Name: 全球合成的RNA在单细胞水平以下的低氧分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 了解利用点击化学标记和荧光显微镜在单细胞水平定量分析低氧条件下新生RNA合成的方法。该技术可直观展示细胞间RNA变化，为研究细胞应激反应提供有力工具。

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JB 是英国癌症研究会（CRUK）的临床研究员，AS 是惠康信托基金会（Wellcome Trust）的博士生，SR 实验室由英国癌症研究会高级研究奖学金（C99667/A12918）资助。本工作得到了两项惠康信托基金会战略奖（097945/B/11/Z 和 095931/Z/11/Z）的支持。

1.&#160;细胞培养与处理
<ol>
	<li>收集 表1 中列出的试剂和设备，用于培养人骨肉瘤（U2OS）细胞。所有试剂的配制及组织培养操作均需在层流通风罩内进行，以确保无菌环境。</li>
	<li>按以下方法配制培养基：向DMEM中加入50 ml FCS、5 ml L-谷氨酰胺和5 ml 青霉素/链霉素，使终浓度分别为10%（FCS）、2 mM（L-谷氨酰胺）、50 U/ml（青霉素）和50 U/ml（链霉素）。将培养基在37 °C&#160;水浴中预热。</li>
	<li>准备细胞以进行处理：
	<ol>
		<li>将若干盖玻片在70%乙醇中灭菌，晾干后分别放入六个3.5 cm培养皿底部。</li>
		<li>将盖玻片浸入2 ml预热的完全DMEM培养基（37 °C），用盖玻片镊轻轻按压，确保其牢固贴附于培养皿底部。</li>
		<li>用3 ml PBS洗涤U2OS细胞一次，加入4 ml预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA（1%），37 °C孵育7 min，使细胞从组织培养皿上脱落。</li>
		<li>用6 ml预热的完全DMEM重悬细胞，以灭活胰蛋白酶-EDTA，并用血细胞计数板计数。</li>
		<li>将2 × 105个细胞接种至步骤1.3.1中准备好的每个3.5 cm培养皿中。轻轻晃动培养皿，确保细胞分布均匀。处理前让细胞贴壁过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将四个3.5 cm培养皿放入低氧工作站，另两个3.5 cm培养皿保留在37 °C、常氧条件的培养箱中，对细胞进行处理。在低氧处理结束前1 hr&#160;，准备在处理条件下&#160;（低氧处理细胞在低氧舱内）&#160;开始RNA标记实验。</li>
	<li>将细胞分别暴露于低氧环境1 hr 15 min、1 hr 30 min、2 hr和24 hr。这些时间点可根据实验需求灵活设定。</li>
	<li>使用一个常氧条件下的3.5 cm培养皿作为阳性对照，另一个在常氧条件下用放线菌素D（终浓度10 µg/ml）处理4 hr&#160;的3.5 cm培养皿作为阴性对照。放线菌素D是全局RNA合成的抑制剂。</li>
</ol>
注意事项：
Hoechst 33342 是一种已知的致突变剂。 
DMSO 可促进有机分子进入组织。 
NaOH 具有腐蚀性。 
HCl 具有腐蚀性。 
多聚甲醛对所有动物均具有高毒性，可导致人类死亡。 
Triton X-100 在直接接触后可能引起皮肤刺激。 
放线菌素D在接触皮肤或吞食时具有毒性。 
处理所有危险化学品时应采取适当的预防措施。
2.&#160;Click-iT 检测
<ol>
	<li>除 Click-iT 检测试剂盒外，还需准备以下试剂：磷酸盐缓冲液（PBS）pH 7.2 - 7.6、含 3.7% 多聚甲醛（PFA）的 PBS、含 1% Triton X-100 的 PBS、去离子水（dH2O）、&#160;二甲基亚砜（DMSO）、10 M 氢氧化钠（NaOH）和 37% 盐酸（HCl）；可选：pH 指示试纸。</li>
	<li>在进行 Click-iT 反应前，按以下步骤新鲜配制 PFA 储存液：
	<ol>
		<li>将 1.85 g PFA、3.5 ml dH2O 和 10 µl 10 M NaOH 加入一个 50 ml Falcon 管中。在微波炉中加热 300 - 400 ml H2O 至沸腾，制成水浴，并置于通风橱中。</li>
		<li>将 50 ml Falcon 管放入水浴中，轻轻振荡 10 分钟，期间周期性松开管盖，直至 PFA 完全溶解。</li>
		<li>使用注射器将 PFA 溶液经 0.2 µm 滤膜过滤至另一 50 ml Falcon 管中，得到 37% 的溶液。</li>
		<li>用 PBS 稀释该溶液 10 倍&#160;，并加入约 12 µl 浓 HCl 调节 pH 至 6.8。可选：在通风橱中使用 pH 试纸确认 pH 值是否正确。</li>
