Name: 从诱导多能干细胞中产生悬浮液中的肾脏类器官 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 了解如何利用悬浮培养条件从诱导多能干细胞高效生成肾脏类器官。本研究强调初始细胞密度和WNT激动剂浓度对类器官形成的关键作用，为肾脏发育和疾病研究提供可靠方法。

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我们非常感谢毛和胡实验室所有过去和现在的成员，感谢他们对本项目提出的富有启发性的讨论和重要贡献。感谢中国国家儿童健康临床研究中心给予的大力支持。本研究由国家自然科学基金（项目编号 U20A20351，负责人：Jianhua Mao；项目编号 82200784，负责人：Lidan Hu）、浙江省自然科学基金（项目编号 LQ22C070004，负责人：Lidan Hu）以及江苏省自然科学基金（项目编号 BK20210150，负责人：Gang Wang）提供经费支持。

本研究使用的诱导多能干细胞（iPSCs）购自商业来源。细胞在商品化的基底膜基质包被的培养板上，使用mTeSR培养基进行维持培养（参见材料表）。表1列出了本研究中使用的所有培养基成分。
1. 铺板iPSC细胞以进行分化并诱导后部原始条纹（PS）
<ol>
	<li>用 2 mL DPBS 清洗膜基质包被的 6 孔板中的 iPSCs。使用移液器吸除 DPBS。</li>
	<li>加入1 mL市售的细胞解离溶液（参见 材料表) 以解离iPSCs，并于37 °C孵育5 min。</li>
	<li>加入1 mL mTeSR至iPSCs中，并确保细胞已从塑料培养表面脱落。</li>
	<li>以 400 x g 离心细胞 g 室温（RT）孵育3分钟。重悬细胞沉淀，使用血细胞计数板计数细胞数量。</li>
	<li>在已包被基底膜基质的24孔板或6孔板中接种不同密度的细胞，并使用添加了10 µM Rho激酶抑制剂（Y-27632）的mTeSR培养基进行培养（参见 材料表）。在37 °C CO₂培养箱中培养过夜2 培养箱 
	注意：不同iPSC细胞系诱导PS时，CHIR99021的最佳浓度和适宜的细胞密度各不相同。建议接种一系列不同密度（例如，0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.4 × 10⁵）3 每平方厘米单个细胞）以及7 µM–12 µM浓度范围的CHIR99021。在同一天开始对每种细胞密度和每种CHIR浓度进行诱导分化。在24孔板中确定CHIR99021的最佳浓度和合适的细胞密度，然后在6孔板中扩大培养。本文提供的方案基于6孔板。</li>
	<li>次日，吸除 mTeSR 培养基，并用 2 mL DPBS 洗涤细胞。</li>
	<li>加入2 mL第一阶段培养基（含8-12 µM CHIR99021的干细胞分化培养基）（表1），记为第0天。</li>
	<li>在37 °C培养箱中培养4天，每两天更换一次I期培养基。</li>
</ol>
2. 诱导生肾中间中胚层（IM）
<ol>
	<li>第4天，移除第一阶段培养基，并用2 mL DPBS洗涤。</li>
	<li>向细胞中加入2 mL第二阶段培养基（含200 ng/mL FGF9、1 µg/mL肝素和1 µM CHIR99021的干细胞分化培养基）（表1）。</li>
	<li>在37 °C培养箱中培养，并每隔2天更换一次培养基，直至第7天。</li>
</ol>
3. 在悬浮培养中生成肾类器官
注意：在第0天至第7天的观察期间，细胞状态至关重要。若细胞表现出成功扩增且聚集成堆，且无明显细胞碎片，则表明中间中胚层（IM）已成功诱导，提示可进入下一阶段。然而，若细胞出现早期凋亡，继而发生坏死或破裂，则可能提示CHIR99021浓度或细胞密度不适宜。
<ol>
	<li>第7天，移除第二阶段培养基，并用2 mL DPBS洗涤细胞。</li>
	<li>向每孔加入1 mL细胞解离溶液，在37 °C孵育5分钟，直至在相差显微镜下观察到细胞变圆发亮。</li>
	<li>用移液器向细胞中加入1 mL第二阶段培养基，混匀，确保细胞已从培养表面脱离。</li>
