从诱导性多能干细胞在悬浮培养中生成肾脏类器官

我们的研究提出了一种利用悬浮培养条件从诱导性多能干细胞高效制备肾类器官的全面方法。我们强调了在诱导阶段初始细胞密度和WNT激动剂浓度的重要性，这将有助于指导类器官研究领域的新研究人员。目前，获得单一高密度的iPSC细胞系仍然存在困难。

批次差异的影响较为明显，尤其是在不同的iPSC细胞系中。每一批次生成的肾类器官可能在形态和大小上存在差异。针对某一特定iPSC细胞系，通常需要进行多次尝试，以确定最佳的初始细胞密度和CHIR浓度。

我们已确定，中间方法的初始分化对成功形成肾类器官至关重要。本方案详细描述了在该过程中如何选择最佳的细胞密度和CHIR浓度，因为不同的iPSC细胞系在细胞增殖和分化能力方面表现出差异。研究人员可利用其iPSC快速生成特定的肾类器官。

根据我们的方案，通过调整细胞密度和CHIR浓度，无疑将有助于所有研究人员专注于肾脏疾病的研究。我们实验室未来的研究目标是优化疾病模型中的该方案，再生新药物并进行药物筛选。在最近五年中，我们实验室将基于患者来源的iPSC和肾脏类器官疾病模型，重点开展各种遗传性肾脏疾病的表观遗传学及细胞靶向药物开发。

首先，用 2 毫升 DPBS 清洗接种在基质膜包被的 6 孔板上的诱导多能干细胞（iPSCs）。使用移液器吸除 DPBS。接着，加入 1 毫升市售的细胞解离溶液，以解离 iPSCs。

然后，将细胞放入37摄氏度的培养箱中孵育5分钟。现在，用移液器将1毫升mTeSR加至iPSCs中，确保细胞已从塑料表面分离。在室温下以400 ×g离心这些细胞3分钟。

重悬细胞沉淀，然后使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。接着，在已包被基底膜基质的6孔板中接种不同密度的细胞。

使用添加了10 µM Rho激酶抑制剂的mTeSR培养基进行培养。将培养板置于37°C的二氧化碳培养箱中过夜培养。次日，吸除mTeSR培养基，并用2 mL DPBS洗涤细胞。

接下来，向细胞中加入2毫升阶段I培养基。然后，将细胞置于37摄氏度培养箱中培养4天。第4天时，移除阶段I培养基，并用2毫升DPBS洗涤细胞。

然后，在细胞中加入 2 mL 的 II 期培养基，之后将细胞按之前条件进行培养。从第 0 天到第 4 天，诱导多能干细胞（iPSCs）迅速扩增，并呈现菱形或三角形形态。细胞融合度在第 7 天前均匀累积，达到 90% 至 100%。

在悬浮培养条件下，聚集体在第7天解离后会自发形成肾单位结构。首先，在第7天的培养中，从iPSC细胞悬液中移除阶段II培养基。随后，用2毫升DPBS洗涤细胞。

向每个孔中加入1毫升细胞解离溶液。然后，将培养板置于37摄氏度的培养箱中孵育5分钟。孵育结束后，向细胞中加入1毫升阶段II培养基，充分混匀，直至细胞从培养表面完全解离。

将细胞悬液收集到15毫升离心管中。然后在室温下以400 ×g离心3分钟。离心后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于2毫升III期培养基中。

轻轻混匀溶液。随后以1:3的比例将细胞悬液接种至6孔低吸附培养板中。将培养板置于37°C、含5%二氧化碳的培养箱内的轨道摇床上。

为了去除悬浮培养中的培养基，首先使用无菌剪刀剪掉1毫升移液枪头的尖端。然后，轻轻晃动6孔板，使类器官集中到孔中央。接着，用准备好的移液枪吸取类器官，并将其转移至15毫升离心管中，静置5分钟。

吸除上清液，确保类器官仍留在管底。随后将III期培养基用移液器加入孔板中，再用移液器轻轻吹打混合液以重悬类器官。

将类器官重新接种至6孔低黏附培养板中。在培养箱中继续以每分钟60转的速度振荡低黏附培养板。第12天时，更换为IV阶段培养基。

肾类器官在聚集培养18天后显示出类似小管的结构，可在明场图像中轻松观察到。已诱导出CD31内皮细胞。葡聚糖被肾类器官的近端小管摄取。