Name: 使用琼脂糖凝胶为基础的微流体装置的评估神经干细胞的运动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-11T02:20:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学习使用琼脂糖凝胶微流控装置评估神经干细胞运动的方法。该技术通过建立表皮生长因子静态线性化学梯度，研究EGFR过表达对神经干细胞迁移能力的影响，为再生医学提供重要工具。

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本工作由纽约州科学、技术和学术研究办公室（NYSTAR）（以先进技术中心资助形式）以及纳米生物技术中心（NBTC）资助，NBTC 是美国国家科学基金会协议号为 ECS-9876771 的科学与技术中心（STC）项目，同时获得美国脑肿瘤协会和纽约医学院（JAB）的资助。

步骤
用纤连蛋白包被载玻片
在组装微流控装置之前，使用纤连蛋白对玻璃载片进行灭菌处理。在生物安全柜中对载片进行包被以保持无菌状态。将无菌的PDMS间隔层沿载片边缘对齐，并用永久性记号笔标记朝上的面。用移液器加入1 ml的 5 μg/ml 将纤连蛋白（Sigma）溶液加入PDMS垫片内，使其完全覆盖玻璃片表面。静置1小时后，用氮气彻底吹干。2 枪。载玻片可在4o用于后续实验。
组装设备
整个装置组装过程均在生物安全柜中以无菌条件进行，具体操作步骤如下：
<ol>
<li>用70%乙醇擦拭带有微通道图案的硅胶母版，再用N₂吹干以进行清洁2 枪。使用镊子在母版的浮雕特征周围放置一个高度为1 mm的无菌PDMS垫片。 </li>
<li>称取0.3 g琼脂糖粉末（Fisher Scientific）和10 ml CO₂-2-独立培养基（Invitrogen）置于50 ml烧杯中。用刮勺搅拌混合物，并在微波炉中高火加热20秒。若仍有未溶解的颗粒，再加热10秒，并旋转摇动热混合物以消除残留颗粒。随后依次以8秒和5秒的加热时间重复该过程。</li>
<li>迅速将琼脂糖溶液倒入由PDMS垫片包围的硅胶母模上，并立即用一片无菌玻璃盖片覆盖琼脂糖混合物。对盖片施加持续而轻柔的压力约2分钟，以确保琼脂糖凝胶形成的厚度与PDMS垫片一致，恒定为1 mm。 </li>
<li>琼脂糖凝胶制备完成后，将带有PDMS间隔层的图案化琼脂糖凝胶从硅胶母模上剥离，并转移至纤维连接蛋白包被的玻片上，使琼脂糖凝胶中的微通道面向玻片。使用16号注射器针头在微通道的储液区打孔，作为进样口和出样口。加入 500 μl CO的2-向载玻片上的图案化琼脂糖凝胶中加入独立培养基，以防止微通道干燥。</li>
<li>用70%乙醇清洗装置中使用的丙烯酸歧管，并用去离子水冲洗。将歧管上的孔与琼脂糖凝胶上打孔形成的微通道孔对齐。然后将歧管与凝胶、PDMS间隔层以及纤连蛋白包被的载玻片一同与装置的金属框架对齐。将螺丝插入装置中，并使用螺丝刀拧紧至有阻力为止，以确保装置不会过度紧固而导致琼脂糖中微通道发生形变。以顺时针顺序拧紧螺丝，以防止装置内部的凝胶发生位移。使用1 ml注射器检测装置是否存在泄漏或微通道堵塞。注射器连接一段Tygon管，管末端装有用于加样凝胶的移液枪头，用于注入CO2微通道中无渗漏。当注入入口的培养基仅从微通道的出口流出时，可认为微通道已成功形成。此时，装置已准备就绪，可供使用。 </li>
</ol>
在装置中准备并接种细胞
当细胞达到70%融合度（细胞密度约为100,000个细胞/ml）时，即可准备将细胞接种至装置中。
