Name: 软脑膜淋巴内皮细胞的收获和原代培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:55:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 学习从小鼠大脑中收获软脑膜淋巴内皮细胞并进行原代培养的方法。该方案可获得纯度超过95%的细胞，有助于研究其在神经系统中的生物学功能及临床意义。

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本研究得到国家自然科学基金（81960226，81760223）、云南省自然科学基金（202001AS070045，202301AY070001-011）以及云南省教育厅科学研究基金（2023Y0784）的资助。

本研究获得了昆明医科大学动物实验伦理委员会（kmmu20220945）的批准。所有实验均遵循既定的动物护理指南。硬脑膜淋巴管内皮细胞（LLECs）取自6至8周龄、体重在20至25克之间的雄性C57Bl/6J小鼠。这些小鼠购自中国昆明的昆明医科大学。整个实验过程均在严格的无菌条件下进行。除非另有说明，所有离心步骤均在室温下进行。
1. 试剂与仪器的准备
注意：所有涉及溶液的操作步骤均须在II级生物安全柜内进行。
<ol>
	<li>通过将磷酸盐缓冲液（PBS）与钙、镁、10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素（P/S）混合来配制洗涤缓冲液（见材料表）。将该缓冲液置于 4 °C 冷藏。必须在使用当天新鲜配制，并对缓冲液进行脱气处理。</li>
	<li>通过将 10 mL PBS（不含钙和镁）与 2 mL 0.25% 胰蛋白酶、1 mL 20 mg/mL 木瓜蛋白酶和 200 µL 1 mg/mL 胶原酶 I 混合来配制消化酶（见材料表）。 
	注意：请确保使用适当体积的分装 aliquot，以避免反复冻融。将这些分装 aliquot 储存于 -20 °C。</li>
	<li>使用市售的内皮细胞生长培养基试剂盒配制培养基，其中包含 VEGF-C（100 ng/mL）和 1% P/S（见材料表）。</li>
	<li>通过在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加 10% FBS 来配制终止缓冲液，以终止消化过程。</li>
	<li>准备无菌手术器械：应包括剪刀、锯齿尖镊子和细尖镊子。</li>
</ol>
2. 培养瓶包被
<ol>
	<li>使用100 µg/mL的纤连蛋白溶液（见材料表）包被T25培养瓶，并于37 °C孵育过夜。使用前用移液器吸除包被液。</li>
	<li>用PBS洗涤培养瓶三次，随后吸除PBS，并让T25培养瓶自然风干。</li>
</ol>
3. 软脑膜解离
注意：始终使用预冷至 4 °C 的缓冲液和溶液。
<ol>
	<li>用4%异氟烷过量吸入麻醉小鼠，然后使用经70%乙醇清洁过的剪刀快速剪头处死。</li>
	<li>沿中线小心切开皮肤，从颅骨后部的开口处开始，向前额区域延伸。</li>
	<li>轻柔地移除颅骨，用剪刀轻轻抬起，避免损伤软脑膜，确保完整获取包括软脑膜在内的整个脑组织。</li>
	<li>将整个脑组织浸入洗涤缓冲液中，轻轻冲洗以去除表面血液。</li>
	<li>将脑组织转移至无菌培养皿中，不要切割，然后在显微镜下用精细镊子从脑表面剥离软脑膜组织。</li>
	<li>使用无菌显微剪刀将软脑膜组织剪成小块。</li>
</ol>
4. 软脑膜的酶消化
<ol>
	<li>向组织碎片中加入10 mL酶混合液（步骤1.2），在37 °C下孵育15分钟。轻轻振荡以确保组织碎片从管底脱落。随后加入10 mL终止缓冲液（步骤1.4）以终止消化反应。</li>
	<li>在4 °C下以300 × g离心5分钟，并用移液器小心吸除上清液。</li>
	<li>加入10 mL冷的PBS，将混合液通过70 µm细胞筛滤入无菌的50 mL离心管中，以去除任何团块。</li>
</ol>
5. 细胞扩增
<ol>
	<li>接种 1 × 105 每平方厘米细胞数2 加入5 mL培养基至经纤连蛋白包被的T25培养瓶（步骤2）中。</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 孵育24小时。随后，移除培养基以去除未贴壁细胞。</li>
	<li>每隔两天更换50%的培养基以维持培养，重复此过程两到三次。</li>
