Name: 与非侵入性检测荧光染料标记的干细胞与光学成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学习使用荧光染料标记人胚胎干细胞和间充质干细胞的方法，通过光学成像实现体内无创追踪移植干细胞的迁移行为，为再生医学研究提供重要的细胞动态监测技术。

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本项目获得了加州再生医学研究所Leon J. Thal种子基金的资助。Tobias Henning获得了德国研究基金会（DFG，HE 4578/1-2）的研究奖学金支持。我们衷心感谢Juanito Meneses在人类胚胎干细胞培养方面提供的建议。

使用荧光染料 DiD 标记间充质干细胞
<ol>
<li>开始标记间充质干细胞的操作时，先用胰酶消化并计数细胞，以获得具有确定细胞数量的细胞悬液。</li>
<li>将细胞从培养箱中取出，吸弃含有待标记细胞的培养瓶中的旧培养基。</li>
<li>用10 ml不含Mg²⁺和Ca²⁺的PBS洗涤细胞，随后吸弃PBS。Mg²⁺和Ca²⁺会抑制胰酶活性，因此需使用不含这两种离子的PBS。</li>
<li>加入预热的0.05%胰酶溶液，对于T75培养瓶使用5 ml，确保胰酶完全覆盖瓶内表面。</li>
<li>将培养瓶置于37°C培养箱中孵育约5分钟。</li>
<li>在显微镜下确认细胞是否已脱落。若细胞仍贴壁，可轻敲培养瓶数次，并继续孵育更长时间，直至胰酶消化完成。</li>
<li>此时需加入含10%胎牛血清（FCS）的培养基以中和胰酶活性。加入的培养基体积应与所用胰酶体积相等。</li>
<li>轻轻吹打数次，确保所有细胞重新悬浮于培养基中。</li>
<li>将细胞悬液转移至无菌的15 ml带盖聚丙烯离心管中。</li>
<li>以400 rcf离心5分钟。</li>
<li>小心吸弃上清液，注意不要扰动管底的细胞沉淀。</li>
<li>用DMEM重悬细胞，并进行细胞计数。</li>
<li>将待标记的细胞以每毫升1×10⁶个细胞的密度悬浮于无血清培养基（DMEM）中。</li>
<li>以上为细胞悬液的全部制备步骤，现在可开始标记过程。</li>
<li>首先，每毫升细胞悬液中加入5 µL DiD对比剂。</li>
<li>然后通过轻柔吹打混匀溶液。</li>
<li>将细胞与标记液在37°C条件下于6孔低吸附培养板中孵育20分钟。</li>
<li>简单孵育完成后，需将细胞悬液转移至15 ml带盖聚丙烯离心管中。</li>
<li>以400 rcf离心5分钟。</li>
<li>吸弃标记液，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
<li>用PBS洗涤细胞，吹打混匀，确保充分打散细胞沉淀。</li>
<li>重复上述最后两步操作两次，共完成3次洗涤。</li>
<li>对细胞进行计数，并进行台盼蓝染色检测以评估细胞活力。这些为常规细胞培养操作，此处不再详述。</li>
<li>您的细胞现已准备好用于光学成像仪成像。</li>
</ol>
使用荧光染料ICG标记人类胚胎干细胞
<ol>
<li>开始标记人类胚胎干细胞的实验操作前，准备造影剂吲哚菁绿（Indocyanine Green），将其与转染试剂鱼精蛋白（Protamine）混合。</li>
<li>称取1 mg吲哚菁绿（Indocyanine Green）粉末。将ICG粉末溶于100 µL二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide, DMSO）中。</li>
<li>加入400 µL杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM + 10%胎牛血清），充分混匀。此步骤终浓度为2 mg/mL的吲哚菁绿。</li>
<li>加入转染试剂鱼精蛋白。鱼精蛋白可作为对比剂的载体，使其更高效地进入细胞。</li>
<li>将5 µL浓度为10 mg/mL的硫酸鱼精蛋白与300 µL ICG及300 µL无血清DMEM培养基混合。 </li>
<li>轻轻摇动新的转染溶液5分钟，以使复合物形成。</li>
<li>标记溶液已配制完成。</li>
<li>吸出hESC 10 mm培养皿中的旧培养基。</li>
<li>加入5 ml预热的无血清DMEM。</li>
<li>将先前配制的鱼精蛋白/ICG溶液加入细胞中。将培养皿置于37°C培养箱中，开始1小时的孵育。</li>
<li>孵育完成后，从培养箱中取出培养皿，并吸除标记液。</li>
<li>用 5 ml PBS 冲洗培养皿以洗涤细胞。 </li>
<li>吸除 PBS，加入 5 ml 0.25% 胰蛋白酶。将培养皿置于 37°C 培养 5 分钟，以完成消化。期间可轻轻晃动培养皿，有助于消化过程。</li>
<li>轻轻吹打，以分散残留的菌落。</li>
<li>通过向培养皿中加入等量的KSR来中和胰蛋白酶。</li>
<li>将细胞悬液转移至15 ml离心管中，在400 rcf下离心5分钟。</li>
<li>用完全培养基重悬细胞。</li>
<li>如果此时仍然存在团块，&nbsp;胰酶消化后再次离心。</li>
<li>一旦一个&nbsp;获得无团块的细胞悬液后，吸除旧培养基，将细胞沉淀重悬于10 ml预热的完全ESC培养基中。</li>
<li>此时，需要将小鼠饲养层细胞与人胚胎干细胞（hESCs）分离，以确保后续成像仅针对干细胞。</li>
<li>将细胞溶液转移至经明胶包被的10 cm培养皿中。 </li>
<li>将培养皿放入37°C培养箱中，静置45分钟。&nbsp;在此期间，请勿扰动培养皿。&nbsp; 现在，饲养层细胞会贴附于培养皿，而干细胞则不会。</li>
<li>将溶液从培养皿中转移出来，现在我们得到了标记的人类胚胎干细胞单细胞溶液。 </li>
<li>现在可以对细胞进行计数，并进行台盼蓝染色检测。</li>
<li>该&nbsp;细胞已准备好进行成像！</li>
</ol>
&nbsp;