用两轮 DPBS（Invitrogen）洗涤细胞。加入 200 μl 胰蛋白酶-EDTA（Invitrogen）使细胞脱离。将细胞转移至含有 5 ml 含血清 M2 培养基的 15 ml 离心管中，以灭活胰蛋白酶。在 1000 RPM 条件下离心 5 分钟，收集细胞与培养基。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 5 ml DPBS 中。在相同条件下再次离心 DPBS 中的细胞。再次吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 500 μl 无 CO2 培养基中。
通过重力驱动流，将所得的细胞悬液接种至装置的中央微通道中。分别向中央微通道的入口和出口加入60 μl细胞悬液和20 μl不含CO2的培养基。在明场显微镜下观察中央微通道，检查细胞是否发生黏附。细胞通常在10分钟后开始黏附。当细胞以适当的密度黏附于通道底部后，用移液器吸出入口中的剩余细胞悬液以及出口中的培养基。在中央通道的入口和出口均加入60 μl不含CO2的培养基。在中央通道的入口和出口上方覆盖PDMS盖片，以减少中央通道中培养基的蒸发。
对装置中的细胞进行成像
在组装装置之前，将无菌蠕动泵管穿过显微镜（Olympus X81）的环境舱，并连接至蠕动泵（Watson-Marlow 205U/CA）。以4 RPM的流速用PBS冲洗管路。装置组装完成后，在15 ml离心管中，用不含CO2的培养基配制适当浓度的表皮生长因子（EGF）（Sigma）溶液。将EGF溶液涡旋混匀5秒，然后连接至管路。将标记有相应EGF浓度的管路连接至装置。EGF需约1小时扩散通过通道脊，形成稳定的化学浓度梯度。
使用成像软件 Slidebook 在一次实验运行中每隔 10 分钟采集一组图像，持续约 5 小时。通过编程控制 x-y 自动载物台，使得在每个时间点对同一中心通道内的两个子区域（每个区域面积为 400μm × 400μm）进行成像，并且总共对三个中心通道进行成像。不同中心通道中的细胞（通常一次实验中为三个）具有不同的 EGF 浓度，具体浓度已在管路上标注。
材料与设备
细胞系：C17.2 细胞是来源于出生后小鼠小脑外颗粒层的神经干细胞（NSCs）6, 7。利用该细胞系，我们通过逆转录病毒转染方法建立了另外两种稳定转染的小鼠干细胞系：（1）wtEGFR——过表达人野生型 EGFR；（2）ΔEGFR——一种组成性激活的 EGFR 突变体。为了便于检测，逆转录病毒载体携带一个包含目的基因的骨架序列，其后接有内部核糖体结合位点（IRES）和绿色荧光蛋白（GFP）基因。
细胞培养： 小鼠C17.2神经干细胞（NSCs）及其变异株在6孔板中使用M2培养基（DMEM（Invitrogen），含10%胎牛血清（FBS）（Invitrogen）、5%马血清（HS）（Invitrogen）和1%青霉素/链霉素（Invitrogen））进行培养。细胞置于37oC、80%空气和5% CO2条件下培养。
微流控装置：一种用于固定装置位置的塑料歧管、聚二甲基硅氧烷（PDMS）垫片和不锈钢框架。
成像
使用倒置荧光显微镜（Olympus IX-81）并结合增强型CCD相机（Orca，Hamamatsu）。微流控装置安装在自动化的x-y-z载物台上，载物台被封闭在环境培养舱内，维持37oC的温度。通常在同一芯片上有3-4个装置，通过自动化的x-y-z载物台在同一时间点进行成像。
维持流速
使用带有8个平行管路的蠕动泵（Watson-Marlow 205U/CA）自动维持所有汇流通道和源流通道中的流速。
 
