使用荧光染料标记干细胞以实现光学成像的无创检测

欢迎来到Hiku Alge Blink博士的实验室。我们感谢加州再生医学研究所对本项目的资助。利用荧光对比剂标记干细胞，可实现对移植干细胞在体内的活体示踪。

随后对标记的干细胞进行光学成像，可实现纵向研究，从而能够无创地在活体中监测细胞的迁移。本视频将向您展示如何使用荧光染料标记人胚胎干细胞和人骨髓间充质干细胞。大家好，我是来自加利福尼亚大学旧金山分校放射科对比剂研究组的Sophie Boddington。

今天，我将向您介绍两种使用荧光对比剂标记干细胞的不同技术：一种是使用荧光染料DID标记间充质干细胞，另一种是使用Endign Ingra标记人类胚胎干细胞。现在，让我首先展示我们使用DID标记人类间充质干细胞的技术。

开始标记间充质干细胞的操作时，我们需要将细胞消化并计数，以获得具有确定细胞数量的悬液。由于这是标准的组织培养技术，此处不再详细展示。我们需要将待标记的细胞以每毫升100万个细胞的密度重悬于无血清培养基中。

首先，我们在每毫升细胞悬液中加入5 µL的DID对比剂。然后通过轻柔吹打混匀溶液，将细胞在37°C条件下于六孔低吸附培养板中与标记溶液共同孵育20分钟。简单孵育完成后，需将细胞悬液转移至15 mL离心管中。

我们在400 RCF条件下离心5分钟。接下来，吸取去除标记培养基，注意不要扰动细胞沉淀。现在用PBS洗涤细胞。

用移液器将细胞上下吹打，确保充分分散细胞团块。后两个步骤再重复两次，共完成三次洗涤步骤。

现在我们对细胞进行计数，并执行三重台盼蓝检测以确定细胞活力。在确定细胞活力后，您的细胞即可用于光学成像仪进行成像。为了开始标记人胚胎干细胞的实验流程，我们必须首先制备一种名为吲哚菁绿的对比剂。

然后将其与一种名为鱼精蛋白的转染试剂混合。首先，称取一毫克吲哚菁绿粉末，溶于一百微升DMSO中。向该混合液中加入含有10%FCS的四百微升DMEM，并充分振荡，最终得到浓度为每毫升二毫克的吲哚菁绿溶液。

接下来，我们加入转染试剂鱼精蛋白，它作为对比剂的载体，可使其更高效地进入细胞。现在，将5微升浓度为10毫克/毫升的硫酸鱼精蛋白与300微升ICG和300微升无血清DMEM混合。随后，将该转染混合液振荡5分钟，以促进复合物的形成。

接下来，吸除旧的培养基，并向细胞中加入10毫升预热的DMEM。将先前配制的鱼精蛋白ICG溶液加入细胞中，并将培养皿置于37摄氏度的培养箱中，开始为期1小时的孵育。孵育完成后，从培养箱中取出培养皿，吸除标记溶液，并用5毫升PBS冲洗培养皿，洗涤细胞。

然后在37摄氏度下将细胞消化5分钟。轻轻晃动培养皿有助于使细胞脱落并悬浮。现在我们轻轻吹打，以分散残留的细胞克隆。

通过向培养皿中加入等体积含10%胎牛血清（FCS）的DMEM培养基来中和胰蛋白酶。接着，将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在400 ×g条件下离心5分钟。用完全培养基重悬细胞。

现在，我们可以通过40微米细胞筛过滤细胞，以去除残留的细胞团块或复合物。获得无团块的细胞悬液后，吸除旧的培养基，并将细胞沉淀重悬于预热的完全人胚胎干细胞培养基中。此时，我们需要将小鼠饲养层细胞与人胚胎干细胞分离。

这样做的目的是确保后续仅对干细胞进行成像。为此，我们将细胞悬液转移至经明胶包被的10厘米培养皿中，将培养皿放入37°C培养箱，静置45分钟。

在此期间，务必不要扰动培养皿。此时饲养层细胞会贴附于培养皿表面，而干细胞则不会贴附。我们将溶液从培养皿中转移出来，即可获得标记的人类胚胎干细胞单细胞悬液。

现在我们可以对细胞进行计数，并对它们进行蓝染三重测试。在确认细胞活力后，我们的细胞即可用于成像。该幻灯片展示了一个示例，说明在将干细胞标记荧光对比剂并通过腹腔注射给予小鼠后，如何在活体小鼠中可视化这些干细胞。

连续的光学成像扫描显示细胞最初在肺部聚集，随后重新分布至四肢的骨髓、肝脏和甲状腺。荧光标记还可用于在组织病理学标本中通过荧光显微镜直接显示移植的干细胞。我们刚刚向您展示了在进行细胞标记时如何使用荧光对比剂标记干细胞。

务必记住对每一步骤进行标准化操作。我们这样做是为了确保标记效率和细胞活力的一致性，从而使不同实验的结果具有可比性。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的细胞标记实验顺利成功。