全球合成的RNA在单细胞水平以下的低氧分析

该程序的总体目标是使用定量成像分析对治疗条件下产生的新生 RNA 进行荧光标记和定量，以实现这一目标。铺在盖玻片上的培养细胞用 alkein 改性基质处理。五乙酸尿苷以下简称五乙酸尿苷，并在缺氧条件下孵育。

在孵育过程中，在 RNA 合成过程中掺入 5 个 EU，而不会中断细胞转录机制。接下来，通过铜催化的叠氮化物aine cyclo edition 或点击反应对掺入的 5 EU 进行荧光标记。然后通过荧光显微镜对荧光标记的新生 RNA 进行成像，并分析所得图像以比较在处理和对照条件下产生的 RNA 量。

所得数据的统计分析通过荧光显微镜对 5 个 EU 掺入进行定量和检测，显示了响应缺氧而产生新生 RNA 的变化。与定量 BCR 等现有方法相比，该技术的主要优点是它允许在单细胞水平直接观察细胞中 RNA 的产生。虽然这里我们使用这种方法来研究细胞对低氧的反应，但它也可以用于研究对化疗药物的反应。

我们对演示程序的额外压力反应的反应将是我实验室的研究生 John Leston，在同样是研究生的 ish Kova 和博士后研究员 Humana Druker 的帮助下。最后，Gus Ferguson 将演示图像可视化软件的使用。通过将几个盖玻片浸入 70% 乙醇中以对其进行消毒来开始此实验。

将盖玻片放在组织培养罩中的板边缘，让它们在层流下风干。盖玻片干燥后，在六个 3.5 厘米的盘子中各放一个。向每个培养皿中加入 2 毫升温热的完整 DMEM。

用镊子向下按压，以确保每个盖玻片都粘附在孔的底部。接下来，要从组织培养皿中分离 U 2 OS 细胞，请用 3 毫升 PBS 洗涤一次。然后加入 4 毫升温热的 0.05% 胰蛋白酶、1% EDTA，并在 37 摄氏度下孵育 7 分钟。

Resus 通过 7 分钟后，将细胞悬浮在 6 毫升温热的完整 DMEM 中，以灭活胰蛋白酶 EDTA。使用血细胞计数器对细胞进行计数，将含有盖玻片的 3.5 厘米培养皿中的每个培养皿接种，用 2 乘以 10 到第五个细胞。轻轻摇动培养皿以确保细胞分布均匀，在 37 摄氏度、21% 氧气、5% 二氧化碳下孵育过夜，以使细胞粘附。

第二天，从培养箱中取出 5 个培养皿。让剩下的盘子不受打扰。它将用作常氧阳性对照。

将其中四个培养皿放入缺氧工作站。将细胞暴露在缺氧条件下 75 分钟、90 分钟、2 小时和 24 小时。到另一道菜。

将肌动霉素 D 添加到培养基中至终浓度为 10 μg/mL，然后在正常氧气条件下将其放回 37 度培养箱中 4 小时。这道菜起常氧阴性对照的作用。在细胞孵育时，准备并收集以下试剂，为 click it 检测做准备。

点击式检测试剂盒 pH 值为 7.2 至 7.6 的 PBS、3.7% 多聚醛、PBS 溶液、1%Triton X 100、PBS 去离子水中的二甲基亚砜、10 摩尔氢氧化钠、37% 盐酸和 pH 指示条。您应该计划准备好开始标记的检测治疗不足的情况。缺氧治疗结束前一小时：为了标记细胞，从预热完全培养基中的 100 毫摩尔原液中制备 2 x EU 工作溶液。

接下来，向含有 acton mycin D 处理细胞的培养皿中的培养基中加入等体积的 2 XEU，从而将 EU 稀释至工作浓度。然后在缺氧室中，将 EU 原液添加到缺氧处理的细胞中。缺氧处理后，在处理细胞培养条件下孵育 1 小时，或对照细胞培养 4 小时后孵育。

用 PBS 洗涤每个培养皿一次，并在处理条件下加入 1 毫升 3.7% 多聚甲醛原液，在处理条件下孵育 15 分钟。固定后，从缺氧室中取出细胞并将其放入通风橱中。倒掉固定剂，注意负责任地处理对甲醛废物。