<img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_6/674_Figure-01.jpg" alt="细胞运动分析、浓度与细胞类型散点图、显微镜追踪、生物学研究。" width="573" height="414" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1 三种NSC细胞株（亲本型、wtEGFR和DEGFR）在不同EGF浓度下的运动能力 所有轨迹均来自5小时影片的追踪结果（wtEGFR 100 ng/mL组为4小时），为便于比较，所有轨迹的起点均重新定位至(0,0)。
 
 <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_7/674_Figure-02.jpg" alt="荧光显微镜，细胞轨迹；EGFR信号通路；细胞追踪图；科学研究。" width="576" height="546" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2">
 图2 EGFR表达水平与运动性的相关性 (a) 含100 ng/ml EGF的微流控通道表面的wtEGF NSCs的两张图像。 左侧图像为荧光图像，右侧为透射明场图像。 比例尺为 100µm，以及 通道宽度为 400 µm. 细胞根据表达的GFP荧光强度被分为两个群体。 细胞 蓝色圆圈中的细胞较暗，因此EGFR表达水平较低；红色圆圈中的细胞较亮，因此EGFR表达水平较高。（b）低EGFR表达水平与高EGFR表达水平细胞的运动轨迹。这些轨迹来自一段持续四小时的录像.

<ol><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics%3A+in+search+of+a+killer+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics: in search of a killer application.</a> Nature Methods. 4, 665-670 (2007).</li>
<li>Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. ax, Archer, S. hivaun, Shuler, M. ichael L., Wu, M. ingming <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hydrogel-based+microfluidic+device+for+the+studies+of+directed+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Lab-on-a-chip%22%5BJournal%5D)">A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration.</a> Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).</li>
<li>Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+naturally+occurring+constitutively+active+variant+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+mouse+fibroblasts+increases+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility.</a> Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).</li>
<li>Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+duality+of+EGFR+signaling+and+neural+stem+cell+phenotype%3A+Cell+enhancer+or+cell+transformer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer.</a> Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).</li>
<li>Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repellents+for+Escherichia+coli+operate+neither+by+changing+membrane+fluidity+nor+by+being+sensed+by+periplasmic+receptors+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis.</a> J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).</li>
<li>Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+neural+cell+lines+can+engraft+and+participate+in+development+of+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum.</a> Cell. 68, 33-51 (1992).</li>
<li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).</li>
</ol>

图1显示了三种NSC细胞株的运动轨迹：亲本细胞、wtEGFR细胞和ΔEGFR细胞（对照）。每组轨迹数据均来自一段持续5小时的录像。对于亲本细胞，当EGF浓度约为10 ng/mL时，细胞运动性达到峰值；对于wtEGFR细胞，细胞运动性的峰值则转移至100 ng/mL或更高浓度；而对于ΔEGFR细胞，细胞运动性不依赖于EGF浓度，符合预期结果。

表达wtEGF且浓度为100 ng/ml的细胞运动性最强，其移动速度约为亲本细胞（含10 ng/ml EGF）的1.5倍。这表明：（1）EGFR的过表达可增强细胞运动性；（2）EGF配体-受体结合事件的数量对细胞运动性具有直接影响。ΔEGFR细胞系是一种组成型激活的EGFR突变体，该突变体出现在约60%的人类胶质母细胞瘤中。其胞外域发生截短，形成一种不依赖配体、持续激活的激酶。与配体激活的野生型EGFR（wtEGFR）相比，其自磷酸化强度较弱（约10%）4。这解释了为何在无EGF的情况下，ΔEGFR细胞的运动性略高于亲本细胞和wtEGFR细胞，且其运动性在不同EGF浓度下保持恒定。

<p class="...

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基 (DMEM) (1X)</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11971-025</td><td></td></tr><tr><td>CO2非依赖性培养基</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>18045-088</td><td>一种不含HEPES的专有培养基，适用于在大气条件下支持多种上皮细胞、成纤维细胞和淋巴样细胞系的生长，不含L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td>磷酸盐缓冲液，不含钙或镁</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 (Pen/Strep)</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>每毫升含10,000单位青霉素（碱基）和10,000 µg链霉素（碱基），使用青霉素G（钠盐）和硫酸链霉素溶于0.85%生理盐水中</td></tr><tr><td>FBS</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td>胎牛血清，经鉴定合格</td></tr><tr><td>马血清</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>16050-130</td><td>马血清，经EIA检测为阴性</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>来源于人血浆的纤连蛋白，亦称冷不溶性球蛋白</td></tr><tr><td>EGF</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td>来自小鼠下颌下腺的表皮生长因子，冻干粉</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-500</td><td></td></tr></tbody></table>

利用基于琼脂糖凝胶的微流控装置评估神经干细胞迁移能力

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

尽管微流控技术在大分子检测方面已达到新的成熟水平，但基于细胞的检测仍处于初级阶段1。这主要是由于使用传统微加工技术和材料难以构建出适合细胞生存且稳定的微环境。我们通过引入一种新型微加工材料——琼脂糖凝胶，作为微流控装置的基础材料，来解决这一问题。琼脂糖凝胶具有高度可塑性，并且允许气体和细胞存活所必需的营养物质透过，因此是细胞实验的理想材料。我们先前已证明，基于琼脂糖凝胶的装置在研究细菌和中性粒细胞迁移方面已取得成功2。在本报告中，一个约1 mm厚的琼脂糖凝胶膜上构建了三条平行的微流控通道。利用蠕动泵在两侧通道中持续灌注培养基或缓冲液，细胞则被保留在中间通道中以供观察。由于两侧通道中的营养物质和化学物质持续从侧边向中间通道扩散，因此可通过调节侧通道中的流动来轻松控制中间通道的化学环境。利用该装置，我们证明了在不同化学条件下均可方便地通过光学手段监测神经干细胞的运动，实验结果表明表皮生长因子受体（EGFR）的过表达可增强神经干细胞的运动能力。神经干细胞的运动能力是评估细胞侵袭性的重要生物标志物，因而也是肿瘤发生相关因子3。解析神经干细胞运动的潜在机制，将有助于深入理解神经发育障碍以及脑癌干细胞的侵袭过程。

我们利用一种新型的基于琼脂糖凝胶的微流控装置，证明了表皮生长因子受体（EGFR）的过表达可增强神经干细胞（NSCs）的迁移能力。该技术可轻松适用于其他哺乳动物细胞系统，特别是在细胞来源稀少（如人神经干细胞）且实验周期至关重要的情况下。