		<li>立即使用或于 4 °C 下保存过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下步骤配制 RNA 成像试剂盒的储存液：
	<ol>
		<li>向组分 A 中加入 373 µl dH2O，配制成 100 mM 的 EU 储存液。于 -20 °C 保存，最长可保存一个月。</li>
		<li>向组分 B（Alexa Fluor 594）中加入 85 µl DMSO，通过移液或涡旋混匀。两种溶液均于 -20 °C 保存，最长可保存一年。</li>
		<li>向组分 E 中加入 2 ml dH2O，配制成 10X 的 RNA 成像试剂盒反应缓冲液添加剂。于 -20 °C 保存，最长可保存一年；若溶液变为棕色则弃用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞 EU 标记：使用步骤 2.3 配制的 100 mM EU 储存液，在预热的完全培养基（37 °C）中配制 2X 工作液。对于经低氧处理的细胞，本步骤及步骤 2.5 的其余操作均需在低氧培养箱中进行。&#160;将等体积的 2X 工作液加入含细胞的培养基中，稀释至 1X。在相应的细胞培养处理条件下孵育 1 小时。</li>
	<li>细胞固定：用 PBS 每孔洗涤一次，然后在相应处理条件下加入 1 ml 步骤 2.2 配制的 3.7% PFA 储存液。在相应处理条件下孵育 15 分钟&#160;。经低氧处理的样品此时可从低氧培养箱中取出。吸除固定液，并用 PBS 每孔洗涤一次（请妥善处理 PFA 废液）。后续步骤在室温下进行。</li>
	<li>通透化处理：吸除洗涤液，每孔加入 1 ml 含 1% Triton X-100 的 PBS。室温孵育 15 分钟&#160;。吸除通透化缓冲液，并用 PBS 每孔洗涤一次。</li>
	<li>标记 RNA 的检测：
	<ol>
		<li>将步骤 2.3 配制的 10X RNA 成像试剂盒反应缓冲液添加剂用 dH2O 按 1:10 稀释，新鲜配制 1X 工作液。</li>
		<li>根据 表 2 配制 RNA 成像试剂盒反应混合液，现配现用。</li>
		<li>吸除洗涤液，每孔加入 500 µl RNA 成像试剂盒反应混合液。室温孵育 30 分钟&#160;，避光操作。</li>
		<li>吸除 RNA 成像试剂盒反应混合液，用 1 ml RNA 成像试剂盒反应清洗缓冲液（组分 F）洗涤一次，然后吸除清洗缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选多重反应：此时可根据制造商建议对样品进行额外的抗体标记。</li>
	<li>DNA 染色：用 PBS 洗涤样品后吸除洗涤液。将 Hoechst 33342（组分 G）用 PBS 按 1:1,000 稀释。每孔加入 1 ml 稀释后的 Hoechst 33342，室温孵育 15 分钟&#160;，避光操作。吸除 Hoechst 33342 溶液，用 PBS 洗涤细胞两次。吸除洗涤液后进行光学显微镜观察。</li>
</ol>
3.&#160;光学显微镜
<ol>
	<li>封片：
	<ol>
		<li>在标准显微镜载玻片中央滴加 10 µl 封片剂。</li>
		<li>将盖玻片细胞面朝下置于载玻片中央，覆盖住封片剂液滴。操作时应避免产生气泡，以免影响后续成像。</li>
		<li>用透明指甲油涂抹盖玻片边缘，将其固定于载玻片上。室温下静置 5 分钟&#160;使其干燥。避光保存。封片后样品可于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集：使用具备荧光检测功能的宽场显微镜进行图像采集。Alexa Fluor 染料以及 Hoechst 33342 与 DNA 结合后的近似荧光/激发发射最大值见表 3。</li>
	<li>采用 40X/1.30 NA 油浸物镜进行成像，并使用冷却 CCD 相机采集图像。</li>
</ol>
4.&#160;数据分析
<ol>
	<li>在将图像导入 OMERO 客户端之前，使用图像处理软件（参见材料表）对图像进行去卷积处理。在显微镜图像可视化与分析软件中，通过将对照常氧细胞的渲染设置应用于所有其他条件，对同一实验中所有图像的渲染设置进行归一化处理。</li>
	<li>使用显微镜图像可视化与分析软件中的感兴趣区域（ROI）工具（参见材料表），从每幅图像中选择细胞核。选择强度分析选项，并选取30至50个细胞，获取每个ROI的平均强度值，并计算每种条件下的平均值和标准差。</li>
	<li>使用数据绘图软件（参见材料表），将步骤4.2中获得的所有单个平均强度值绘制成散点图，以反映每种条件下细胞间的变异性。或者，可绘制柱状图以表示新生RNA的平均强度均值及其标准差。</li>
</ol>