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+tracking+with+Gadophrin-2+--+a+bifunctional+contrast+agent+for+MR+imaging%2C+optical+imaging+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).</li>
<li>Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+experimental+arthritis+using+allogeneic+leukocytes+labeled+with+a+near-infrared+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+%26+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe.</a> Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).</li>
<li>Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+with+Optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking with Optical imaging.</a> Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).</li>
<li>Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+multichannel+near+infrared+endoscope+for+mouse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging.</a> Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).</li>
</ol>

光学成像（OI）是一种相对较新的成像技术，基于荧光信号的检测。OI 的灵敏度与放射性示踪剂成像技术相当，但不会带来任何辐射暴露风险。OI 提供了一种有效的方法，可对细胞进行无创且重复的追踪，从而深入了解细胞向靶部位的迁移过程。该技术的一个主要局限性在于荧光探针在体内的组织穿透深度有限。因此，位于皮肤表面以下约 5–10 cm 以上的深层组织中的示踪剂积聚可能无法被检测到。目前的临床应用仅限于浅表成像技术，如内窥镜成像、心血管成像和视网膜成像（Funovics 等，2003），但随着对活体细胞追踪所带来广阔前景的认识不断加深，这一研究领域将持续拓展。

<table><tbody><tr><td>吲哚菁绿（IR-125）</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41254-1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM高糖 </td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>用 PBS 稀释至终浓度为 0.1%</td></tr><tr><td>PBS，不含 Mg 和 Ca</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA </td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA </td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>FCS，其特征为</td><td>试剂</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网（40 &amp;mu;m 尼龙</td><td>试剂</td><td>BD 生物科学</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>试剂</td><td>分子探针，Life Technologies</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>敲除DMEM</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>无血清替代物</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇&amp;#8211;乙醇 </td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸 </td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>试剂</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺 200 mM </td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>试剂</td><td>GIBCO，Life Technologies 公司</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白</td><td>试剂</td><td>美国制药合作伙伴公司</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用荧光染料标记干细胞以实现光学成像的无创检测

 Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

光学成像（OI）是一种简便、快速且经济的工具，可用于体内监测基于干细胞的新疗法。该技术基于将干细胞在体外用荧光染料标记，随后通过静脉注射标记细胞，并可视化其在特定靶器官或病变部位的聚集情况。本文技术展示我们如何通过简单孵育脂溶性荧光染料DiD（C67H103ClN2O3S）标记人源间充质干细胞（hMSC），以及如何使用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的荧光染料吲哚菁绿（Indocyanine Green, ICG）标记人源胚胎干细胞（hESC）。染料的摄取机制是通过脂溶性染料在磷脂双分子细胞膜上的黏附与扩散实现。通常情况下，与含血清培养基中孵育相比，在无血清培养基中孵育细胞可提高标记效率。此外，添加转染试剂硫酸鱼精蛋白（Protamine Sulfate）可显著增强对比剂的摄取。