然后用 PBS 洗涤细胞一次。在室温下执行后续步骤，将所有溶液保存在 2 至 6 摄氏度的冰上。接下来渗透细胞，去除洗涤液，向每个细胞中加入 1 毫升 1% tritton X 100 的 PBS 溶液，在室温下孵育 15 分钟。

取出渗透缓冲液，用 PBS 洗涤每个孔一次。从细胞中取出洗涤液，并向每个样品中加入 500 μL 新鲜制备的 RNA 成像试剂盒反应混合物。保护细胞避光，并在室温下孵育 30 分钟。

孵育后，去除 RNA 成像试剂盒反应物、混合物并洗涤。一旦用 1 ml RNA 成像试剂盒反应、冲洗、缓冲，此时应进行任何其他抗体标记。要对 DNA 进行染色，请用 PBS 洗涤样品，然后将 herst 3、3、3、4、2 稀释至 1 至 1000。

在 PBS 中，向每个溶液中加入 1 毫升稀释的 HERC 溶液。避光并在室温下孵育 15 分钟。孵育后，取出 HERC 溶液并用 PBS 洗涤细胞两次以安装盖玻片。

将 10 微升封固剂放在标准显微镜的中心。将盖玻片单元的一面朝下滑动并放在封固剂的液滴上。避免产生气泡，因为这会掩盖后续的图像采集。

在盖玻片的周边涂抹透明指甲油，以将其固定在显微镜载玻片上。让清漆在室温下干燥 5 分钟。避光样品可在零下 20 摄氏度下储存。

安装后，使用能够进行荧光检测的宽视场显微镜获取图像。使用 40 V 1.30 NA 油浸镜头进行成像，并使用冷却的 CCD 相机图像捕获图像。图像采集后至少 30 个细胞。

使用图像处理软件来转移图像。这将通过对捕获的图像应用基于软件的数学公式来校正光学失真。结果是更清晰的图像，这将确保后续分析仅限于成像细胞。

接下来，将图像导入 Omer O 客户端。获取的所有图像的缩略图将显示在 Normalize the rendering settings for the same experiment 中所有图像的旁边。使用分析软件中的感兴趣区域 ROI 工具将对照常氧细胞的渲染设置应用于所有其他条件。

从软件中的每个图像中选择细胞核。选择强度分析选项并获得 30 至 50 个细胞的每个 ROI 的平均强度。保存数据，然后计算每个条件的平均值和标准值。

最后，使用数据绘图软件构建所有单个平均强度值的散点图，以反映每种条件下细胞之间的差异。以这种方式绘制强度数据很有用，因为它可以快速比较处理结果，并清楚地证明处理细胞群内的显著异质性，否则使用标准数据表示会掩盖这些异质性。或者，构建条形图以表示新生 RNA 的平均强度加上标准差，以定量确定总 RNA 合成然后处理和分析缺氧处理并在 5 al uridine 或 EU 存在下培养的 U2 OS 细胞。

如本视频所示，对每个处理群体中所有细胞的荧光强度进行平均和绘制。在此条形图中，使用学生的 T 检验计算每个治疗组与对照组显著不同的统计概率。有趣的是，这些数据表明，随着时间的推移，全球 RNA 合成在统计学上显著增加。

当 U2 OS 细胞如预期的那样用缺氧处理超过一个半小时时，ACTO 霉素 D 处理会完全消弱荧光强度。这些数据表明，经过较长时间的缺氧治疗后，细胞将精力集中在 RNA 的产生上，即使在这种恶劣的缺氧环境中也是如此。观看此视频后，您应该对如何在缺氧和常氧条件下在单细胞水平上标记和定量新生 RNA 有一个很好的了解，一旦掌握了该技术，就可以在手术后两小时内完成。

可以执行其他方法，例如与 RNA 聚合酶和 HIF 抗体的共染色，以确定 RNA 聚合酶水平是否改变以及 HIF 是否被激活。不要忘记，在执行此程序时，使用甲醛可能非常危险。始终确保戴上手套并在通风橱中工作。