<ol><li>Kenneth, N. S., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gene+expression+by+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of gene expression by hypoxia.</a> Biochem J. 414, 19-29 (2008).</li>
<li>Appelhoff, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+function+of+the+prolyl+hydroxylases+PHD1%2C+PHD2%2C+and+PHD3+in+the+regulation+of+hypoxia-inducible+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor.</a> J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).</li>
<li>Lancaster, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+dimerization+and+substrate+phosphorylation+inhibit+factor+inhibiting+hypoxia-inducible+factor+%28FIH%29+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity.</a> Biochem J. 383, 429-437 (2004).</li>
<li>Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+under+low+oxygen%3A+holding+your+breath+for+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription.</a> Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).</li>
<li>Schodel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+genome-wide+mapping+of+HIF-binding+sites+by+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq.</a> Blood. 117, (2011).</li>
<li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).</li>
<li>Breinbauer, R., Kohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azide-alkyne+coupling%3A+a+powerful+reaction+for+bioconjugate+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry.</a> Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+by+copper%28I%29-catalyzed+azide-alkyne+%5B3+%2B+2%5D+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition.</a> J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%22ligation%22+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry%3A+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li>
<li>Allan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMERO%3A+flexible%2C+model-driven+data+management+for+experimental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology.</a> Nat Methods. 9, 245-253 (2012).</li>
<li>Culver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+hypoxia-induced+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB.</a> Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry+of+DNA+replication+and+RNA+synthesis%3A+Historical+perspective+and+recent+advances+based+on+%22click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on "click chemistry.</a> Cytometry A. 79, 328-337 (2011).</li>
</ol>

J.R.S. 是 Glencoe Software, Inc. 的创始人，这是一家位于美国、以开源方式运营的商业公司，为 OMERO 项目做出贡献。

我们描述了使用RNA成像试剂盒来研究缺氧对骨肉瘤（U2OS）细胞中RNA合成影响的方法。该技术相对简单，可提供单细胞水平上的全局转录信息。我们对试剂盒的传统操作流程进行了改进，使其能够在缺氧培养箱中进行标记。据我们所知，这是首次报道利用该技术检测缺氧条件下RNA合成变化的研究。我们使用的RNA成像试剂盒适用于缺氧环境下的实验，因其无需放射性同位素，且在技术上与受控气氛工作站的操作限制相兼容。该技术常见的问题主要涉及样本的固定和标记效率。用于固定样本的PFA必须新鲜配制，且在“点击”反应后的洗涤步骤必须严格按照说明操作，以确保样本背景染色较低。如果出现背景荧光过高的问题，建议在步骤2.7.4之后再用1 ml RNA成像试剂盒反应清洗缓冲液洗涤一次。
此处提到的RNA成像试剂盒在使用便捷性、特异性和反应速度方面代表了RNA成像技术的重要进步。该技术的主要局限在于样品标记所需的时间。该RNA成像试剂盒需要1小时的标记时间，因此无法检测在此时间段内通常发生的全局RNA快速变化。正因如此，我们的首个时间点被限制为1小时15分钟。该技术的其他局限性较少，主要涉及试剂与其他荧光标记物的兼容性问题；例如，该RNA成像试剂盒与鬼笔环肽染色不兼容。
目前所有研究细胞内RNA合成的方法均基于将修饰核苷掺入新生RNA，并通过不同手段检测所掺入的标记物。早期开创性方法采用放射性标记的RNA前体，随后通过放射自显影技术进行检测。该方法促成了细胞周期各阶段及其他重要发现；然而，其存在诸多缺点，例如放射性操作繁琐、放射自显影曝光时间长以及图像分辨率低6。该领域后续进展利用免疫化学手段，以避免使用放射性物质。通过将BrU掺入RNA，再利用免疫化学方法进行检测。然而，高效的抗体结合需要对核酸进行变性处理，以提高对DNA或RNA的可及性，但这会导致细胞形态丧失，并破坏多种蛋白质的抗原表位，从而阻碍其后续与荧光标记抗体的检测13。点击化学（click chemistry）技术的引入，使检测步骤相较于放射自显影和免疫化学方法更为简便。该技术基于叠氮-炔烃Huisgen环加成反应，其中5-乙炔基尿苷的末端炔基在Cu(I)存在下与连接荧光染料的叠氮基团发生反应。该反应具有特异性强、反应迅速、无需额外步骤等优点，并且可轻松与细胞其他组分的免疫化学检测相兼容。
利用这种RNA成像技术，我们发现处于同一单层群体中的细胞在缺氧条件下表现出不同的RNA合成水平。本实验仅限于研究RNA生成的影响；然而，使用该RNA成像试剂盒完全有可能进行经过修饰的多重反应，从而实现对RNA生成更复杂的分析。例如，可通过使用特异性识别活跃转录标志物的抗体进行二次染色，如磷酸化RNA聚合酶II的水平，甚至可检测翻译机制的组分，以评估新合成RNA转化为蛋白质的程度。此外，还可检测其他蛋白质，如肌动蛋白（Actin），该蛋白质在缺氧条件下表达应无明显变化，可作为额外的对照。此外，还可测试不同类型的细胞，因为不同细胞很可能具有不同的RNA合成速率，甚至对缺氧产生不同的响应。
只要按照说明进行操作，该RNA成像试剂盒的使用非常简便。实验方案中的关键步骤包括细胞接种、细胞固定与染色以及图像采集。必须按照所述密度接种细胞，以避免实验时细胞密度过高或过低，否则将显著影响实验结果。使用新鲜的固定剂非常重要，以确保获得细胞状态的最佳“快照”；染色后洗涤细胞时也需小心操作，以将背景信号降低至适合高效分析的水平。最后，图像采集方法对于获得高质量图像以进行后续分析至关重要。我们建议使用尽可能优质的光学显微镜来观察样本，例如本实验方案中所使用的显微镜，此类设备在全球大多数科研密集型中心均可获得。