	<li>将细胞悬液收集至15 mL离心管中，在室温下以400 × g离心3分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于2 mL第三阶段培养基中（含200 ng/mL FGF9、1 µg/mL肝素、1 µM CHIR99021的干细胞分化培养基，溶于0.1%甲基纤维素（MC）和0.1%聚乙烯醇（PVA）中），并补充10 µM Rho激酶抑制剂（Y-27632）（见材料表），轻轻混匀。</li>
	<li>混匀细胞悬液后，按1:3的比例接种至6孔低黏附培养板中。将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱内的轨道摇床上（耐CO2，转速60 rpm）。</li>
	<li>24小时后，移除Rho激酶抑制剂（Y-27632），更换为第三阶段培养基（干细胞分化培养基补充200 ng/mL FGF9、1 µg/mL肝素、1 µM CHIR99021、0.1% MC、0.1% PVA）。继续培养2天。按照以下步骤更换悬浮培养中的培养基：
	<ol>
		<li>使用无菌剪刀剪去1 mL移液枪头的尖端。</li>
		<li>轻轻摇动6孔板，使类器官聚集于孔中央。</li>
		<li>用准备好的移液枪将类器官吸至15 mL离心管中，静置5分钟。</li>
		<li>吸走上清液，保留类器官于管底。</li>
		<li>加入新鲜培养基重悬类器官，并重新接种回6孔低黏附培养板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>继续在培养箱中以60 rpm振荡低黏附培养板。每隔两天更换一次第三阶段培养基，直至第12天。</li>
	<li>第12天，将培养基更换为第四阶段培养基（含0.1% MC和0.1% PVA的干细胞分化培养基）。</li>
	<li>每隔两天更换一次培养基，直至第25天。类器官可在第12至25天期间逐渐发育为成熟的肾单位结构。</li>
</ol>
4. 肾类器官的免疫荧光染色
<ol>
	<li>将肾类器官收集至15 mL离心管中，并用2 mL PBS洗涤。</li>
	<li>静置5–10分钟后，用新鲜配制的2%多聚甲醛（PFA）在4 °C固定肾类器官20分钟。</li>
	<li>去除PFA，加入含0.3% Triton X-100的PBS（0.3% PBST）1 mL洗涤类器官，在摇床上均匀振荡（转速不超过60 rpm）8分钟，静置5分钟后吸去上清液。重复此步骤三次。 
	注意：类器官可在4 °C条件下保存于0.3% PBST中2–4周。</li>
	<li>将固定的类器官与含10%驴血清的PBST（封闭液）（见材料表）在4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用封闭液按1:300比例稀释一抗（见材料表）。</li>
	<li>将类器官与一抗在4 °C条件下避光孵育过夜，并持续振荡。 
	注意：确保同一类器官中的肾小球和肾小管可同时被染色。</li>
	<li>用1 mL 0.3% PBST洗涤类器官，在摇床上均匀振荡（转速不超过60 rpm）8分钟，静置5分钟后吸去上清液。重复此步骤三次。</li>
	<li>将类器官与二抗（见材料表）及DAPI在4 °C避光孵育过夜，并持续振荡，随后重复步骤4.7。 
	注意：二抗和DAPI均用封闭液稀释，二抗稀释比例为1:400，DAPI为1:1000。</li>
	<li>染色完成后，依次用甲醇（25%、50%、75%和100%，每步5分钟）对类器官进行脱水处理，然后用苯甲醇与苯甲酸苄酯混合液（BABB，1:2）通透5分钟（见材料表）。</li>
	<li>将透明化处理后的类器官置于玻璃底培养皿（见材料表）中，使用共聚焦显微镜观察。 
	&#8203;注意：成像时应选择底部为玻璃的培养皿；通透时可直接将BABB加入培养皿中，以保持皿底湿润。</li>
</ol>
5. 体外 葡聚糖摄取实验
<ol>
	<li>第25天，在37 °C、5% CO2的培养箱中，用100 µg/mL的荧光标记葡聚糖（参见材料表）孵育类器官4小时。</li>
	<li>4小时后，更换新鲜培养基，并使用宽场荧光显微镜拍摄活细胞培养图像。</li>
</ol>