尽管微流控技术在大分子检测方面正趋于成熟，但基于细胞的检测仍处于初级阶段1。这……

大家好，我是 Kevin won，康奈尔大学生物流体实验室的一名工程学硕士研究生。今天我将介绍如何使用一种基于琼脂糖的微流控装置来研究表皮生长因子（EGF）对小鼠神经干细胞的影响。该装置基本上由三个微流控通道组成，每个通道宽150微米。将EGF泵入一侧通道，同时将缓冲液泵入另一侧通道，从而在中央通道形成稳定的线性化学浓度梯度。由于EGF能够轻易地穿过琼脂凝胶，神经干细胞被接种在中央通道中，并通过显微镜监测其迁移过程。因此，该装置主要由顶部的有机玻璃层构成，该层具有用于连接管路的所有进样口和出样口。其下方是一层琼脂凝胶膜，其中包含四个图案化装置。其周围由 PDMS 间隔层包围，以确保整个装置具有恒定的厚度。PDMS 与凝胶组装在经涂层处理的玻璃载片上，该涂层有助于细胞黏附于玻璃载片。此外，使用不锈钢板来安装整个装置，并用螺丝将装置像三明治一样固定在一起。野生型细胞系已通过逆转录病毒载体转染，以过表达野生型EGF受体；而Δ细胞系则被转染了一种突变型EGF受体，使其无需EGF配体即可持续激活。好的，我将首先介绍我们微流控装置的组装过程。首先，我将PDMS垫片放置在模具的硅微通道凸起结构周围。接下来，我将称取0.3克琼脂糖。然后，我将吸取10毫升不含CO2的培养基，并将其加入琼脂糖中。我将用移液器反复吹打，使琼脂粉与不含 CO2 的培养基充分混匀。现在我们可以进行微波加热了。如您所见，目前琼脂已经液化，但仍残留少量颗粒。我将尝试旋转以溶解颗粒并去除气泡。现在，我将熔化的琼脂糖倒入硅胶母版的浮雕结构上，然后取一片无菌的玻璃载玻片，将其覆盖在PDMS垫片上。我会以一定角度放置，以尽量将琼脂糖凝胶中的大部分气泡排出。然后施加压力，并持续施压直至琼脂外壳凝固。大约一到两分钟后，琼脂已经凝固。现在我将去除载玻片上多余的琼脂。下一步是轻轻取下玻片，该玻片可作为废弃物处理。现在，我将尝试将图案化的 Agros 轻柔地转移至先前已包被纤维连接蛋白的玻片上。我基本上使用这片无菌塑料膜来辅助将带有 PDMS 微间隔的图案化 Agros 拾起，并将 Agros 的通道面朝下转移至玻片上。现在芯片已牢固地固定在载玻片上，我将对各个储液区打孔，以便塑料流体板能够与微通道连通。我将使用小型金属打孔器进行打孔。现在我们已完成对装置的打孔操作。我将加入 500 µL 的 CO2 无关培养基，以防止微通道干燥，然后静置一到两分钟。好的，一到两分钟后，我会尽量排出多余的培养基，现在将图案化琼脂糖上打好的孔与亚克力板分流装置的进样口和出样口对齐。孔位对齐后，我将用力按压，以形成良好的密封。现在，我将亚克力歧管放置在不锈钢支架上，然后使用螺丝轻轻将装置夹紧固定。我非常小心，避免过度拧紧螺丝，因为这会压扁通道。我以顺时针方向依次拧入螺丝，以防止内部的Agros凝胶错位。我将抽取1毫升培养基，并使用该注射器测

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人干细胞来源的内皮细胞与GABA能神经元的迁移、趋化吸引及共培养实验

我们描述了一种在市售微流控装置中生成人类运动单位的方法，该方法通过共培养人诱导多能干细胞来源的运动神经元与人原代中血管母细胞来源的肌管细胞，从而形成功能性活跃的神经肌肉接头。...

在微流控装置中生成具有功能性神经肌肉接头的人类运动单元

本研究介绍了二维（2D）划痕伤口迁移实验和三维（3D）球状体出芽实验，以及相应的下游分析方法，包括RNA提取和免疫细胞化学，这些实验是研究血管生成的适宜方法 体外.

利用划痕伤口迁移实验和球体出芽实验在功能和分子水平上研究血管生成

本文介绍了一种用于定量评估细胞在颗粒状水凝胶内部及其界面处三维迁移的实验方案。...

量化细胞在颗粒状水凝胶生物材料内部及向其内部的三维迁移

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