软脑膜淋巴管内皮细胞的获取与原代培养

本创新性实验方案旨在为其他研究人员提供仅通过外渗方式获取的LLEC培养方法。我们建立了一套多步骤流程，用于体外分离与培养原代LLEC。本方案最终成功建立了纯度超过95%的原代LLEC培养体系。目前尚无任何现有方案可用于LLEC的体外分离与培养。

我们的研究结果为进一步在体外深入探究LLEC的类似功能奠定了基础。LLEC是揭示颅内细胞群体的重要线索，其生物学意义具有重要的年度保障价值。我们将对LLEC的细胞功能开展进一步研究，以阐明其临床意义。

首先，小心切开已处死小鼠的皮肤，从颅骨开口处开始，向前额区域延伸。使用剪刀轻柔地抬起并移除颅骨，避免损伤软脑膜，完整取出整个脑组织。将整个脑组织浸入洗涤缓冲液中，并轻轻冲洗以去除表面血液。

将脑组织转移至无菌培养皿中，不要切碎。然后在显微镜下，使用精细镊子从脑表面剥离软脑膜。使用无菌显微剪将软脑膜组织剪成小片段。

使用指定组分配制消化酶混合液。向组织碎片中加入10毫升混合液，37摄氏度孵育15分钟。轻轻振荡，使碎片从管底脱落。

然后加入10毫升终止缓冲液。在4摄氏度下，以300×g离心5分钟。使用移液器小心吸去上清液。

加入10毫升冷的PBS，通过70微米滤网将任何团块过滤至无菌的50毫升离心管中。每平方厘米接种10的5次方个细胞至含5毫升培养基的纤维连接蛋白包被的T25培养瓶中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。

孵育后，更换为新鲜培养基以去除未贴壁的细胞。首先，将磁力分离器固定在支架上。将分选柱连接至磁力分离器，并在分选柱顶部放置一个70微米的细胞筛。

在分选柱下方放置一个50毫升离心管以收集流出液。当小鼠脑细胞达到80%融合度时，吸除培养基，并用PBS洗涤细胞。加入0.25%胰蛋白酶以脱离贴壁细胞，并在37°C孵育5分钟。

然后加入终止缓冲液。将细胞悬液在300g下离心5分钟，并移除上清液。进行抗体染色时，将10^7个细胞重悬于100 µL PBS中。

然后加入10 µL LYVE-1抗体溶液，充分混匀。在4°C避光条件下孵育30分钟。孵育结束后，离心细胞并弃去上清液。

然后加入一毫升 PBS 洗涤细胞，并在 300g 条件下离心五分钟。进行微珠标记时，将细胞沉淀重悬于 100 微升 PBS 和 20 微升微珠中。充分混匀后，于 4 摄氏度避光孵育 30 分钟。

然后，离心该悬液，并用一毫升 PBS 洗涤沉淀。再次离心，将沉淀重悬于四毫升 PBS 中，用于磁性阴性分选。将细胞悬液通过 70 微米细胞筛，以去除团块。

用三毫升 PBS 冲洗分离柱以进行准备。然后，将细胞悬液加入分离柱中。用三毫升 PBS 洗涤分离柱，并将 LYVE-1 阴性细胞收集至一个 50 毫升离心管中。

进行磁性阳性筛选时，将六毫升 PBS 用移液管加入筛选柱中。然后，通过用力将活塞推入筛选柱，冲洗出磁性标记的细胞，以获得 LYVE-1 阳性的 LLEC。接着，离心阳性细胞悬液并弃去上清液。

每平方厘米接种10的5次方个细胞至含有5毫升培养基的T-25培养瓶中。每隔一天更换50%培养基以维持培养。当细胞融合度达到80%时，按照此前演示的方法消化并进行传代。

流式细胞术分析显示，在最大传代后，第二代中LYVE-1阳性细胞的比例与第三代相比无显著差异，表明细胞纯度超过95%。免疫荧光染色证实LYVE-1与PDPN、VEGFR-3和PROX1共染色，从而确定了淋巴内皮细胞（LLECs）的身份。LYVE-1阳性细胞不表达F4/80和血小板源性生长因子β，可有效将LLECs与巨噬细胞和成纤维细胞区分开来。

最大培养前，软脑膜细胞呈现异质性形态，从圆形球体到融合的纤维状不等。然而，最大培养后，LLECs 表现出典型的内皮样特征，如纺锤形和鹅卵石状形态。