Using Induced Pluripotent Stem Cell Suspension for Kidney Organoid Production

<ol><li>Tekguc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids%3A+a+pioneering+model+for+kidney+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases.</a> Translational Research. 250, 1-17 (2022).</li>
<li>Hill, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+chronic+kidney+disease+-+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis.</a> PLOS ONE. 11 (7), 0158765(2016).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).</li>
<li>Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li>
<li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6 (1), 8715(2015).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osr1+expression+demarcates+a+multi-potent+population+of+intermediate+mesoderm+that+undergoes+progressive+restriction+to+an+Osr1-dependent+nephron+progenitor+compartment+within+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney.</a> Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).</li>
<li>SaxOn, L., Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+organogenesis+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Early organogenesis of the kidney.</a> Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).</li>
<li>Kobayashi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six2+defines+and+regulates+a+multipotent+self-renewing+nephron+progenitor+population+throughout+mammalian+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development.</a> Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).</li>
<li>Boyle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+using+Cited1-CreERT2+mice+demonstrates+that+the+cap+mesenchyme+contains+self-renewing+progenitor+cells+and+gives+rise+exclusively+to+nephronic+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia.</a> Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).</li>
<li>Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+kidney+organoids%3A+progress+and+remaining+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Human kidney organoids: progress and remaining challenges.</a> Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).</li>
<li>Kumar, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+micro-organoids+in+suspension+culture+as+a+scalable+source+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells.</a> Development. 146 (5), 172361(2019).</li>
<li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li>
</ol>

作者声明不存在潜在的利益冲突。

本文详细描述了由iPSCs生成肾类器官的实验方案，涉及基础培养基、初始细胞密度以及CHIR99021浓度的微小调整。在多项实验中，成功生成肾类器官的关键因素被确定为中间中胚层（IM）的初始分化以及第7天时的细胞状态。此外，不同的iPSC细胞系在细胞增殖能力和分化潜能方面存在差异，导致其最佳细胞密度和CHIR99021浓度各不相同5,13,14。因此，确定每种iPSC细胞系的理想培养条件，对于从患者特异性iPSCs中大量生成肾类器官至关重要。
为了确定最佳条件，建议先使用24孔板进行预实验，再将培养规模扩大至6孔板以进行更大规模的生产。此步骤可使研究人员根据细胞形态和数量评估诱导效果。此外，类器官在固定后可保持其完整结构长达2至4周，从而提高了该方法的可行性和实用性。
采用本方案生成的肾类器官通常直径约为50–300 µm，在明场显微镜下可观察...

肾脏在维持生理稳态中发挥关键作用，其功能依赖于基本功能单位肾单位。肾单位能够排泄代谢废物，并调节体液成分。由遗传性突变或其他高危因素引起的慢性肾脏病（CKD）最终将进展为终末期肾病（ESKD）。1,2. 终末期肾病显然源于肾单位有限的再生能力，因此需要进行肾脏替代治疗。人诱导多能干细胞的定向分化使得 体外 生成患者特异性的三维肾脏类器官，可用于研究肾脏发育、构建患者特异性疾病模型以及进行肾毒性药物筛选3,4.
在胚胎发育过程中，肾脏起源于中间中胚层（IM），而中间中胚层由原条（PS）分化而来。经典的WNT信号通路可能在FGF（FGF9、FGF20）和BMP（通过JNK通路的Bmp7信号）的协同作用下，进一步诱导IM的分化5,6,7。这些信号通路产生两种重要的肾祖细胞（NPC）群体：输尿管芽（UB）和后肾间充质（MM），分别形成集合管和肾单位8,9。每个肾单位由肾小球和肾小管节段组成，包括近端小管、远端小管以及亨利氏袢10,11。根据上述理论，目前发表的实验方案通过模拟信号级联反应和生长因子刺激，以诱导生成肾脏类器官5,12。
近年来，已开发出多种将人iPSCs分化为肾类器官的方案5,6,7,12。Takasato等7优化了在替换为FGF9之前使用CHIR（WNT激动剂）处理的时间。根据其方案，在iPSCs中诱导中间中胚层（IM）最有效的方法是使用CHIR处理4天，随后使用FGF9处理3天。他们在实验中采用Transwell滤膜作为培养体系；然而，该方法对初学者而言较难掌握。因此，Kumar等13尝试改变培养方式，选择了悬浮培养。他们在第7天将贴壁细胞解离，并接种至低黏附培养板中，以促进其自组装形成包含肾单位样结构的拟胚体（EBs）。然而，这些方法的批次效应较为明显，尤其是在不同iPSC系之间。此外，不同文献报道的CHIR浓度也存在差异，范围从7 µM到12 µM不等5,13,14。
我们推测，细胞密度和CHIR的浓度可能影响不同iPSCs类器官的生成，这一假设已在我们的多次实验中得到验证。本方案对Kumar等人的研究方法13进行了轻微修改，并为使用者提供了逐步操作流程。该方法的时间安排和示意图见图1。