</ol>
6. 磁性细胞筛选
注意：操作需迅速，保持细胞低温，并使用预冷的溶液，以防止非特异性细胞标记。
<ol>
	<li>仪器与试剂准备：将磁力分离器固定在磁力架上（参见材料表）。将分选柱连接至磁力分离器，并在分选柱上方放置一个70 µm细胞筛网。在分选柱下方放置一个50 mL离心管，用于收集流出液。</li>
	<li>酶消化：当细胞达到80%融合度时，吸除培养基，并用PBS清洗细胞。加入0.25%胰蛋白酶以解离贴壁细胞，在37 °C孵育5分钟。加入终止缓冲液终止消化反应。在室温下以300 x g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>抗体孵育：将1 × 107个总细胞重悬于100 µL PBS中，加入10 µL LYVE-1抗体（参见材料表）。充分混匀后，在4 °C避光孵育30分钟。
	<ol>
		<li>以300 x g离心5分钟，弃去上清液。加入1 mL PBS重悬细胞并以300 x g离心5分钟进行洗涤。彻底弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微珠标记：将细胞重悬于100 µL PBS中，加入20 µL微珠（参见材料表）。充分混匀后，在4 °C避光孵育30分钟。
	<ol>
		<li>以300 x g离心5分钟，倾去上清液。随后用1 mL PBS通过以300 x g离心5分钟的方式洗涤细胞。最后彻底弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁性阴性排除法：将细胞重悬于4 mL PBS中。通过70 µm细胞筛网过滤细胞悬液以去除团块。用3 mL PBS冲洗分选柱（参见材料表）进行预处理，然后将细胞悬液加入分选柱中。
	<ol>
		<li>用3 mL PBS进行洗涤，收集穿过分选柱的LYVE-1阴性细胞至下方放置的50 mL离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁性阳性筛选：用移液器向分选柱中加入6 mL PBS。通过用力推动分选柱的推杆，迅速冲洗出磁性标记的细胞，从而获得LYVE-1阳性的LLEC。 
	&#8203;注意：每次操作前务必等待分选柱储液腔完全排空后再进行下一步。</li>
</ol>
7. LLECs 培养
<ol>
	<li>将LYVE-1阳性的LLECs在300 x g 5 分钟后，小心移除上清液。</li>
	<li>接种 1 × 105 每平方厘米细胞数2 加入5 mL培养基至经纤连蛋白包被的T25培养瓶中。</li>
	<li>每隔一天更换50%的培养基以维持培养。当细胞达到80%融合度时，使用0.25%胰蛋白酶消化细胞并进行传代。在传代2-3次后，将细胞用于后续实验。</li>
</ol>
8. 流式细胞术分析
注意：流式细胞术分析按照先前描述的方法进行15。
<ol>
	<li>加入 0.25% 胰蛋白酶以消化贴壁细胞，37 °C 孵育 5 分钟。然后加入终止缓冲液以终止消化反应。</li>
	<li>将细胞以 300 x g 离心 5 分钟，并彻底吸除上清液。将 1 x 106 个细胞重悬于 100 µL PBS 中。</li>
	<li>加入 1 µL LYVE-1 抗体，充分混匀后在室温避光孵育 10 分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于适量 PBS 缓冲液中，用于流式细胞术分析及 FlowJo 软件处理（参见 材料表）。</li>
</ol>
9. 免疫荧光染色
注意：免疫荧光染色按照先前描述的步骤进行16。
<ol>
	<li>用 PBS 洗涤细胞三次。在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞 10 分钟。弃去 PFA，并用 PBS 洗涤细胞三次。</li>
	<li>在室温下加入封闭缓冲液孵育 1 小时。移除盖玻片上的封闭缓冲液。</li>
	<li>将 LYVE-1 抗体溶于染色缓冲液中，加入细胞，并在避光条件下孵育。用 PBS 洗涤细胞三次。</li>
	<li>将适当的二抗（见材料表）溶于染色缓冲液中，加入细胞，并在避光条件下孵育。用 PBS 洗涤细胞三次。</li>
	<li>用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行复染。细胞现在可用于免疫荧光显微镜观察。</li>
</ol>

