琼脂上。倾斜放置载玻片可防止气泡形成。载玻片就位后，用小型 binder 夹在两侧夹紧固定。将剪切好的复合物置于 4°C 环境中，使 C-T-T-Y-E 培养基琼脂凝固，通常需要约五分钟。琼脂凝固后，即可准备追踪实验中所用的平板复合物。首先准备用于构建检测复合物的载玻片。每个复合物使用两片玻璃显微镜载玻片，并用火焰灭菌。将一个高压灭菌垫圈置于其中一片载玻片上，作为检测装置的底部。另一张载玻片用于压平琼脂糖并作为支撑载玻片。检测装置的顶部为盖玻片。首先用标签胶带包裹一张显微镜载玻片，然后对玻璃盖玻片进行火焰灭菌，并将其放置在已灭菌的包裹载玻片上方。向上推动包裹的载玻片支架，使盖玻片保持稳定，防止其破裂。用镊子将高压灭菌垫圈放置在经火焰灭菌的盖玻片顶部。按压底部载玻片和盖玻片上的垫圈，确保它们与玻璃之间形成密封。否则，培养基阵列可能会干涸。将载玻片垫圈和盖玻片垫圈组件放置一旁，灭菌面朝上，此后每次仅操作一个复合体，以防止培养基琼脂凝固，否则将导致成像质量下降。首先放置营养盘。从4摄氏度中取出营养盘复合物。移除封闭夹具，然后用带有100微升玻璃一次性吸头的微型取样移液器，将载玻片分开，暴露已凝固的C-T-T-Y-E琼脂。同时，从C-T-T-Y-E培养基琼脂中取出一个直径为1毫米的营养盘，并将其放入盖玻片密封垫圈所形成的孔中。然后从培养箱中取出TPM培养基琼脂，用移液器将300微升加入盖玻片上的密封圈所形成的孔中，孔内含有营养盘。TPM培养基琼脂应堆叠至使T-P-M-S-A培养基琼脂表面变平。取一片经火焰灭菌且无密封圈的载玻片，以一定倾斜角度放置在TPM培养基琼脂上方。倾斜放置载玻片有助于防止气泡形成。使用小型活页夹在复合物两侧各夹一个，将其固定在一起。将夹好的复合物置于 4 摄氏度环境中，静置使培养基凝固。此过程通常需要约五分钟。待培养基凝固后，将复合物从4°C取出。取下长尾夹，并挤压复合物末端。为松开缠绕胶带的载玻片，需取下胶带缠绕的载玻片，并将其放置于实验台上以备后续使用。然后使用一对镊子作为楔子，将盖玻片-垫圈-培养基琼脂复合物从载玻片上分离，并丢弃载玻片。分离盖玻片-垫圈复合物时，不得使用撬动动作，以免导致盖玻片破裂或培养基琼脂粘附在载玻片上。取下支撑载玻片后，将盖玻片-垫圈-培养基琼脂复合物放置到用胶带包裹的载玻片上，垫圈面朝上。将此复合物置于燃烧器旁，使新暴露的培养基琼脂表面所有可见水分蒸发。切勿让培养基琼脂干燥超过一分钟。由于这可能影响 M Zant 的群集行为，请将细胞接种到新制备的检测复合物上。待盖玻片垫圈培养基琼脂复合物中的多余水分蒸发后，吸取0.5 µL浓缩细胞并接种至培养基上。在接近培养基琼脂复合物时，应先按压移液器尖端以排出气溶胶。在移液器吸头底部出现一滴细胞液，便于将细胞滴加到培养基表面时避免吸头接触琼脂。琼脂表面的凹陷可能改变菌群的迁移行为。将移液器垂直向下移动，将细胞滴加在距离嵌入的营养片约一毫米的位置。然后将移液器垂直向上拔出。通过这种方式，可确保菌群呈圆形。细胞接种后，将培养皿置于火焰旁，使细胞液滴干燥，时间不超过20秒。干燥后，将形成复合物底部的载玻片垫圈组件与盖片上的垫圈对齐。插入形成复合物顶部的垫圈培养基跨细胞复合物。轻轻按压使其紧密结合。使用无尘纸擦拭载玻片和盖玻片表面，去除任何残留物，以防止产生冷凝。清洁载玻片后，立即将载玻片组件放置于加热的显微镜载物台上，载玻片朝下，盖玻片朝上。若已形成冷凝，需将载玻片组件在加热载物台上静置数秒，然后再启动图像采集软件。为准备拍摄视频，请在显微镜上选择合适的物镜，如 2×、4× 或 10×。打开相机和显微镜，并检查光照强度，确保光线不过强。启动计算机并打开图像采集程序。单击实时图像窗口并调节显微镜焦距。图像将显示为如下所示的形态。开始采集图像。在开始的1小时内，务必定期检查焦距，因为培养基琼脂容易沉降，导致焦距漂移。图像采集完成后，将获取的图像转移用于存储。通过在90%乙醇中浸泡过夜或使用TOLA处理垫圈，以拆解载玻片组件并实现垫圈的重复使用。该延时录像展示了采用本文所述追踪实验处理的 em。拍摄条件为每分钟采集一帧图像，放大倍数为 20 倍，播放速率为每秒 60 帧。该延时录像展示了一群 eant 细胞，其中 1% 的细胞表达 GFP。该视频通过合并交替的相差图像和荧光图像生成。实验在1% Aros的C-T-T-Y-E上进行，捕获速率为每分钟一张图像，放大倍数为100倍。此延时视频展示了M Anthes的滑行运动。该实验在含有1% Aros的C-T-T-Y-E培养基上进行，采集速率为每分钟一张图像，放大倍数为100倍。此时间延时视频展示了POSA的抽搐运动。该实验在含有1% Aros的LB培养基上进行，采集速率为每分钟一张图像。放大倍数为20倍时，播放速率为每秒60帧。该延时录像显示了Smar感知的群集运动能力。该实验在LB培养基和1%琼脂上进行，采集速率为每分钟1帧。放大倍数为20倍时，播放速率为每秒60帧。该延时录像显示了EGT的滑动运动。该实验在LB培养基中进行，琼脂浓度为0.5%，图像采集速率为每分钟1帧；由于0.5%琼脂在lv中较为脆弱，因此以20倍放大倍数播放时，播放速率设为每秒120帧。本实验采用图一B中所示的较大垫圈。我们刚刚向您展示了如何生成细菌生物膜的时间推移电影。进行此操作时，重要的是要记住务必耐心细致，尽可能精确，以获得一致的结果。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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