<table><tbody><tr><td>96孔细胞培养板，平底</td><td>NEST</td><td>Cat #701003</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #07920</td><td></td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat #100-51-6</td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸苄酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat #120-51-4</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Haier</td><td>Cat #HR40&amp;nbsp;&lt;img alt=&quot;Equation 1&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/65698/65698eq01.jpg&quot; style=&quot;margin: auto;&quot;/&gt;&amp;nbsp;A2</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗人LTL抗体（1:300）</td><td>Vector Laboratories</td><td>Cat #B-1325</td><td></td></tr><tr><td>人外周血单个核细胞来源的诱导多能干细胞hiPS-B1（iPSc，女性）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>二氧化碳振荡培养箱</td><td>HAMANY</td><td>Cat #C0-06UC6</td><td></td></tr><tr><td>化学品、多肽及重组蛋白</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021（Wnt通路激活剂）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #72054</td><td></td></tr><tr><td>Costar 多孔6孔细胞培养板</td><td>Corning</td><td>Cat #3516</td><td></td></tr><tr><td>Costar 超低吸附6孔板</td><td>Corning</td><td>Cat #3471</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #07930</td><td></td></tr><tr><td>DAPI染色液</td><td>Coolaber</td><td>Cat #SL7102</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖，Alexa Fluor 647标记</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Cat #D22914</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12（无HEPES）</td><td>Servicebio</td><td>Cat #G4610</td><td></td></tr><tr><td>驴抗羊IgG H&L（Alexa Fluor 647标记）</td><td>Abcam</td><td>Cat #ab150179</td><td></td></tr><tr><td>驴血清封闭液</td><td>Meilunbio</td><td>Cat #MB4516-1</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS（无钙、无镁、无酚红）</td><td>Solarbio Life Science</td><td>Cat #D1040</td><td></td></tr><tr><td>干式恒温培养器</td><td>上海精芯</td><td>Cat #JX-10</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488标记山羊抗小鼠IgG（1:400）</td><td>Earthox</td><td>Cat #E032210</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488标记山羊抗兔IgG（1:400）</td><td>Earthox</td><td>Cat #E032220</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 549标记山羊抗小鼠IgG（1:400）</td><td>Earthox</td><td>Cat #E032310</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 549标记山羊抗兔IgG（1:400）</td><td>Earthox</td><td>Cat #E032320</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 649标记山羊抗兔IgG（1:400）</td><td>Earthox</td><td>Cat #E032620</td><td></td></tr><tr><td>实验模型：细胞系</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Cat #370</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free</td><td>Gibco</td><td>Cat #A1413202</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>NEST</td><td>Cat #801002</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗人CUBN抗体（1:300）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Cat #sc-20607</td><td></td></tr><tr><td>肝素溶液（细胞培养添加剂）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #07980</td><td></td></tr><tr><td>人重组FGF-9</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #78161</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>Cat #CKX53</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>Cat #FV3000</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat #M7027</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>HENGNUO</td><td>Cat #2-4B</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人CD31抗体（1:300）</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat #555444</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人ECAD抗体（1:300）</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat #610182</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人整合素β1抗体（1:300）</td><td>Abcam</td><td>Cat #ab30394</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人MEIS 1/2/3抗体（1:300）</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Cat #39795</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88（聚乙烯醇4-88）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat #81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 5X添加剂</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #85852</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1基础培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #85851</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 冻存管</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Cat #377267</td><td></td></tr><tr><td>其他</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔抗人GATA3抗体（1:300）</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>Cat #5852S</td><td></td></tr><tr><td>兔抗人LRP2抗体（1:300）</td><td>Sapphire Bioscience</td><td>Cat #NBP2-39033</td><td></td></tr><tr><td>兔抗人Synaptopodin抗体（1:300）</td><td>Abcam</td><td>Cat #ab224491</td><td></td></tr><tr><td>兔抗人WT1抗体（1:300）</td><td>Abcam</td><td>Cat #ab89901</td><td></td></tr><tr><td>兔抗小鼠PDGFR抗体（1:300）</td><td>Abcam</td><td>Cat #ab32570</td><td></td></tr><tr><td>重组人血清白蛋白（rHSA）</td><td>YEASEN</td><td>Cat #20901ES03</td><td></td></tr><tr><td>羊抗人NPHS1抗体（1:300）</td><td>R&D Systems</td><td>Cat #AF4269</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #05275</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素Cy3标记（1:400）</td><td>Gene Tex</td><td>Cat #GTX85902</td><td></td></tr><tr><td>Versene（1X）</td><td>Gibco</td><td>Cat #15040066</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632（盐酸二氢盐）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #72304</td><td></td></tr></tbody></table>

