缺氧后单细胞水平全局RNA合成分析

本实验的总体目标是通过定量成像分析，对在特定处理条件下产生的新生RNA进行荧光标记并定量。将培养在盖玻片上的细胞用烯烃修饰的碱基——即后续所述的5-乙炔基尿苷（5-EU）——处理，并在低氧条件下孵育。

孵育过程中，5-乙炔基尿苷（five EU）会在不干扰细胞转录机制的情况下被整合到RNA合成过程中。随后，通过铜催化的叠氮-炔环加成反应（即点击化学反应），将已整合的5-乙炔基尿苷进行荧光标记。利用荧光显微镜对标记后的新生RNA进行成像，并分析所得图像，以比较处理组与对照组条件下生成的RNA量。

对所得数据的统计分析显示了通过荧光显微镜定量五个 EU 掺入来检测缺氧条件下新生 RNA 生成的变化。该技术相较于现有方法（如定量 BCR）的主要优势在于，能够在单细胞水平上直接可视化细胞内的 RNA 生成。尽管本文中使用该方法研究细胞对低氧的响应，但它也可用于研究细胞对化疗药物的响应。

接下来，我们将展示应对额外应激反应的实验步骤，由本实验室的研究生 John Leston 演示，Ish Kova（同样为研究生）和 Humana Druker（博士后研究员）协助完成。最后，Gus Ferguson 将演示图像可视化软件的使用方法。实验开始时，将数个盖玻片浸入 70% 乙醇中以进行消毒。

将盖玻片放置在组织培养操作台内培养皿的边缘，在层流条件下使其自然风干。待盖玻片干燥后，将每片分别放入六个3.5厘米的培养皿中，每个培养皿中加入2 mL温热的完全DMEM培养基。

用镊子用力按压，确保每张盖玻片牢固贴附于孔板底部。接下来，用三毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，以使U2 OS细胞从组织培养皿上脱离。然后加入四毫升预热的0.05%胰蛋白酶和1%EDTA溶液，在37摄氏度下孵育七分钟。

七分钟后，加入六毫升预热的完全 DMEM 培养基重悬细胞，以中和胰蛋白酶 EDTA 的作用。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将每皿含有盖玻片的 3.5 厘米培养皿接种 2 × 10⁵ 个细胞。轻轻摇晃培养皿以确保细胞分布均匀，随后于 37°C、21% 氧气、5% 二氧化碳条件下培养过夜，使细胞贴壁。

第二天，从培养箱中取出五皿；剩余的一皿保持不动，作为常氧阳性对照。

将其中四个培养皿放入低氧工作站中，分别暴露于低氧条件下 75 分钟、90 分钟、2 小时和 24 小时。对另一个培养皿进行相应处理。

向培养基中加入放线菌素 D，使其终浓度为 10 微克/毫升，并将培养皿放回 37 摄氏度、正常氧条件的培养箱中孵育 4 小时。此培养皿作为常氧阴性对照。在细胞孵育的同时，准备并收集以下试剂，以备后续进行点击化学检测。

使用 pH 为 7.2 至 7.6 的 PBS 配制的 Click it 检测试剂盒，含 PBS 中的 3.7% 甲醛、PBS 中的 1% Triton X-100、去离子水、二甲基亚砜、10 摩尔氢氧化钠、37% 盐酸以及 pH 指示试纸。您应提前做好准备，以便在未经处理的条件下立即开始标记检测。在低氧处理结束前一小时，为标记细胞，需将 100 毫摩尔的 EU 储存液用预热的完全培养基稀释，制备成 2 倍工作液。

接下来，向含有放线菌素D处理细胞的培养皿中的培养基加入等体积的2 XEU，使EU稀释至工作浓度。然后在低氧舱内，将EU储备液加入经低氧处理的细胞中。低氧处理后，在相应的细胞培养条件下孵育1小时；对照组则孵育4小时。

用 PBS 每个培养皿冲洗一次，然后在处理条件下加入 1 毫升 3.7% 甲醛储备液，于处理条件下孵育 15 分钟。固定完成后，将细胞从低氧舱中取出并置于通风橱内。小心倾倒弃去固定液，并妥善处理甲醛废液。