当组织的正常氧气供应受到干扰时，就会发生缺氧（低氧张力）。环境中的氧气既是一种营养物质，也是一种信号分子，为多种细胞类型提供重要的调控信号。环境氧浓度的变化由一组双加氧酶感知，这些酶调控一类称为缺氧诱导因子（Hypoxia Inducible Factors, HIFs）的关键转录因子家族的活性。HIF由两个亚基组成，即α和β亚基。目前已知存在三种HIF-α亚型（1、2和3），以及多种HIF-1β的剪接变体。HIF-1β组成性表达，且不受环境氧浓度的调控1。HIF-α家族成员则受到一类脯氨酰羟化酶（PHDs）和HIF抑制因子（FIH）的动态调控；这两种酶均需要氧气作为辅因子，以催化HIF-α的羟基化反应2,3。在常氧条件下，HIF-α家族成员被羟基化，并被E3泛素连接酶von Hippel Lindau（vHL）标记，进而被蛋白酶体降解。在缺氧条件下，PHDs和FIH失活或活性降低，导致HIF-α亚型稳定存在，与HIF-1β形成异源二聚体，并启动一系列基因的转录，从而介导细胞对缺氧环境的应答（图1A）4。
目前的RNA分析技术主要集中在对特定细胞群体的平均值进行定量。细胞在低氧刺激下会启动大量基因的转录，以适应其恶劣的环境5。然而，低氧通常以梯度形式存在，处于低氧环境中的细胞所受到的低氧刺激并不均一。本文介绍了一种在氧浓度可控的工作站中应用Click-iT RNA成像试剂盒的方法，用于在单细胞水平上研究低氧条件下的全局RNA合成。
RNA成像试剂盒利用一种炔基修饰的核苷——5-乙炔基尿苷（EU），并通过化学选择性连接反应，实现对细胞和组织中全局RNA合成在时间和空间上的检测6。&#160; 简而言之，细胞经低氧处理后，在含有EU的培养基中培养。随后固定并通透化细胞，通过将EU与含叠氮染料进行化学选择性连接，检测EU掺入新生RNA的情况。该反应的典型操作流程见图1B。我们使用RNA成像试剂盒在单细胞水平上检测了低氧处理所诱导的RNA合成情况。
炔基标签体积小，能够高效地将修饰核苷酸特异性地掺入RNA中。这种化学选择性连接反应（即“点击”反应）具有高效、快速且特异性强的特点7-10。所有反应组分均对生物体系无干扰，且反应无需极端温度或溶剂条件。点击反应无需传统的放射性标记，结果可直接通过发光进行可视化检测。此外，检测分子易于穿透复杂样品，从而实现多重分析，包括使用抗体检测与RNA相互作用的蛋白质。该RNA成像检测方法适用于多种有机荧光染料，包括Alexa Fluor和荧光素（FITC）。
我们利用开放显微镜环境远程对象系统（OMERO）检测了细胞处理后RNA合成的变化。OMERO是开源软件，可从<a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a> 获取。该显微镜图像可视化与分析软件可访问并使用多种生物数据，包括多维异质数据集的管理。客户端应用程序支持复杂生物图像数据的远程可视化与分析11；我们使用该软件量化了整体及单个细胞RNA合成的视觉变化。以下展示了利用该显微镜图像可视化与分析软件分析RNA成像实验所需的数据和步骤。
我们观察了人骨肉瘤（U2OS）细胞在低氧条件下处理长达24小时后全局RNA合成的变化。在所有实验条件下，均检测到细胞间RNA生成水平存在差异。短时间的低氧暴露并未导致细胞中新合成RNA水平发生显著变化。然而，暴露于低氧环境24小时&#160;后，细胞中RNA的合成量显著增加。大多数细胞对低氧的反应通常在长时间暴露（如4至24小时）后进行检测。然而，某些机制在更早阶段即已被激活，例如：NF-κB的激活可在低氧暴露后5-15分钟内发生12。因此，有必要对更短时间的低氧暴露进行研究，以排除细胞周期和凋亡等更为复杂的响应过程的干扰。