从诱导性多能干细胞在悬浮培养中生成肾脏类器官

Generating Kidney Organoids in Suspension from Induced Pluripotent Stem Cells

可通过多种方法从诱导性多能干细胞（iPSCs）生成肾类器官。这些类器官在疾病建模、药物筛选以及潜在的治疗应用方面具有广阔前景。本文介绍了一种从iPSCs逐步生成肾类器官的操作流程，起始于后部原始条纹（PS），进而诱导为中间中胚层（IM）。该方法依赖于APEL 2培养基，这是一种成分明确且不含动物源成分的培养基。培养过程中，首先添加高浓度的WNT激动剂（CHIR99021）处理4天，随后加入成纤维细胞生长因子9（FGF9）/肝素及低浓度CHIR99021继续培养3天。在此过程中，特别强调在iPSC起始阶段选择最佳的细胞密度和CHIR99021浓度，因为这些因素对成功生成肾类器官至关重要。本实验方案的一个重要环节是在低黏附培养板中进行悬浮培养，使中间中胚层逐步发育为包含肾小球、近端小管和远端小管结构的肾单位结构，并以直观易懂的可视化形式呈现。总体而言，该详细实验方案提供了一种高效且特异的技术，可用于从多种iPSC系生成肾类器官，确保实验结果的成功性和可重复性。

通过使用GSK3抑制剂CHIR99021激活经典的WNT信号通路，随后加入FGF9/肝素，可实现IM的生成。从第0天到第4天，iPSC迅速扩增，并呈现菱形或三角形形态。细胞融合度在第7天达到90%–100%，并均匀累积。在悬浮培养后，细胞团于第7天解离后自发形成肾单位结构。通过悬浮培养生成的肾类器官呈现出类似小管的结构，在聚集培养18天后可通过明场图像轻松观察到（图2 和 图3）。
通常，从一个24孔板中的iPSCs孔开始进行一次实验，可获得200–300个类器官。其中80%–90%含有类似肾单位的结构（图2）。对于hiPSC-B1 iPSC细胞系，生成肾脏类器官的最佳条件是在24孔板的一个孔中培养1.8–2.0 × 104个细胞，并使用8 µM CHIR99021（图2、图3</s...