Establishing In Vitro LLEC Cultures Using Magnetic Cell Selection

<ol><li>Shibata-Germanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+conservation+of+non-lumenized+lymphatic+endothelial+cells+in+the+mammalian+leptomeninges%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges.</a> Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).</li>
<li>Suárez, I., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+with+many+talents%3A+lymphatic+endothelial+cells+in+the+brain+meninges%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges.</a> Cells. 10 (4), 799(2021).</li>
<li>Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+purifies+murine+lymph+node+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphatic+Research+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium.</a> Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).</li>
<li>Jones, B. E., Yong, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+characterization+of+bovine+mesenteric+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium.</a> In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).</li>
<li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li>
<li>Jablon, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culturing+of+primary+lymphatic+endothelial+cells+from+collecting+lymphatics%3A+A+techniques+study%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study.</a> Microcirculation. 30 (2-3), e12778(2023).</li>
<li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li>
<li>Lokmic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Identification%2C+and+culture+of+human+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).</li>
<li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li>
<li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, e52691(2015).</li>
<li>Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+functional+characterization+of+rat+arachnoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines.</a> Neuroscience. 177, 23-34 (2011).</li>
<li>Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+preliminary+characterization+of+immortalized+cell+line+derived+from+rat+lymphatic+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries.</a> Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).</li>
<li>Park, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+culture+and+study+of+adult+human+brain+cells+from+neurosurgical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens.</a> Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).</li>
<li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lyve1+expression+reveals+novel+lymphatic+vessels+and+new+mechanisms+for+lymphatic+vessel+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish.</a> Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).</li>
<li>Bokobza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+Isolation+of+microglial+cells+from+neonate+mouse+for+primary+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. 185, e62964(2022).</li>
<li>Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+mouse+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 118, e52965(2016).</li>
<li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries%3A+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).</li>
<li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+lymphatic+vasculature%3A+From+development+to+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).</li>
<li>Wilting, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Prox1+is+a+marker+for+lymphatic+endothelial+cells+in+normal+and+diseased+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues.</a> The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelial+heparan+sulfate+deficiency+results+in+altered+growth+responses+to+vascular+endothelial+growth+factor-C+%28VEGF-C%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C).</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).</li>
<li>DeSisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analyses+of+the+developing+meninges+reveal+meningeal+fibroblast+diversity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function.</a> Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+eliminating+fibroblast+contamination+in+mouse+and+human+primary+corneal+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures.</a> Current Eye Research. , 1-11 (2023).</li>
<li>Starzonek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+human+dermal+stem+cells+from+primary+cell+cultures+through+the+elimination+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts.</a> Cells. 12 (6), 949(2023).</li>
<li>Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+fibroblast+on+the+arachnoid+leptomeningeal+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro.</a> Brain Research. 1657, 109-119 (2017).</li>
</ol>

作者声明不存在任何利益冲突需要披露。

现有LLEC的分离与培养方案 体外 此前尚未见报道。本研究介绍了一种可重复的、多步骤的从小鼠软脑膜中分离和培养LLECs的实验方案。
尽管该多步骤实验方案具有可重复性，但仍需注意若干关键因素。例如，纤维连接蛋白包被的T25培养瓶可促进LLEC的贴壁，并通过去除非贴壁细胞来获得更均一的细胞群体。此外，在分离软脑膜的手术过程中，操作时长和温度是影响细胞活力的关键因素。因此，操作时间应控制在1小时以内，并保持缓冲液足够低温。另一个关键点是软脑膜中可能存在红细胞，其释放的血红蛋白可能对LLEC造成损伤。为减轻这一影响，必须轻柔地冲洗和洗涤以去除红细胞，避免其产生细胞毒性作用。最后，LLEC需要VEGF-C20的刺激，尤其是浓度为100 ng/mL时。在此刺激条件下，LLEC呈现典型的内皮样形态，而非形成管状结构（补充图3A-C）。因此，本研究采用含100 ng/mL VEGF-C的培养基来诱导细胞扩增并维持细胞群体的均一性。
本文所述的...