本视频展示了使用荧光染料标记人类胚胎干细胞和间充质干细胞的技术。该技术可用于通过光学成像对移植的干细胞进行体内示踪，并通过荧光显微镜进行组织病理学相关性分析。

光学成像（OI）是一种简便、快速且经济的工具，可用于体内监测基于干细胞的新疗法。该技术基于离体……

欢迎来到Hiku Alge Blink博士的实验室。我们感谢加州再生医学研究所对本项目的资助。利用荧光对比剂标记干细胞，可实现对移植干细胞在体内的活体示踪。随后对标记的干细胞进行光学成像，可实现纵向研究，从而能够无创地在活体中监测细胞的迁移。本视频将向您展示如何使用荧光染料标记人胚胎干细胞和人骨髓间充质干细胞。大家好，我是来自加利福尼亚大学旧金山分校放射科对比剂研究组的Sophie Boddington。今天，我将向您介绍两种使用荧光对比剂标记干细胞的不同技术：一种是使用荧光染料DID标记间充质干细胞，另一种是使用Endign Ingra标记人类胚胎干细胞。现在，让我首先展示我们使用DID标记人类间充质干细胞的技术。开始标记间充质干细胞的操作时，我们需要将细胞消化并计数，以获得具有确定细胞数量的悬液。由于这是标准的组织培养技术，此处不再详细展示。我们需要将待标记的细胞以每毫升100万个细胞的密度重悬于无血清培养基中。首先，我们在每毫升细胞悬液中加入5 µL的DID对比剂。然后通过轻柔吹打混匀溶液，将细胞在37°C条件下于六孔低吸附培养板中与标记溶液共同孵育20分钟。简单孵育完成后，需将细胞悬液转移至15 mL离心管中。我们在400 RCF条件下离心5分钟。接下来，吸取去除标记培养基，注意不要扰动细胞沉淀。现在用PBS洗涤细胞。用移液器将细胞上下吹打，确保充分分散细胞团块。后两个步骤再重复两次，共完成三次洗涤步骤。现在我们对细胞进行计数，并执行三重台盼蓝检测以确定细胞活力。在确定细胞活力后，您的细胞即可用于光学成像仪进行成像。为了开始标记人胚胎干细胞的实验流程，我们必须首先制备一种名为吲哚菁绿的对比剂。然后将其与一种名为鱼精蛋白的转染试剂混合。首先，称取一毫克吲哚菁绿粉末，溶于一百微升DMSO中。向该混合液中加入含有10%FCS的四百微升DMEM，并充分振荡，最终得到浓度为每毫升二毫克的吲哚菁绿溶液。接下来，我们加入转染试剂鱼精蛋白，它作为对比剂的载体，可使其更高效地进入细胞。现在，将5微升浓度为10毫克/毫升的硫酸鱼精蛋白与300微升ICG和300微升无血清DMEM混合。随后，将该转染混合液振荡5分钟，以促进复合物的形成。接下来，吸除旧的培养基，并向细胞中加入10毫升预热的DMEM。将先前配制的鱼精蛋白ICG溶液加入细胞中，并将培养皿置于37摄氏度的培养箱中，开始为期1小时的孵育。孵育完成后，从培养箱中取出培养皿，吸除标记溶液，并用5毫升PBS冲洗培养皿，洗涤细胞。然后在37摄氏度下将细胞消化5分钟。轻轻晃动培养皿有助于使细胞脱落并悬浮。现在我们轻轻吹打，以分散残留的细胞克隆。通过向培养皿中加入等体积含10%胎牛血清（FCS）的DMEM培养基来中和胰蛋白酶。接着，将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在400 ×g条件下离心5分钟。用完全培养基重悬细胞。现在，我们可以通过40微米细胞筛过滤细胞，以去除残留的细胞团块或复合物。获得无团块的细胞悬液后，吸除旧的培养基，并将细胞沉淀重悬于预热的完全人胚胎干细胞培养基中。此时，我们需要将小鼠饲养层细胞与人胚胎干细胞分离。这样做的目的是确保后续仅对干细胞进行成像。为此，我们将细胞悬液转移至经明胶包被的10厘米培养皿中，将培养皿放入37°C培养箱，静置45分钟。在此期间，务必不要扰动培养皿。此时饲养层细胞会贴附于培养皿表面，而干细胞则不会贴附。我们将溶液从培养皿中转移出来，即可获得标记的人类胚胎干细胞单细胞悬液。现在我们可以对细胞进行计数，并对它们进行蓝染三重测试。在确认细胞活力后，我们的细胞即可用于成像。该幻灯片展示了一个示例，说明在将干细胞标记荧光对比剂并通过腹腔注射给予小鼠后，如何在活体小鼠中可视化这些干细胞。连续的光学成像扫描显示细胞最初在肺部聚集，随后重新分布至四肢的骨髓、肝脏和甲状腺。荧光标记还可用于在组织病理学标本中通过荧光显微镜直接显示移植的干细胞。我们刚刚向您展示了在进行细胞标记时如何使用荧光对比剂标记干细胞。务必记住对每一步骤进行标准化操作。我们这样做是为了确保标记效率和细胞活力的一致性，从而使不同实验的结果具有可比性。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的细胞标记实验顺利成功。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