<table><tbody><tr><td>U2OS 原代细胞</td><td>欧洲细胞培养物保藏中心</td><td>92022711</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>吉布科</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>吉布科</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>吉布科</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>隆扎</td><td>DE17-603E</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>隆扎</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1%)</td><td>吉布科</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>低氧培养箱</td><td>拉斯金</td><td>InVivo&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 300</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT 检测试剂盒</td><td>英维特罗根</td><td>C-10329/C10330</td><td></td></tr><tr><td>pFA</td><td>西格玛</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>西格玛</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>西格玛</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>37% HCl</td><td>VWR</td><td>20252.335</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield 封片剂</td><td>向量实验室</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>放线菌素 D</td><td>西格玛</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision Core 显微镜</td><td>应用精密公司</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>softWoRx</td><td>应用精密公司</td><td>N/A</td><td>文中称为图像处理软件。</td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 CCD 相机</td><td>光度学公司</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>远程对象开放显微镜环境（OMERO）</td><td>OME</td><td>N/A</td><td>文中称为显微镜图像可视化与分析软件。</td></tr><tr><td>SigmaPlot v12.0</td><td>Systat 软件公司</td><td>N/A</td><td>文中称为数据绘图软件。</td></tr></tbody></table>

缺氧后单细胞水平全局rna合成分析

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

缺氧或氧气供应减少参与多种生理和病理过程。在分子水平上，细胞会启动特定的转录程序，以产生适当且协调的细胞反应。细胞具有多种需要分子氧作为辅因子的氧感应酶，这些酶包括从脯氨酰羟化酶到组蛋白去甲基化酶等。目前大多数关于细胞对缺氧反应的研究均基于细胞群体和整体平均水平分析，因此对单个缺氧细胞的分析较为少见。本文介绍一种在氧控工作站中利用Click-iT RNA成像试剂盒，在单细胞水平上分析缺氧条件下全局RNA合成的方法，随后进行显微镜观察与定量分析。&nbsp; 通过将癌细胞暴露于不同时间长度的缺氧环境，可在每个细胞中标记并测量RNA。该分析方法能够可视化缺氧应激后全局RNA合成在时间和细胞间的变化情况。