本方案介绍了一种利用悬浮培养条件从诱导性多能干细胞（iPSCs）高效生成肾类器官的全面方法。本研究的重点在于确定初始细胞密度和WNT激动剂浓度，从而为对肾类器官研究感兴趣的科研人员提供参考。

肾类器官可通过多种方法由诱导性多能干细胞（iPSCs）生成。这些类器官在疾病研究……

我们的研究提出了一种利用悬浮培养条件从诱导性多能干细胞高效制备肾类器官的全面方法。我们强调了在诱导阶段初始细胞密度和WNT激动剂浓度的重要性，这将有助于指导类器官研究领域的新研究人员。目前，获得单一高密度的iPSC细胞系仍然存在困难。批次差异的影响较为明显，尤其是在不同的iPSC细胞系中。每一批次生成的肾类器官可能在形态和大小上存在差异。针对某一特定iPSC细胞系，通常需要进行多次尝试，以确定最佳的初始细胞密度和CHIR浓度。我们已确定，中间方法的初始分化对成功形成肾类器官至关重要。本方案详细描述了在该过程中如何选择最佳的细胞密度和CHIR浓度，因为不同的iPSC细胞系在细胞增殖和分化能力方面表现出差异。研究人员可利用其iPSC快速生成特定的肾类器官。根据我们的方案，通过调整细胞密度和CHIR浓度，无疑将有助于所有研究人员专注于肾脏疾病的研究。我们实验室未来的研究目标是优化疾病模型中的该方案，再生新药物并进行药物筛选。在最近五年中，我们实验室将基于患者来源的iPSC和肾脏类器官疾病模型，重点开展各种遗传性肾脏疾病的表观遗传学及细胞靶向药物开发。首先，用 2 毫升 DPBS 清洗接种在基质膜包被的 6 孔板上的诱导多能干细胞（iPSCs）。使用移液器吸除 DPBS。接着，加入 1 毫升市售的细胞解离溶液，以解离 iPSCs。然后，将细胞放入37摄氏度的培养箱中孵育5分钟。现在，用移液器将1毫升mTeSR加至iPSCs中，确保细胞已从塑料表面分离。在室温下以400 ×g离心这些细胞3分钟。重悬细胞沉淀，然后使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。接着，在已包被基底膜基质的6孔板中接种不同密度的细胞。使用添加了10 µM Rho激酶抑制剂的mTeSR培养基进行培养。将培养板置于37°C的二氧化碳培养箱中过夜培养。次日，吸除mTeSR培养基，并用2 mL DPBS洗涤细胞。接下来，向细胞中加入2毫升阶段I培养基。然后，将细胞置于37摄氏度培养箱中培养4天。第4天时，移除阶段I培养基，并用2毫升DPBS洗涤细胞。然后，在细胞中加入 2 mL 的 II 期培养基，之后将细胞按之前条件进行培养。从第 0 天到第 4 天，诱导多能干细胞（iPSCs）迅速扩增，并呈现菱形或三角形形态。细胞融合度在第 7 天前均匀累积，达到 90% 至 100%。在悬浮培养条件下，聚集体在第7天解离后会自发形成肾单位结构。首先，在第7天的培养中，从iPSC细胞悬液中移除阶段II培养基。随后，用2毫升DPBS洗涤细胞。向每个孔中加入1毫升细胞解离溶液。然后，将培养板置于37摄氏度的培养箱中孵育5分钟。孵育结束后，向细胞中加入1毫升阶段II培养基，充分混匀，直至细胞从培养表面完全解离。将细胞悬液收集到15毫升离心管中。然后在室温下以400 ×g离心3分钟。离心后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于2毫升III期培养基中。轻轻混匀溶液。随后以1:3的比例将细胞悬液接种至6孔低吸附培养板中。将培养板置于37°C、含5%二氧化碳的培养箱内的轨道摇床上。为了去除悬浮培养中的培养基，首先使用无菌剪刀剪掉1毫升移液枪头的尖端。然后，轻轻晃动6孔板，使类器官集中到孔中央。接着，用准备好的移液枪吸取类器官，并将其转移至15毫升离心管中，静置5分钟。吸除上清液，确保类器官仍留在管底。随后将III期培养基用移液器加入孔板中，再用移液器轻轻吹打混合液以重悬类器官。将类器官重新接种至6孔低黏附培养板中。在培养箱中继续以每分钟60转的速度振荡低黏附培养板。第12天时，更换为IV阶段培养基。肾类器官在聚集培养18天后显示出类似小管的结构，可在明场图像中轻松观察到。已诱导出CD31内皮细胞。葡聚糖被肾类器官的近端小管摄取。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从诱导多能干细胞中产生悬浮液中的肾脏类器官

