利用基于琼脂糖凝胶的微流控装置评估神经干细胞迁移能力

大家好，我是凯文·温（Kevin Won），康奈尔大学生物流体实验室的一名工程学硕士研究生。今天我将介绍如何使用基于琼脂糖的微流控装置来研究表皮生长因子（EGF）对小鼠神经干细胞的影响。

该装置基本上由三个微流控通道组成，每个通道宽150微米。将EGF泵入一侧通道，同时将缓冲液泵入另一侧通道，从而在中央通道形成稳定的线性化学浓度梯度。

由于EGF能够轻易地在琼脂糖凝胶中扩散，因此将神经干细胞接种于中央通道，并通过显微镜监测其迁移过程。这些装置主要由顶部的有机玻璃层构成，该层设有所有用于连接管路的进样口和出样口；其下方是一层琼脂糖凝胶膜，其中包含四个图案化装置。

这由PDMS垫片包围，可确保整个装置的厚度保持恒定。PDMS和凝胶组装在涂有ect的玻片上，这有助于细胞黏附于玻片表面。

此外，使用不锈钢板来安装整个装置，并用螺丝将装置像三明治一样固定在一起。野生型细胞系已通过逆转录病毒载体转染，以过表达野生型EGF受体；而Δ细胞系则被转染了一种突变形式的EGF受体，使其能够在无需EGF配体的情况下持续激活。好的，接下来我将首先讲解我们微流控装置的组装过程。

首先，我将PDMS垫片放置在模具的硅微通道凸起结构周围。接下来，我将称取0.3克琼脂糖。然后，我将吸取10毫升不含CO2的培养基，并将其加入琼脂糖中。

我将用移液器反复吹打，使 aros 粉末与不含 CO2 的培养基充分混匀。现在我们准备进行微波加热。如您所见，目前 agros 已经液化，但仍残留少量颗粒。

我将尝试旋转以溶解颗粒并去除气泡。现在，我将熔化的琼脂糖倒入硅胶母版的浮雕结构上，然后取一片无菌的玻璃载片，将其覆盖在PDMS垫片上。我会以一定角度放置，以尽量将琼脂糖凝胶中的大部分气泡排出。

然后施加压力，并持续施压直至琼脂外壳凝固。大约一到两分钟后，琼脂已经凝固。现在我将去除载玻片上多余的琼脂。

下一步是轻轻取下玻片，该玻片可作为废弃物处理。现在，我将尝试将图案化的 Agros 轻柔地转移至先前已包被纤维连接蛋白的玻片上。我基本上会使用这片无菌塑料膜来辅助将带有 PDMS 微间隔的图案化 Agros 拾起，并将图案化 Agros 的通道面朝下转移至玻片上。

现在芯片已牢固地固定在载玻片上，我将对各个储液区打孔，以便塑料流体板能够与微通道连通。我将使用小型金属打孔器进行打孔。现在我们已完成对装置的打孔操作。

我将加入 500 微升的 CO2 无关培养基，以防止微通道干燥，然后静置一到两分钟。好的，一到两分钟后，我会尽量排出多余的培养基，现在将图案化琼脂糖上打好的孔与亚克力分流板的进样口和出样口对齐。孔对齐后，我将用力按压，以形成良好的密封。

现在，我将亚克力歧管放置在不锈钢支架上，然后使用螺丝轻轻将装置夹紧固定。我非常小心地避免过度拧紧螺丝，因为这会压扁通道。我以顺时针方向依次拧入螺丝，以防止内部的Agros胶体因错位而产生缝隙。我将抽取1毫升培养基，并使用该注射器测试装置。

如您所见，我正在向每个微通道中注入液体，并观察每个出口是否有液体流出。目前，我已将组装好的装置放入显微镜的环境培养室中。该环境培养室的温度维持在37摄氏度，以便使装置升温，为后续接种细胞做好准备。

如您所见，我已经将伞状泵管穿过装置。目前我正在用 PBS 冲洗管路，为接下来的实验做准备。现在我们将设置管路。

我将把遮阳泵的管路穿过已经打好孔的盖子。每根管路都有特定数量的刻痕，以便我识别管路的入口和出口。因此，带有四个刻痕的管路将用于接收每毫升10纳克的溶液。

EGF 溶液现在将连接到设备的管路上。我将根据每个设备上的凹槽数量将其连接到相应的设备上，以便与所吸取的溶液相对应。

现在我连接出口管路。我们使用透明的Tigon管路，以确保培养基确实流经出口管路，且通道内无堵塞。接下来，我将启动Parasol泵。

现在我将开始将细胞接种到中心通道的操作。首先，我会吸出传感器通道中多余的培养基。现在我将观察细胞。

细胞已悬浮于不含CO2的培养基中。我将60个细胞置于中心通道的入口处，将20微升液体置于出口处。期望细胞能通过重力驱动的流动实现沉降。

接下来，我将对另外两个敏感通道重复此操作，并在显微镜下观察，以确认细胞贴壁是否成功。目前，细胞已黏附于玻片表面，几分钟后将开始铺展并呈现出其特有的形态。今天，我们介绍了实际装置的组装、试剂的准备，以及我用于观察装置内细胞迁移的显微镜技术。

总之，我们希望该设备能在更广泛的领域得到应用，特别是在临床环境中。图一为水平方向，垂直方向显示了C17.2细胞在表皮生长因子（EGF）浓度递增条件下的运动轨迹。

该图显示了我们在相同 EGF 浓度条件下实验中所用 C17.2 细胞各种菌株的运动轨迹。亲本细胞数据显示，在 10 纳克/毫升 EGF 浓度梯度下，细胞运动性出现峰值，表明在更高 EGF 浓度下受体已被配体饱和。而野生型数据表明，在 100 纳克/毫升 EGF 浓度下，细胞运动性有所增加。

这表明受体在较高 EGF 浓度下不会达到饱和。这是合理的，因为这些细胞被设计为过表达 EGF 受体。最后，delta 细胞系的数据表明，细胞的运动性大致与 EGF 浓度无关。

这也是预料之中的，因为突变的EGF受体被设计为可在无需EGF存在的情况下被激活。