新发现的软脑膜淋巴管内皮细胞（LLECs）在软脑膜内形成由单个细胞构成的网状结构，其分布模式与外周淋巴管内皮细胞明显不同1,2。目前，LLECs 的细胞功能及其临床意义仍 largely 未被探索。为了推动针对 LLECs 的功能研究，建立一种体外（in vitro）研究模型至关重要。因此，本研究制定了一套完整的 LLECs 分离与原代培养方案。
小鼠是疾病研究中首选的动物模型，因其适用于基因操作。以往的研究已成功从多种小鼠组织中分离出淋巴管内皮细胞，包括淋巴结3、肠系膜组织4、皮肤组织5、收集性淋巴管6以及肺组织7。这些分离方法主要依赖于磁珠激活细胞分选（MACS）和流式细胞术分选8,9,10。此外，已有研究建立了大鼠蛛网膜细胞系和大鼠淋巴毛细血管细胞系11,12。尽管已有用于软脑膜组织的组织块培养技术13，但仍迫切需要建立一种标准化的LLEC分离与培养方案。因此，本研究在显微镜引导下精细解离软脑膜，成功获取并培养了LLEC，并通过使用血管内皮生长因子-C（VEGF-C）促进LLEC的扩增。淋巴管内皮细胞的特异性标志物为淋巴管透明质酸受体-1（LYVE-1）14。该多步骤方案利用MACS选择性分离LYVE-1阳性的LLEC，并通过流式细胞术分析和免疫荧光染色验证其纯度。
该多步骤实验方案的主要步骤可概括如下：培养瓶包被、软脑膜解离、软脑膜酶消化、细胞扩增、磁珠分选以及LLEC的后续培养。最后，通过流式细胞术分析和免疫荧光染色确认分离所得LLEC的纯度。本研究的总体目标是提供一种可重复的多步骤实验方案，用于从小鼠软脑膜中分离LLEC并进行后续的in vitro培养。该方案将极大促进对LLEC细胞功能及其临床意义的研究。

<table><tbody><tr><td>封闭缓冲液</td><td>Beyotime</td><td>P0102</td><td>分装保存于 &amp;ndash;4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胶原酶 I</td><td>Solarbio</td><td>C8140</td><td>分装保存于 &amp;ndash;20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime</td><td>P0131</td><td>分装保存于 &amp;ndash;20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Solarbio</td><td>11995</td><td>分装保存于 &amp;ndash;4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Solarbio</td><td>D1041</td><td>分装保存于 &amp;ndash;4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>EGM-2 MV Bullet试剂盒</td><td>Lonza</td><td>C-3202</td><td>分装保存于 &amp;ndash;4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Solarbio</td><td>S9010</td><td>分装保存于 &amp;ndash;20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Solarbio</td><td>F8180&amp;nbsp;</td><td>分装保存于 &amp;ndash;20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>FlowJo 软件</td><td>BD Biosciences</td><td>V10.8.1</td><td></td></tr><tr><td>LYVE-1 抗体</td><td>eBioscience</td><td>12-0443-82</td><td>分装保存于 &amp;ndash;4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>磁力分离器</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-302</td><td>使用前保持无菌</td></tr><tr><td>磁力分离架</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td>使用前保持无菌</td></tr><tr><td>磁珠</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-801</td><td>分装保存于 &amp;ndash;4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（P/S）</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td>分装保存于 &amp;ndash;20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Solarbio</td><td>G8430-25g</td><td>分装保存于 &amp;ndash;20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>D1040</td><td>分装保存于 &amp;ndash;4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PDPN 抗体</td><td>Santa</td><td>sc-53533</td><td>分装保存于 &amp;ndash;4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>分装保存于 &amp;ndash;4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PROX1 抗体</td><td>Santa</td><td>sc-81983</td><td>分装保存于 &amp;ndash;4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>分选柱&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>使用前保持无菌</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>分装保存于 &amp;ndash;20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>VEGF-C&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab51947</td><td>分装保存于 &amp;ndash;20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>VEGFR-3 抗体</td><td>Santa</td><td>sc-514825</td><td>分装保存于 &amp;ndash;4 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

软脑膜淋巴管内皮细胞的获取与原代培养

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

软脑膜淋巴管内皮细胞（LLECs）是一类新近发现的颅内细胞群体，其分布特征独特，明显区别于外周淋巴管内皮细胞。目前，这类细胞的生物学功能及其临床意义仍 largely 未知。因此，获得稳定的 LLEC 来源对于开展体外功能研究至关重要。然而，目前尚无可用于分离和培养 LLECs 的既定方案in vitro。
本研究通过多步骤方案成功分离了软脑膜淋巴内皮细胞（LLECs），该方案包括使用纤连蛋白包被培养瓶、在显微镜辅助下解剖软脑膜、通过酶消化法将软脑膜组织制备成单细胞悬液、利用血管内皮生长因子C（VEGF-C）诱导LLECs扩增，并通过磁珠激活细胞分选技术（MACS）筛选出淋巴管透明质酸受体-1（LYVE-1）阳性的细胞，最终建立了原代细胞培养体系。通过免疫荧光染色和流式细胞术分析确认了LLECs的纯度，其纯度超过95%。该多步骤方案具有良好的可重复性和可行性，将极大促进对LLECs细胞功能及其临床意义的研究。