RNA成像试剂盒反应的示意图见图1B。我们利用该反应在单个细胞（单细胞水平）和整体细胞群体（群体水平）上定量测定U2OS细胞在缺氧处理后的总RNA合成情况。细胞经缺氧处理后，在含有EU的培养基中培养。随后固定并透化细胞，通过EU与含叠氮染料之间的化学选择性连接反应检测EU的掺入情况。该“点击”反应产生可被荧光显微镜检测和定量的荧光信号。图2A展示了本实验的典型结果。荧光标记的细胞以伪红色显示，图像已在开放显微镜环境（OMERO）中打开。该显微镜图像可视化与分析软件内置有ROI工具，可用于选择特定的亚细胞结构，并对选定区域内的图像强度进行定量分析。在客户端程序中使用该工具后得到的典型数据输出如图2B所示；图中列出了各个单细胞的荧光强度，同时附有实验的代表性图像作为视觉对照，以确保数据的有效性。
可以将单个细胞的荧光强度绘制成散点图，以显示处理细胞群体中单个细胞强度的分布情况。图2C展示了此类图形的一个示例。以这种方式绘制强度数据具有重要意义，因为它能够快速比较不同处理条件的结果，并清晰地揭示出使用常规数据表示方法时可能被掩盖的细胞群体内的显著异质性。本实验中这种响应异质性具有重要意义：尽管对细胞施加了均匀的缺氧刺激，但显然来自同一单层细胞群体的每个细胞对该刺激的响应均不相同。
图2D展示了本实验的总体结果。该柱状图中绘制的数据为各处理组内所有细胞荧光强度的平均值。采用学生t检验计算了各处理组与对照组之间差异的统计学显著性。有趣的是，这些数据表明，当U2OS细胞经低氧处理超过1小时30分钟时，其全局RNA合成随时间呈统计学显著增加（*p &lt; 0.01；**p &lt; 0.05；***p &lt; 0.001；n &gt; 30）。这些结果表明，在较长时间的低氧处理后，即使处于这种不利的低氧环境中，细胞仍会将其资源集中用于RNA的合成。如预期所示，放线菌素D处理完全消除了荧光信号强度。
<img alt="HIF 通路示意图；蛋白酶体降解、DNA 结合、缺氧处理步骤；基因调控。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
	图 1. A. HIF 系统响应细胞氧水平的变化。在此简化的示意图中，缺氧通过抑制脯氨酰羟化酶（PHDs）对 HIF-α 的羟基化（-OH）及其随后由 von-Hippel Lindau 蛋白（vHL）介导的多聚泛素化，从而稳定 HIF 异源二聚体。HIF 的稳定导致大量基因的激活，这些基因有助于细胞应对缺氧状态。B. 可通过 Click-IT 检测法检测 RNA 合成；在处理后用 EU 标记细胞，Click 反应可检测 RNA 合成，并通过荧光强度和光学显微镜进行定量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="RNA合成分析；显微镜图像、数据表、散点图和柱状图；缺氧研究结果。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
	图2. A. 来自OMERO的截图，显示RNA标记后的典型显微输出。该显微图像可视化与分析软件可通过其内置的ROI宏快速提取单个细胞水平的强度数据。该命令输出结果的截图如B所示。C中的散点图展示了单个细胞强度值的分布范围，据此可推断全局RNA合成水平。D为这些汇总数据的形式化表示。*p &lt; 0.01；**p &lt; 0.05；***p &lt; 0.001；n &gt; 30。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图。</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>细胞培养试剂</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>磷酸盐缓冲液 (PBS)，pH 7.2 - 7.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胎牛血清 (FCS)，滤膜除菌</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素/链霉素</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酰胺</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% 乙醇</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>放线菌素 D (1 μg/μl 储存液)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞培养设备</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无菌巴斯德吸管</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>一系列适用于细胞培养与处理的细胞培养级塑料器皿</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 °C 恒温水浴锅</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>层流洁净工作台</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 °C、5% CO2 培养箱</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>低氧工作站，设定为 37 °C、5% CO2、1% O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>玻璃盖玻片</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>精密镊子</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>血细胞计数板</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 培养U2OS细胞所需的试剂与设备。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="514">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">反应组分</td>
			<td colspan="6">盖玻片数量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT RNA 反应缓冲液（组分 C）</td>
			<td>428 μl</td>
			<td>856 μl</td>
			<td>1.7 ml</td>
			<td>2.1 ml</td>
			<td>2.58 ml</td>
			<td>4.3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4（组分 D）</td>
			<td>20 μl</td>
			<td>40 μl</td>
			<td>80 μl</td>
			<td>100 μl</td>
			<td>120 μl</td>
			<td>200 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 叠氮化物（步骤 2.3 中配制）</td>
			<td>1.8 μl</td>
			<td>3.7 μl</td>
			<td>7.4 μl</td>
			<td>9.3 μl</td>
			<td>11.28 μl</td>
			<td>18.8 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT 反应缓冲液添加剂（步骤 2.3 中配制）</td>
			<td>50 μl</td>
			<td>100 μl</td>
			<td>200 μl</td>
			<td>250 μl</td>
			<td>300 μl</td>
			<td>500 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>近似总体积</td>
			<td>500 μl</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>2 ml</td>
			<td>2.5 ml</td>
			<td>1.5 ml</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. RNA成像试剂盒反应混合液： 参考表格，详细列出根据待染色盖玻片数量确定的RNA成像试剂盒反应中主混合液各组分的比例。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>荧光染料</td>
			<td>激发波长 (nm)</td>
			<td>发射波长 (nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>495</td>
			<td>519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, 结合DNA后</td>
			<td>350</td>
			<td>461</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. 荧光/激发发射最大值： Alexa Fluor 染料和 Hoechst 33342 与 DNA 结合后的大致荧光/激发发射最大值。