然后用 PBS 洗涤细胞一次。后续步骤在室温下进行，所有溶液需置于 2 至 6 摄氏度的冰上保存。为了透化细胞，移除洗涤液后，每孔加入 1 毫升含 1% Triton X-100 的 PBS，室温孵育 15 分钟。

移除渗透缓冲液，每孔用 PBS 洗涤一次。吸去细胞中的洗涤液，每份样品加入 500 µL 新鲜配制的 RNA 成像试剂盒反应混合液。避光孵育，室温下孵育 30 分钟。

孵育结束后，去除RNA成像试剂盒的反应液、混合液和洗涤液。使用一毫升RNA成像试剂盒反应缓冲液清洗一次，此时应进行任何额外的抗体标记步骤。如需对DNA进行染色，先用PBS清洗样品，然后将赫斯特33342稀释至1:1000。

在 PBS 中，向每个样品中加入一毫升稀释后的 HERC 溶液。避光，室温孵育 15 分钟。孵育结束后，移除 HERC 溶液，并用 PBS 洗涤细胞两次，然后封片。

在标准显微镜载玻片的中央滴加10微升封片剂。将盖玻片细胞面朝下覆盖在封片剂液滴上，避免产生气泡，以免影响后续图像采集。

在盖玻片边缘涂抹透明指甲油，以将其固定在显微镜载玻片上。室温下静置五分钟，待指甲油完全干燥。避光保存的样品可置于负20摄氏度环境中储存。

封片后，使用具备荧光检测功能的宽场显微镜获取图像。采用40倍、1.30数值孔径的油浸物镜进行成像，并用冷却CCD相机采集图像。图像采集后，至少分析30个细胞。

使用图像处理软件对图像进行校正。通过将基于软件的数学公式应用于所采集的图像，可校正光学畸变。结果将获得更清晰的图像，从而确保后续分析仅限于成像的细胞。

接下来，将图像导入 Omer O 客户端。所有获取的图像缩略图将并列显示，以便对同一次实验中的所有图像进行渲染设置的归一化。使用分析软件中的感兴趣区域（ROI）工具，将对照常氧细胞的渲染设置应用到所有其他条件的图像上。

在软件中选择每张图像的细胞核。选择强度分析选项，获取每个 ROI 的 30 至 50 个细胞的平均强度。保存数据，然后计算每种条件的平均值和标准差。

最后，使用数据绘图软件绘制所有单个平均荧光强度值的散点图，以反映每种条件下细胞间的变异性。以这种方式绘制强度数据具有重要意义，因为它能够快速比较不同处理组的结果，并清晰展示处理组细胞群体中存在的显著异质性，而这种异质性在常规数据表示方法中往往被掩盖。或者，可构建柱状图来表示新生 RNA 的平均荧光强度及其标准差，以定量测定经缺氧处理并在存在5-乙炔基尿苷（EU）条件下培养的U2 OS细胞中的总RNA合成水平。

如本视频所示，对每种处理组中所有细胞的荧光强度取平均值并进行绘图。在该柱状图中，采用学生t检验来计算各处理组与对照组之间存在显著差异的统计学概率。有趣的是，这些数据表明，随着时间推移，全局RNA合成呈现统计学上显著的增加。

当U2 OS细胞在缺氧条件下处理超过一个半小时时，如预期一样，放线菌素D处理会完全消除荧光强度。这些数据表明，在较长时间的缺氧处理后，细胞会将其资源集中用于RNA的合成，即使在这一恶劣的缺氧环境中也是如此。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在单细胞水平上对缺氧和常氧条件下的新生RNA进行标记与定量。一旦熟练掌握，按照本方案可在两小时内完成该技术操作。

还可通过 RNA 聚合酶和 HIF-1 的抗体共染色等方法，检测 RNA 聚合酶水平是否发生变化以及 HIF 是否被激活。进行此操作时，请注意甲醛具有极高危险性，务必佩戴手套并在通风橱中操作。