本研究提供了一种可重复的多步骤方案，用于从小鼠体内分离淋巴管内皮细胞（LLECs）并建立其原代培养 体外关键步骤包括培养瓶的准备和纤连蛋白包被、软脑膜的分离、通过酶消化获得单细胞悬液，以及使用VEGF-C诱导LLECs扩增。随后利用磁性激活细胞分选（MACS）技术选择性分离LYVE-1阳性的LLECs。最后，通过免疫荧光染色和流式细胞术分析评估LLECs的纯度，MTT检测结果表明LLECs具有良好的生长速率。补充图1）。该多步骤实验方案的主要流程如流程图所示，整个过程大约需要2-3周（图1).
为了收获LLECs，必须解离软脑膜并促进LLECs扩增，同时通过高效的手术技术及维持低温环境来保持细胞活力（图2A-E）。在无菌条件下获取带有软脑膜的完整脑组织后，需进行轻柔的冲洗以去除红细胞（图2F）。随后，在显微镜下仔细从脑表...

脑膜淋巴管内皮细胞（LLECs）是一种近期发现的颅内细胞类型，其功能尚不明确。本研究提供了一种可重复的小鼠LLEC分离与培养方案 体外 原代培养。本方案旨在帮助研究人员深入探究LLECs的细胞功能及其潜在的临床意义。

软脑膜淋巴管内皮细胞（LLECs）是一类新近发现的颅内细胞群体，具有独特且明确的分布特征，与其他细胞明显不同……

本创新性实验方案旨在为其他研究人员提供仅通过外渗方式获取的LLEC培养方法。我们建立了一套多步骤流程，用于体外分离与培养原代LLEC。本方案最终成功建立了纯度超过95%的原代LLEC培养体系。目前尚无任何现有方案可用于LLEC的体外分离与培养。我们的研究结果为进一步在体外深入探究LLEC的类似功能奠定了基础。LLEC是揭示颅内细胞群体的重要线索，其生物学意义具有重要的年度保障价值。我们将对LLEC的细胞功能开展进一步研究，以阐明其临床意义。首先，小心切开已处死小鼠的皮肤，从颅骨开口处开始，向前额区域延伸。使用剪刀轻柔地抬起并移除颅骨，避免损伤软脑膜，完整取出整个脑组织。将整个脑组织浸入洗涤缓冲液中，并轻轻冲洗以去除表面血液。将脑组织转移至无菌培养皿中，不要切碎。然后在显微镜下，使用精细镊子从脑表面剥离软脑膜。使用无菌显微剪将软脑膜组织剪成小片段。使用指定组分配制消化酶混合液。向组织碎片中加入10毫升混合液，37摄氏度孵育15分钟。轻轻振荡，使碎片从管底脱落。然后加入10毫升终止缓冲液。在4摄氏度下，以300×g离心5分钟。使用移液器小心吸去上清液。加入10毫升冷的PBS，通过70微米滤网将任何团块过滤至无菌的50毫升离心管中。每平方厘米接种10的5次方个细胞至含5毫升培养基的纤维连接蛋白包被的T25培养瓶中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。孵育后，更换为新鲜培养基以去除未贴壁的细胞。首先，将磁力分离器固定在支架上。将分选柱连接至磁力分离器，并在分选柱顶部放置一个70微米的细胞筛。在分选柱下方放置一个50毫升离心管以收集流出液。当小鼠脑细胞达到80%融合度时，吸除培养基，并用PBS洗涤细胞。加入0.25%胰蛋白酶以脱离贴壁细胞，并在37°C孵育5分钟。然后加入终止缓冲液。将细胞悬液在300g下离心5分钟，并移除上清液。进行抗体染色时，将10^7个细胞重悬于100 µL PBS中。然后加入10 µL LYVE-1抗体溶液，充分混匀。在4°C避光条件下孵育30分钟。孵育结束后，离心细胞并弃去上清液。然后加入一毫升 PBS 洗涤细胞，并在 300g 条件下离心五分钟。进行微珠标记时，将细胞沉淀重悬于 100 微升 PBS 和 20 微升微珠中。充分混匀后，于 4 摄氏度避光孵育 30 分钟。然后，离心该悬液，并用一毫升 PBS 洗涤沉淀。再次离心，将沉淀重悬于四毫升 PBS 中，用于磁性阴性分选。将细胞悬液通过 70 微米细胞筛，以去除团块。用三毫升 PBS 冲洗分离柱以进行准备。然后，将细胞悬液加入分离柱中。用三毫升 PBS 洗涤分离柱，并将 LYVE-1 阴性细胞收集至一个 50 毫升离心管中。进行磁性阳性筛选时，将六毫升 PBS 用移液管加入筛选柱中。然后，通过用力将活塞推入筛选柱，冲洗出磁性标记的细胞，以获得 LYVE-1 阳性的 LLEC。接着，离心阳性细胞悬液并弃去上清液。每平方厘米接种10的5次方个细胞至含有5毫升培养基的T-25培养瓶中。每隔一天更换50%培养基以维持培养。当细胞融合度达到80%时，按照此前演示的方法消化并进行传代。流式细胞术分析显示，在最大传代后，第二代中LYVE-1阳性细胞的比例与第三代相比无显著差异，表明细胞纯度超过95%。免疫荧光染色证实LYVE-1与PDPN、VEGFR-3和PROX1共染色，从而确定了淋巴内皮细胞（LLECs）的身份。LYVE-1阳性细胞不表达F4/80和血小板源性生长因子β，可有效将LLECs与巨噬细胞和成纤维细胞区分开来。最大培养前，软脑膜细胞呈现异质性形态，从圆形球体到融合的纤维状不等。然而，最大培养后，LLECs 表现出典型的内皮样特征，如纺锤形和鹅卵石状形态。