在本视频中，我们介绍了通过在特定化学条件下诱导细胞分化，从诱导性多能干细胞中获得人类肾脏足细胞的实验方案。所获得的足细胞可用于肾毒性测试和疾病模型研究。...

从诱导性多能干细胞衍生人类肾脏足细胞：一种从干细胞定向分化成熟肾脏足细胞的实验方案

关键词：诱导性多能干细胞，肾脏足细胞，定向分化，干细胞分化，肾小球，足细胞标志物，PAX2，WT1，NEPHRIN，SYNPO，细胞培养，肾脏发育

本视频演示了一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方法。将人iPSCs诱导形成拟胚体（EBs）。在诱导培养基中，将EBs培养于聚合物支架上，促进其分化为神经干细胞、前体细胞以及未成熟神经元。最后，将EBs包埋于基质中，并转移至维持培养基中以形成脑类器官。...

生成诱导多能干细胞来源的脑类器官

本研究描述了两种用于研究器官发育的方法：一种是改进的禽类胚胎绒毛尿囊膜（CAM）异种移植体系，可实现培养的胚胎器官和类器官的血管化；另一种是新型的固定z轴方向器官培养方法，通过优化实验条件，可实现高分辨率的共聚焦显微镜延时成像。...

肾类器官和类器官型培养的优化：促进血管化、延长发育及改善显微成像

人类肾脏类器官培养物代表了一种宝贵的 体外...

从组织和尿液中生成人类肾脏管状类器官

本文介绍了一种从人多能干细胞（hPSCs）生成肾类器官的实验方案。该方案可在两周内生成肾类器官。所获得的肾类器官可在大规模旋转烧瓶或多孔磁力搅拌板中进行培养，适用于并行药物筛选研究。...

一种从人多能干细胞生成肾类器官的简化方法

本文介绍了一种构建个性化器官芯片系统的方案，该系统通过整合由人诱导多能干细胞分化而来的基因匹配的上皮细胞和血管内皮细胞，模拟肾脏肾小球滤过屏障的结构与功能。这种生物工程系统可推动肾脏精准医学及相关应用的发展。...

由人诱导多能干细胞构建的等基因肾小球芯片

本文介绍了一种将肾类器官移植到鸡胚体腔的详细方案。该方法可在8天内诱导类器官的血管化并促进其进一步成熟，可用于高效研究这些过程。...

通过鸡胚体内移植实现肾类器官的有效血管化

本文介绍了人类多能干细胞（hPSC）的培养方案，用于将hPSC分化为CD34+造血祖细胞。该方法通过阶段特异性调控经典WNT信号通路，使细胞特异性地定向分化为确定型或原始型造血程序。...

从人多能干细胞定向分化原始和确定型造血祖细胞

我们介绍一种通过无整合方法利用人外周血（PB）来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）生成软骨细胞系的方案，该方法包括拟胚体（EB）形成、成纤维细胞扩增以及软骨诱导。...

从外周血来源的人诱导性多能干细胞分化软骨细胞

本文提出了一种从脐带血单个核细胞来源的人诱导性多能干细胞进行软骨细胞分化的方法。...

由脐带血来源的诱导多能干细胞形成软骨细胞样细胞团

了解如何利用悬浮培养条件从诱导多能干细胞高效生成肾脏类器官。本研究强调初始细胞密度和WNT激动剂浓度对类器官形成的关键作用，为肾脏发育和疾病研究提供可靠方法。

从诱导性多能干细胞在悬浮培养中生成肾脏类器官

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