与非侵入性检测荧光染料标记的干细胞与光学成像

为了评估新的干细胞疗法，重要的是能够以非侵入性方式在活体内追踪注射的细胞。本视频将向您展示如何在活体内用基于氧化铁的对比剂标记人类间充质干细胞和胚胎干细胞，以便随后进行活体磁共振成像。...

使用氧化铁纳米颗粒标记人胚胎干细胞和人骨髓间充质干细胞以实现磁共振成像无创体内示踪

我们介绍一种使用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的超顺磁性氧化铁（SPIO）——菲柔莫醇（Feraheme）对干细胞进行标记和追踪的技术。该细胞成像技术利用磁共振（MR）成像进行可视化，可便捷地用于患者干细胞移植成功或失败的长期监测与诊断。...

使用美国食品药品监督管理局批准的氧化铁纳米颗粒 Ferumoxytol 标记干细胞

组合使用5种荧光蛋白标记造血干细胞和祖细胞可实现 体内 通过共聚焦和双光子显微镜进行克隆追踪，揭示造血再生过程中骨髓造血结构的动态变化。该方法可在移植后长期、非侵入性地对光谱编码的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）来源的细胞在完整组织中进行命运图谱绘制。<br...

体内 克隆追踪标记有五种荧光蛋白的造血干细胞与祖细胞：基于共聚焦与多光子显微镜技术

本文介绍了使用R26R-Confetti小鼠进行多色谱系示踪实验的设计与操作原理，并提供了一种针对角膜上皮细胞追踪的具体实验方案，该方案可经修改后适用于其他感兴趣的组织。...

使用多色荧光报告小鼠对角膜细胞进行谱系示踪的方法

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本方案描述了一种通过关节内注射，在大鼠膝骨关节炎（KOA）模型中利用远红荧光标记高效监测人脂肪来源的间充质干细胞（haMSCs）细胞存留及生物分布的方法。...

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利用人原代前列腺上皮细胞，我们报道了一种基于球体的、无需生物标志物的功能性鉴定干细胞样细胞的新方法，该方法通过标记保留实验实现。本文详细描述了BrdU、CFSE或Far...

从三维球状体培养物中分离干细胞样细胞

本方案描述了通过自发荧光成像技术鉴定并富集原代成年小鼠神经干细胞培养物中特定细胞状态的策略，所用方法包括：i）共聚焦显微镜，ii）荧光激活细胞分选仪进行强度成像，或...

神经干细胞激活状态的分类 体外 利用自发荧光

本文所述的活体成像方法利用胶原蛋白的二次谐波生成以及代谢辅因子NAD(P)H的内源性荧光，对未标记的肿瘤微环境进行无创分割，将其划分为肿瘤、间质和血管等区域，从而实现对4D活体成像数据的深入分析。...

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小鼠门齿的干细胞微环境中含有宝贵的标记滞留细胞。我们建立了一种无偏倚检测和定量标记滞留细胞的新方法；本研究采用EdU标记，并在对下颌骨进行PEGASOS组织透明化处理后，结合三维重建技术进行分析。...

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利用可诱导的转基因谱系示踪小鼠品系，通过荧光蛋白对干细胞及其子代进行永久性标记，可实现对干细胞的活化、增殖、迁移和/或分化进行空间和时间上的分析 体内谱系示踪可揭示有关谱系定向、对干预措施的响应以及多能性方面的 novel...

成年小鼠大脑中可诱导荧光标记干细胞的谱系示踪

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