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软脑膜淋巴内皮细胞的收获和原代培养

本文介绍了一种分离和培养小鼠肺内皮细胞的实验方案。该方法包括肺组织的机械法和酶解法解离，以及利用与磁珠偶联的抗PECAM-1和抗ICAM-2抗体进行的两步纯化过程，最终获得主要来源于微血管的高纯度内皮细胞群体。...

新生小鼠肺微血管内皮细胞的分离与培养

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通过多参数荧光激活细胞分选法分离人类淋巴管内皮细胞

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从死后人脑供体衍生软脑膜外植体培养物

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分离中枢神经系统组织及其相关脑膜用于免疫细胞的下游分析

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Neisseria meningitidis 感染诱导性多能干细胞来源的脑微血管内皮细胞

本文介绍了一种基于磁珠分离小鼠皮肤淋巴毛细血管内皮细胞的方法。所分离的淋巴内皮细胞可用于后续实验 体外 实验和蛋白质表达分析...

小鼠皮肤淋巴管内皮细胞的分离

本文介绍了一种从黑色素瘤相关软脑膜病（M-LMD）患者脑脊液中分离循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）并进行扩增的实验方案，旨在建立用于研究M-LMD的临床前模型。...

体外 黑色素瘤患者脑脊液中循环肿瘤细胞的培养以研究黑色素瘤相关性软脑膜病

关键词：黑色素瘤，软脑膜病，循环肿瘤细胞，脑脊液，体外培养，人脑膜细胞，条件培养基，胰岛素样生长因子结合蛋白，VEGF-A，IGF信号通路，MAPK信号通路，小鼠模型，分子表征，功能分析，体内接种&#45;相关性软脑膜疾病

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综合评估脑膜淋巴管的整合方案：小脑延髓池注射、淋巴结成像、脑膜解剖与全层组织染色

本方案概述了分离、通过电穿孔转染以及培养小鼠海马和皮层神经元所需的步骤。短期培养可用于轴突生长和导向研究，而长期培养则适用于突触形成和树突棘分析的研究。...

胚胎小鼠海马和皮层神经元的核转染与原代培养

学习从小鼠大脑中收获软脑膜淋巴内皮细胞并进行原代培养的方法。该方案可获得纯度超过95%的细胞，有助于研究其在神经系统中的生物学功能及临床意义。

软脑膜淋巴管内皮细胞的获取与原代培养

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