我们介绍一种利用成像技术在缺氧条件下分析全局RNA合成的方法。此前尚未在缺氧条件下进行过基于点击化学的RNA标记，该技术可实现单细胞水平上全局RNA变化的可视化。该方法补充了现有的平均化RNA检测技术，能够直接观察细胞间全局RNA合成的差异。

缺氧后单细胞水平全局RNA合成分析

缺氧或氧气供应减少参与多种生理和病理过程。在分子水平上，细胞会启动一系列...

本实验的总体目标是通过定量成像分析，对在特定处理条件下产生的新生RNA进行荧光标记并定量。将培养在盖玻片上的细胞用烯烃修饰的碱基——即后续所述的5-乙炔基尿苷（5-EU）——处理，并在低氧条件下孵育。孵育过程中，5-乙炔基尿苷（five EU）会在不干扰细胞转录机制的情况下被整合到RNA合成过程中。随后，通过铜催化的叠氮-炔环加成反应（即点击化学反应），将已整合的5-乙炔基尿苷进行荧光标记。利用荧光显微镜对标记后的新生RNA进行成像，并分析所得图像，以比较处理组与对照组条件下生成的RNA量。对所得数据的统计分析显示了通过荧光显微镜定量五个 EU 掺入来检测缺氧条件下新生 RNA 生成的变化。该技术相较于现有方法（如定量 BCR）的主要优势在于，能够在单细胞水平上直接可视化细胞内的 RNA 生成。尽管本文中使用该方法研究细胞对低氧的响应，但它也可用于研究细胞对化疗药物的响应。接下来，我们将展示应对额外应激反应的实验步骤，由本实验室的研究生 John Leston 演示，Ish Kova（同样为研究生）和 Humana Druker（博士后研究员）协助完成。最后，Gus Ferguson 将演示图像可视化软件的使用方法。实验开始时，将数个盖玻片浸入 70% 乙醇中以进行消毒。将盖玻片放置在组织培养操作台内培养皿的边缘，在层流条件下使其自然风干。待盖玻片干燥后，将每片分别放入六个3.5厘米的培养皿中，每个培养皿中加入2 mL温热的完全DMEM培养基。用镊子用力按压，确保每张盖玻片牢固贴附于孔板底部。接下来，用三毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，以使U2 OS细胞从组织培养皿上脱离。然后加入四毫升预热的0.05%胰蛋白酶和1%EDTA溶液，在37摄氏度下孵育七分钟。七分钟后，加入六毫升预热的完全 DMEM 培养基重悬细胞，以中和胰蛋白酶 EDTA 的作用。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将每皿含有盖玻片的 3.5 厘米培养皿接种 2 × 10⁵ 个细胞。轻轻摇晃培养皿以确保细胞分布均匀，随后于 37°C、21% 氧气、5% 二氧化碳条件下培养过夜，使细胞贴壁。第二天，从培养箱中取出五皿；剩余的一皿保持不动，作为常氧阳性对照。将其中四个培养皿放入低氧工作站中，分别暴露于低氧条件下 75 分钟、90 分钟、2 小时和 24 小时。对另一个培养皿进行相应处理。向培养基中加入放线菌素 D，使其终浓度为 10 微克/毫升，并将培养皿放回 37 摄氏度、正常氧条件的培养箱中孵育 4 小时。此培养皿作为常氧阴性对照。在细胞孵育的同时，准备并收集以下试剂，以备后续进行点击化学检测。使用 pH 为 7.2 至 7.6 的 PBS 配制的 Click it 检测试剂盒，含 PBS 中的 3.7% 甲醛、PBS 中的 1% Triton X-100、去离子水、二甲基亚砜、10 摩尔氢氧化钠、37% 盐酸以及 pH 指示试纸。您应提前做好准备，以便在未经处理的条件下立即开始标记检测。在低氧处理结束前一小时，为标记细胞，需将 100 毫摩尔的 EU 储存液用预热的完全培养基稀释，制备成 2 倍工作液。接下来，向含有放线菌素D处理细胞的培养皿中的培养基加入等体积的2 XEU，使EU稀释至工作浓度。然后在低氧舱内，将EU储备液加入经低氧处理的细胞中。低氧处理后，在相应的细胞培养条件下孵育1小时；对照组则孵育4小时。