人鼻粘膜上皮细胞在气液界面培养

该程序的总体目标是在气液界面培养未分化的鼻上皮细胞。这是通过首先从人类志愿者那里获得浅表鼻上皮细胞来实现的。第二步是将细胞接种在组织培养板上，然后在培养瓶中扩增细胞。

接下来，将扩增的细胞接种到 transwell 中并生长至共流畅。最后一步是去除 transwell 上汇合细胞培养物的顶端组织培养基，以建立气液界面培养条件。最终，在气液界面生长 3 到 4 周的细胞将重新分化为粘膜纤毛鼻上皮细胞培养物，模拟体内鼻上皮的表型。

与培养、支气管上皮细胞或获得市售呼吸道上皮细胞等现有方法相比，该技术的主要优势在于研究者能够先验地设置用于采样鼻上皮细胞的群体。在支气管镜检查期间，鼻活检的侵入性比支气管刷活检小得多，因此可以对中度至重度疾病的疾病人群进行采样，而不会产生任何明显的副作用。虽然重要的是要记住这项技术对于研究吸入剂对正常呼吸道上皮的影响非常有用，但同样重要的是要记住，这些样本都来自独特的遗传互补，这使它们成为研究遗传疾病（如囊性纤维化和原发性纤毛运动障碍）的重要资源。

演示该程序的是我实验室的技术人员 Missy Brighton。在准备鼻刮活检座时，受试者直立坐在直背椅子上，头部略微向后倾斜，鼻端衬里的浅表上皮细胞将在直视下通过带有窥器的手术自动镜上的 9 毫米可重复使用的聚丙烯鼻窥器获得。该设备提供了鼻端的最佳可视化和运动的灵活性。

将自动镜窥器插入鼻孔，下端在照明下可视化。将无菌热塑性刮刮勺插入窥器，尖端向远端延伸到终端的背面，轻轻按压终端的下表面。将刮除器在粘膜表面拉动五次，然后缩回刮匙。

在刮匙杯中，毛细作用保持的粘膜细胞的成功回收将是显而易见的。将装有细胞的刮刀放入含有 8 毫升 RPMI 1 6 4 0 的 15 毫升锥形管中，并置于冰上以运输至实验室。使用镊子取出带有细胞的刮除器，然后使用 P 1000 移液器将细胞从刮匙中移出。

丢弃刮擦。通过鼻刮活检获得的鼻上皮细胞随后被放置在纯冷编码的 12 孔板中。以最小体积的支气管上皮细胞生长培养基或 BEGM plus 加上每孔约 80 至 100 微升加入涂层板的 1 至 4 个孔中开始此程序，具体取决于活检大小。

接下来，使用 P 1000 移液器小心地从试管中取出活检组织颗粒，不要吸出太多培养基。将沉淀转移到含有培养基的孔的中间。将活检作为一簇细胞放在一起。

不要拆散它。制备单细胞悬液。一个好的活检应该产生多达四个可以接种的孔。

将板放入组织培养箱培养物中。遵循方案和随附手稿的细胞，每天监测位于 12 孔板中的细胞，直到它们达到 80% 至 90% 的 co 流畅度，此时它们被转移到培养瓶中进行扩增。小心地从每个孔中吸出培养基，然后每孔添加 500 微升 25% 胰蛋白酶点。井。

将板保持在 37 摄氏度，直到细胞分离。这通常需要 2 到 3 分钟，通过上下移液来去除细胞，然后将分离的细胞转移到含有大豆 tripsin 抑制剂或 SBTI 离心机的 15 ml 锥形管中，以便在吸出后沉淀。S natin Resus 悬浮在 1 毫升 BEGM 加培养基中，并在试管中涡旋，根据沉淀大小在 T 25 或 T 75 培养瓶中扩增细胞。

本演示中使用了 T 75 培养瓶。向培养瓶中加入 5 毫升 BEGM 加培养基，然后将细胞悬液加入培养瓶中。将培养瓶转移到组织培养箱中。

在培养瓶中扩增 NEC 后，下一步是将细胞接种到组织培养小室上。从 T 75 培养瓶中取出培养基，加入 4 mL。胰蛋白酶将细胞在 37 摄氏度下孵育 2 到 3 分钟，直到细胞分离。

通过敲击培养瓶并上下移液来去除细胞。转移至含有 SBTI 的 15 mL 试管中。用 2 毫升冲洗培养瓶。

Hank's，平衡盐溶液并加入 15 毫升试管中，离心沉淀，然后去除 supra natin。仔细准备 12 孔板。在决定要接种多少块板后，用相同的代码和编号、传代编号和日期标记板。

将 700 微升 BEGM 加培养基添加到每个的基腔中。将细胞沉淀重悬于一毫升 B-E-G-M-A-L-I 中。通过涡旋试管来制备培养基。

用血细胞计数器计数细胞，然后用 B-E-G-M-A-L-I 培养基将细胞悬液循环至应接种的板量所需的总体积。将 200 微升细胞悬液添加到每个未包被的顶端。12 孔细胞插入片段。

将板转移到组织培养箱中以维持细胞培养物。每隔一天更换一次媒体。使用 B-E-G-M-A-L-I 培养基，基底隔室为 700 μL，根尖室为 200 μL。

插入片段必须浸没在水中，直到细胞完全汇合。在组织培养插入物上接种后 2 至 6 天，细胞应完全汇合，单层中没有可见的孔以建立气液界面或在视黄酸诱导后 48 小时形成 LI。去除所有培养基，仅在基底外侧添加 700 微升肺炎球菌 （一种 LI） 维持培养基。

顶端侧没有介质。将细胞培养物维持 4 周。有关建立和维持 LI 的程序的更多详细信息，请参阅随附的方案文本，按照本视频中演示的方案培养的人类 NEC 再分化为由代表体内情况的纤毛和非评级细胞组成的 ECS 异质层。

将 NECs 固定在 4% FA 中并包埋在石蜡 NECs 中。用血红素和伊红染色的培养物显示在图 A 中，一些分化的 NEC 是产生粘液的杯状细胞，在图 B 中由 Ian Blue 以蓝色识别。高碘酸位移染色 A NEC 培养物的血红素和伊红染色石蜡包埋切片的这张图像显示了使用不同方案和培养基配方的次优未分化 NEC 的示例。

与上图中观察到的情况相反，这里的细胞是鳞状的，既不是立方体也不是附属的，并且不模拟假性分层的呼吸道上皮。所有这些程序的一个关键点是第一个，那就是获取一个非常好的鼻上皮样本。这导致整个培养系统的发展和良好的分化上皮的体外发展遵循此程序。

R-T-P-C-R、蛋白质印迹、EIA 以及许多其他细胞和生化技术等方法可用于回答与吸入剂或病原体诱导的反应相关的问题。并非每次鼻刮擦活检都能成功培养。这将取决于受试者的状况以及收集的组织状况。