用 PBS 每个培养皿冲洗一次，然后在处理条件下加入 1 毫升 3.7% 甲醛储备液，于处理条件下孵育 15 分钟。固定完成后，将细胞从低氧舱中取出并置于通风橱内。小心倾倒弃去固定液，并妥善处理甲醛废液。然后用 PBS 洗涤细胞一次。后续步骤在室温下进行，所有溶液需置于 2 至 6 摄氏度的冰上保存。为了透化细胞，移除洗涤液后，每孔加入 1 毫升含 1% Triton X-100 的 PBS，室温孵育 15 分钟。移除渗透缓冲液，每孔用 PBS 洗涤一次。吸去细胞中的洗涤液，每份样品加入 500 µL 新鲜配制的 RNA 成像试剂盒反应混合液。避光孵育，室温下孵育 30 分钟。孵育结束后，去除RNA成像试剂盒的反应液、混合液和洗涤液。使用一毫升RNA成像试剂盒反应缓冲液清洗一次，此时应进行任何额外的抗体标记步骤。如需对DNA进行染色，先用PBS清洗样品，然后将赫斯特33342稀释至1:1000。在 PBS 中，向每个样品中加入一毫升稀释后的 HERC 溶液。避光，室温孵育 15 分钟。孵育结束后，移除 HERC 溶液，并用 PBS 洗涤细胞两次，然后封片。在标准显微镜载玻片的中央滴加10微升封片剂。将盖玻片细胞面朝下覆盖在封片剂液滴上，避免产生气泡，以免影响后续图像采集。在盖玻片边缘涂抹透明指甲油，以将其固定在显微镜载玻片上。室温下静置五分钟，待指甲油完全干燥。避光保存的样品可置于负20摄氏度环境中储存。封片后，使用具备荧光检测功能的宽场显微镜获取图像。采用40倍、1.30数值孔径的油浸物镜进行成像，并用冷却CCD相机采集图像。图像采集后，至少分析30个细胞。使用图像处理软件对图像进行校正。通过将基于软件的数学公式应用于所采集的图像，可校正光学畸变。结果将获得更清晰的图像，从而确保后续分析仅限于成像的细胞。接下来，将图像导入 Omer O 客户端。所有获取的图像缩略图将并列显示，以便对同一次实验中的所有图像进行渲染设置的归一化。使用分析软件中的感兴趣区域（ROI）工具，将对照常氧细胞的渲染设置应用到所有其他条件的图像上。在软件中选择每张图像的细胞核。选择强度分析选项，获取每个 ROI 的 30 至 50 个细胞的平均强度。保存数据，然后计算每种条件的平均值和标准差。最后，使用数据绘图软件绘制所有单个平均荧光强度值的散点图，以反映每种条件下细胞间的变异性。以这种方式绘制强度数据具有重要意义，因为它能够快速比较不同处理组的结果，并清晰展示处理组细胞群体中存在的显著异质性，而这种异质性在常规数据表示方法中往往被掩盖。或者，可构建柱状图来表示新生 RNA 的平均荧光强度及其标准差，以定量测定经缺氧处理并在存在5-乙炔基尿苷（EU）条件下培养的U2 OS细胞中的总RNA合成水平。如本视频所示，对每种处理组中所有细胞的荧光强度取平均值并进行绘图。在该柱状图中，采用学生t检验来计算各处理组与对照组之间存在显著差异的统计学概率。有趣的是，这些数据表明，随着时间推移，全局RNA合成呈现统计学上显著的增加。当U2 OS细胞在缺氧条件下处理超过一个半小时时，如预期一样，放线菌素D处理会完全消除荧光强度。这些数据表明，在较长时间的缺氧处理后，细胞会将其资源集中用于RNA的合成，即使在这一恶劣的缺氧环境中也是如此。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在单细胞水平上对缺氧和常氧条件下的新生RNA进行标记与定量。一旦熟练掌握，按照本方案可在两小时内完成该技术操作。还可通过 RNA 聚合酶和 HIF-1 的抗体共染色等方法，检测 RNA 聚合酶水平是否发生变化以及 HIF 是否被激活。进行此操作时，请注意甲醛具有极高危险性，务必佩戴手套并在通风橱中操作。

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科研

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